Post on 19-Oct-2020
transcript
72º Congreso Argentino de
Bioquímica
2017 Dra. Débora Natalia Marcone Investigadora Asistente CIC CONICET Unidad de Virología, CEMIC-CONICET
Familia Picornaviridae
Pequeños (∅ 30 nm)
Desnudos
Cápside icosaédrica, 4 proteínas
VP1: Externa. El MAYOR blanco de la Rta Inmune
Cañón: se une a los Rc celulares, blanco de antivirales
VP2/VP3: Externas. También contribuyen a la antigenicidad
VP4:Interna. Interactúa con el genoma
Genoma ARN (+) cadena simple (7,2 kb)
único marco abierto de lectura1 poliproteína origina todas las proteínas por clivaje enzimático
Poliproteína
Clivaje Alternativo
Proteínas Estructurales
Proteínas
No Estructurales
Período de incubación ∼2 días
Síntomas: 7-14 días
◦ Con o sin Fiebre
Virus más frecuente resfrío común
niños: hasta 12 infecciones/año
adultos: 3-5 infecciones/año
Circulación anual, con dos picos en otoño y primavera
Asociados a:
◦ IRA alta: resfrío, otitis, sinusitis
◦ IRA baja: bronquiolitis, neumonía
◦ Sibilancias recurrentes
◦ Exacerbaciones de asma, EPOC y Fibrosis Quística
Alto impacto económico: directo (uso de recursos médicos) e indirecto (ausentismo laboral y escolar)
Nuevo Impacto clínico incorporación de métodos moleculares para
diagnóstico y tipificación
2/3 50%
45%
25%
Niños 8-14 días
Adultos 7-13 días
RN pretérmino 30 días
Inmunocomprometidos 1-4 meses
Peltola V, et al. Clin Micro Infect. 2013. 19 (7) Loeffelholz MJ, et al. Pediatrics 2014. 134;1144
Kainulainen L, et al. J Allergy clin Immunol 2010. 126
RT-PCR y secuenciación permiten diferenciar consecutivas infecciones con distintos tipos de RV de una
infección prolongada causada por un único tipo de RV
Contacto directo
Fomites: inoculación en nariz, ojos
Aerosoles
IMPORTANTE
Lavado de MANOS
buenos hábitos de Higiene
Unión a la cápside: Pleconaril, Vapendavir, Pirodavir Tremacamra (ICAM-1 soluble)
Formulaciones: oral o spray intranasal
Inhibidor de 3C proteasa: Ruprintivir
Interferón alfa 2
Ninguno demostró ser completamente eficaz y libre de efectos adversos
Sept. 2016Vacunas 10, 25 y 50 valente de RV-A en ratones y monos
Inactivadas formalina, alta cc Ag
Diagnóstico:
◦ Cultivo: dificultoso, solo RV-A y B
◦ RT-PCR en tiempo real
basada en 5’NCR
Tipificación: RT-PCR y secuenciación
◦ VP1: asignación de genotipos y clasificación taxonómica
◦ VP4/VP2: epidemiología molecular y asignación de genotipos provisionales (pat)
◦ 5’NCR
Tipificación
(549 pb)
5’NCR
Detección
(207 pb) Taxonomía
(860 pb)
Combinación de método diagnóstico (5’NCR) y análisis de filogenia de una región codificante de la cápside
