Post on 20-Apr-2018
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Actualización en nuevas
técnicas de diagnóstico
genético molecular
disponibles en Chile
Dra. Teresa Aravena
Clínica INDISA
Hospital Clínico de la Universidad de Chile
Hospital Dr. Sótero del Río
Exámenes genéticos
• Indicaciones específicas.
• Consecuencias en la familia.
• Consideraciones sobres los efectos del
resultado.
• Consentimiento informado.
• Beneficios en el manejo del paciente
prevención de complicaciones.
• Beneficios para la familia: opciones
reproductivas.
Cariotipo normal
Metafase
Certificación de síndromes
cromosómicos clásicos:
Trisomía 21
Consideraciones sobre el
cariograma
• Sólo permiten diagnosticar anomalías cromosómicas.
• Anomalías estructurales pueden requerir de estudios adicionales.
• Demora en resultados por necesidades del cultivo.
• Fallas del cultivo.
• Convencional: detecta anormalidades en los cromosomas de 5Mb
• Alta resolución: (700-850 bandas), detecta hasta 3Mb.
Hibridación in situ con fluorescencia FISH
Ventajas : 1)puede realizarse en núcleos interfásicos 2)permite un diagnóstico preciso y rápido Limitaciones : 1)pueden no diagnosticarse alteraciones cromosómicas adicionales 2)se requiere tener una noción de las regiones cromosómicas comprometidas
XX
XY
Cromosomas Sexuales
Síndrome Di George/VCF
22q11.2 TUPLE 1 Orange
22q13 ARSA Green
Normal Deletado
• Segundos en frecuencia después
del Síndrome de Down
• FISH, aumenta sensibilidad.
Deleciones crípticas no detectados
por cariograma habitual
• Otros de mayor tamaño, en
general producen síndromes
característicos como por ej: cri-du-
chat
• 7,4% de niños con RM moderado
a severo, con cariograma normal.
• 0,5% de los RM menores
• Puede haber variaciones
familiares benignas, aunque poco
frecuentes
FISH para rearreglos subteloméricos
MLPA: Amplificación de múltiples sondas ligadas
• Método de cuantificación relativa de número de
copias de ADN.
• Aplicaciones:
Identificación de aneupoidías (monosomías,
trisomías, etc).
Detección de deleciones y duplicaciones en uno y
varios exones.
Cambios en el patrón de Metilaciones.
Identificación de SNPs.
Variaciones de expresión génica en cáncer.
características
• Puede detectar aberraciones en el número de copias
de 40 secuencias de ADN en una única reacción
basada en PCR.
• Requiere de un mínimo de 20