Género Enterovirus: 12 especies (7 humanas)
◦ Enterovirus A, B, C, D
◦ Rinovirus -A 80 genotipos
-B 32 genotipos
-C 55 genotipos
Basada en divergencia de Nt de secuencias de la cápside:
◦ VP1 RV-A y C: 13% RV-B: 12%
◦ VP4/VP2 RV-A y C: 10,5% RV-B: 9,5%
PAT (provisionally assigned types): basados en VP4/VP2(pendiente VP1/genoma completo)
◦ RV-A: pat 1-4 RV-B: pat1-4 RV-C: 11 pat
(Simmonds, 2010; McIntyre, 2013; Picornavirus Study Group)
Hospital Universitario CEMIC
UNVIR, CEMIC-CONICET
Realizar el diagnóstico de RV
Describir su frecuencia, estacionalidad, las coinfecciones y los cuadros clínicos asociados
Describir la epidemiología molecular de las cepas de RV circulantes
En:
I. niños menores de 6 años, internados o ambulatorios
II. recién nacidos pretérmino con patologías de base internados
III. adultos inmunocompetentes ambulatorios
con IRA alta y/o baja, en el Hospital Universitario CEMIC
876 Muestras Respiratorias con ficha epidemiológica
Procesamiento
Junio 2008 a Diciembre 2011
Inmunofluorescencia
Indirecta Directa
Extracción ARN viral (manual con columnas Qiagen)
RT-PCR en tiempo real (5’NCR de RV)
Análisis
Epidemiológico
Base de Datos
Distribución porcentual del diagnóstico de virus respiratorios
en 876 niños con IRA
IF
IF + RT-PCR
RSV: 23,6% hMPV: 7,3%
FluA: 3,3% PIV: 3,3% AdV: 2,9% FluB: 1,9%
HRV: 40,1%
RSV
hMPV
FluA PIV
AdV FluB
Negativos 58,7%
Positivos 41,3%
RSV
hMPV
FluA PIV AdV
FluB
HRV Negativos
26,6%
Positivos 73,4%
RSV
29,0%
hMPV
7,9%
FluA 2,9% PIV 1,7% AdV 3,3%
FluB
0,7%
HRV
45,8%
Negativos 20,0%
Positivos 80,0%
RSV
13,1%
hMPV 6,1%
FluA
4,0%
PIV 6,4%
AdV 2,0%
FluB
4,4%
HRV
29,0% Negativos
39,4%
Positivos 60,6%
Distribución porcentual de virus respiratorios Hospitalizados (n=579)
Ambulatorios (n=297)
Coinfecciones Duales 11 % HRV-RSV 58%, HRV-hMPV 19%,
HRV-AdV 11%, entre otras
Coinfecciones Duales 4,4 % HRV-RSV 23%, HRV-hMPV 23%,
HRV-PIV 23%, entre otras
1 1 1 1 1 1.43 1.85 2.21 1.72 2.77
3.35 3.22
5.58 5.90
3.67
24.1
10.1
14.3
8.48
12.4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Taquipnea Sibilancias Tiraje Bronquiolitis Hospitalización
Negativo HRV RSV HRV-RSV
OR 193.4 45.2 44.2
Coinfección RV-RSV: mayor riesgo asociado a gravedad y hospitalización
Marcone, Echavarria, et al (unpublished)
876 Muestras
Respiratorias
RT-PCR en
tiempo real
HRV
351 Muestras
RV positivas
45 RV positivas
seleccionadas
RT-PCR (5’NCR/VP4/VP2)
Secuenciación
Filogenia Reconstrucción
demográfica
BA
39
8H
M3
20
01
10
BA
41
3H
M3 1
5 0
3 1
0
BA
424H
L3 1
2 0
4 1
0B
A415H
L3 0
8 0
3 1
0
96
HR
V-A
29
8
BA
184H
L3 1
8 1
1 0
8B
A180H
M3 2
1 1
0 0
89
7
HR
V-A
18
BA
102A
20
04 0
9
BA
447H
L3
19 0
5 10
HRV-A
29
HRV-A
66
HRV-A41
HRV-A33
BA171A 28 09 09
HRV-A22
BA82A 12 09 08
HRV-A1B
HRV-A88
BA394HL3 13 01 10
97BA126HM3 25 08 08
BA50A 23 07 08BA6HM3 02 06 08
95
BA27A 14 07 08BA117HL3 12 08 08
BA69HM3 02 07 08
8491
78
BA231HM3 05 05 09
BA194HM3 12 02 09
BA94A 02 01 09
BA96A
20 03 09
HRV-A
101
BA
89A 24 11 08
88
HR
V-A
65
BA
22H
L3 1
1 0
6 0
8
BA
182H
M3 0
7 1
1 0
8
100
BA
203H
M3 1
6 0
3 0
9B
A218H
M3 1
7 0
4 0
9
98
BA
192H
L3 0
9 0
2 0
9B
A20
7H
L3
17
03 0
9
93
98
HR
V-C
6
80
HR
V-C
1
95
HR
V-C
7
BA
431H
M3 0
4 0
5 1
0
10
0
BA
99A
13 0
4 0
9
HR
V-C
32
89 73
HR
V-C
9
BA
145A
16 0
6 0
9H
RV
-C5
BA
320H
M3
22 0
9 09
99
BA30
3HL3
14
08 0
9HRV-C
20 100HRV-C
4
BA90A 03 1
2 08
100
BA120A 18 05 09
BA284HL3 10 07 09
99
HRV-C2
91
BA178A 13 11 09HRV-C23
BA67A 08 08 08
99
BA158A 13 08 09
BA12A 27 06 08
82
BA305HM3 17 08 09
BA176HL3 07 10 08
89
BA193A 04 03 10HRV-C8
78
89
99
96
BA270HM3 27 06 09
HRV-B5
HRV-B27
HRV-B86
HRV-B
6
HRV-B
14
96
100
HEV-C
HE
V-B
HE
V-A
BA
188H
L3 2
6 1
2 0
8
HE
V-D
78
71
0.5
Se detectaron las 3 especies:
55% RV-A (n=24)
43% RV-C (n=19)
2% RV-B (n=1)
Análisis de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ). Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran valores superiores a 70%
Árboles de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ) y de referencia de HRV-A, B y C. Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran aquellos valores superiores a 70%.
A4
A1A2
A3
A5
HRV-A39BA171A 28 09 09
HRV-A64HRV-A94
HRV-A15HRV-A74
HRV-A22HRV-A82
HRV-A81HRV-A16
BA82A 12 09 08HRV-A56
HRV-A40HRV-A85
HRV-A1HRV-A1B
HRV-A54HRV-A98
HRV-A63HRV-A59
BA447HL3 19 05 10HRV-A43HRV-A75
HRV-A50HRV-A34HRV-A18
HRV-A76HRV-A33
HRV-A11HRV-A24
HRV-A90HRV-A9
HRV-A32HRV-A67
BA184HL3 18 11 08HRV-A55BA180HM3 21 10 08
HRV-A57HRV-A96
HRV-A61HRV-A73
HRV-A13HRV-A41
HRV-A21HRV-A60
BA102A 20 04 09HRV-A19HRV-A38
HRV-A23HRV-A30
HRV-A2HRV-A49
BA415HL3 15 03 10BA413HM3 08 03 10BA424HL3 12 04 10BA398HM3 20 01 10
HRV-A29HRV-A44
HRV-A25HRV-A62
HRV-A31HRV-A47
HRV-A66HRV-A77HRV-A10HRV-A100
HRV-A7HRV-A88
HRV-A58BA394HL3 13 01 10
HRV-A36HRV-A89
HRV-A8HRV-A95
HRV-A45BA126HM3 25 08 08
BA117HL3 12 08 08BA69HM3 02 07 08BA27A 14 07 08
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HRV-A12BA231HM3 05 05 09
HRV-A20HRV-A68
HRV-A28HRV-A53
BA96A 20 03 09BA94A 02 01 09BA194HM3 12 02 09
HRV-A101BA89A 24 11 08
HRV-A65HRV-A51
HRV-A71BA22HL3 11 06 08
HRV-A46BA182HM3 07 11 08
HRV-A80
100
75
9184
90
97
87
94
70
97
83
100
9998
84
99
99
72
97
9778
93
90
97
8993
8690
8973
86
92
92
70
96
80
0.5
HRV-B3
HRV-B37
HRV-B6
HRV-B14
HRV-B72
HRV-B86
HRV-B35
HRV-B79
HRV-B83
HRV-B92
HRV-B52
HRV-B48
HRV-B69
270HM3 27 06 09
HRV-B17
HRV-B70
HRV-B91
HRV-B4
HRV-B42
HRV-B5
HRV-B26
HRV-B99
HRV-B97
HRV-B84
HRV-B27
HRV-B93
7273
93
7194
79
84
84
0.5
C1
C2
BA192HL3 09 02 09BA207HL3 17 03 09
HRV-C10BA203HM3 16 03 09BA218HM3 17 04 09
HRV-C3HRV-C6
HRV-C1HRV-Cpat14HRV-Cpat16
HRV-C22HRV-C43
HRV-C21HRV-C7
BA431HM3 04 05 10HRV-C13
BA99A 13 04 09HRV-C32
HRV-C39HRV-C12
BA305HM3 17 08 09HRV-C44
BA176HL3 07 10 08HRV-C42HRV-C8
HRV-Cpat28HRV-C16
HRV-C17HRV-C31
BA193A 04 03 10HRV-C28
HRV-Cpat24HRV-C18HRV-Cpat27
HRV-C25BA178A 13 11 09
HRV-C24HRV-C19
HRV-C41BA12A 27 06 08
HRV-Cpat20HRV-C30HRV-C15
BA158A 13 08 09HRV-C23
BA67A 08 08 08BA120A 18 05 09BA284HL3 10 07 09
HRV-C40HRV-C2
HRV-C47HRV-C35
HRV-Cpat18HRV-Cpat19
HRV-C33HRV-C48
HRV-C14HRV-Cpat22HRV-C4
BA90A 03 12 08HRV-C49
HRV-C20HRV-C34
HRV-C45BA303HL3 14 08 09
HRV-Cpat17HRV-C29
HRV-C27HRV-C11
BA320HM3 22 09 09HRV-C5
HRV-C38HRV-C50
HRV-C46HRV-Cpat10
HRV-C36HRV-Cpat21
HRV-C26HRV-Cpat15
HRV-C37BA145A 16 06 09
HRV-C9
9980
91
99
79
9598
99
9186
85
99
7371
72
99
99
9278
98
99
99
9975
74
9992
8582
98
96
99
94
98
96
90
99
84
87
0.5
Para las 3 especies de RV se obtuvieron topologías similares con los 4 métodos de filogenia: RV-A: 14 genotipos (5 más frecuentes)
RV-B: 1 genotipo
RV-C: 15 genotipos (2 más frecuentes)
Distancia-p (entre clados A1 y A2)= 12,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos
divergen en más del 10,5% (McIntyre y col, 2013)
Clado A2: Posible nuevo genotipo de RV-A
Análisis de recombinación: Simplot, Chimera, Bootscan
Grupos: A2, 78, 12 (ancestro común con A2 y 78 por bayesianos) y 20 (outgroup)
no se encontraron eventos de recombinación
en los 420 nt correspondientes a VP4/VP2
Para realizar la confirmación es necesario amplificar y secuenciar VP1/ genoma completo
Perfiles demográficos bayesianos para la región VP4/VP2 de HRV-A y C
*Perfil de dinámica poblacional Constante
*Tasa de sustitución estimada elevada [2,3.10-2 s/s/a]
*Perfil de dinámica poblacional Constante
*Tasa de sustitución estimada elevada [1,9.10-2 s/s/a]
Las altas tasas estarían reflejando la dinámica de recambio de los distintos genotipos de rinovirus en el tiempo, y no las tasas de mutación de las dos especies, ya que se están analizando genomas de distintos
linajes realizar estudio de un genotipo particular.
HRV-A HRV-C p
(n=16) (n=10)
n (%) n (%)
Hospitalizados ≤ 3 días 7 (43,8) 5 (50,0) 0,688
Hospitalizados > 3 días 9 (56,3) 5 (50,0)
Requerimiento de Oxígeno 13 (81,3) 9 (90,0) 0,280
Requerimiento de cuidados intensivos 3 (18,8) 2 (20,0) 0,999
Asistencia Respiratoria Mecánica 2 (12,5) 1 (10,0) 0,999
Comparación de la evolución clínica de niños hospitalizados con HRV-A o C
No existen diferencias significativas en la evolución de la internación entre los niños con HRV-A o C
Tampoco existen diferencias significativas entre los antecedentes y la clínica de los niños con HRV-A o C
Distribución estacional de las 3 especies de RV y los 7 clados detectados
Circulación simultánea de clados y cepas de RV de distintos genotipos de las 3 especies, principalmente A y C. Los clados mostraron un patrón de
circulación estacional, donde un genotipo parece reemplazar a otro
RV es el virus mas frecuente en niños con IRA
Circulación anual, con picos otoño y primavera
Mayor gravedad en coinfección con RSV
Predomino de RV-A y C, con alto número de genotipos co-circulando
No se observó asociación de genotipos con mayor gravedad
6 pretérmino que desarrollaron IRA
RV único agente etiológico detectado
Filogenia: ◦ Junio/Julio 2014 RV-C43 (1 caso)
RV-C1 (2 casos camas contiguas)
◦ Agosto/Septiembre 2014 RV-A pat (2 casos)
RV-C6 (1 caso)
Distancia-p: entre RV-A pat y referencia A63 10,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos divergen en
más del 10,5% (McIntyre y col, 2013)
Posible nuevo genotipo de RV-A
dd/mm/yyyy
SL (27 SEG)
DBP, ductus
PL (27 SEG)
DBP, ductus
CM (30 SEG)
DBP
HR (29 SEG)
IT (36 SEG)
Trisomía 18
BP (28 SEG)
Ductus, síndrome Distress respiratorio
C43 C43 C43 -
A pat
A pat
A pat
A pat
C1 C1 C1 C1 C1 C1 -
Invierno Primavera
C6 C6
- C1 -
A75 -
- A103
- A pat
A pat
RV causan IRA baja grave en RN pretérmino con patologías de base
Período de positividad: 7 a 28 días
Sucesivas infecciones por distintos genotipos
Co-circulación de diferentes genotipos en UTIN
Posible nuevo genotipo de RV-A
Se confirmó la transmisión nosocomial en dos episodios diferentes
Marcone, Echavarria, et al (unpublished)
Adultos inmunocompetentes con IRA que concurrieron a Emergencias CEMIC (Abril-Septiembre 2016)
30/112 RV positivos = 27% 23/30 (77%) único agente por Panel Respiratorio- FilmArray, Biofire
Flu-A 20%, hCoV 11%, RSV 9%, hMPV 6%, PIV 4%, AdV 3%, FluB 2%
Diagnósticos clínicos :
◦ CVAS 7%
◦ Sme gripal 53%
◦ Laringotraqueítis 7%
◦ Bronquitis 27%
◦ Neumonía 3%
Cepas de RV aún no tipificadas
Los RV son los virus más frecuentes en niños y adultos con IRA
Gran diversidad genética y co-circulación de genotipos
En coinfección con RSV pueden asociarse a cuadros de mayor gravedad
Importancia de nuestro estudio: Incorporación del Diagnóstico de RV en la rutina del Hospital CEMIC desde 2012 para los pacientes internados
Epidemiología molecular de RV: ◦ Conocer las cepas circulantes en distintas
poblaciones de la Ciudad de Buenos Aires:
niños
recién nacidos con patologías de base
adultos
◦ Describir nuevos genotipos que aparecen en circulación
Este conocimiento puede contribuir a la formulación de futuras vacunas para RV
Unidad de Virología, Laboratorio de Virología y Departamento de Pediatría
Hospital Universitario CEMIC y Mater Dei
Proyecto IRAB - PICT 2006.650
A todos los médicos, bioquímicos, kinesiólogos, enfermeras y personal técnico, por reclutar pacientes, obtención de datos clínicos, de muestras respiratorias y su procesamiento.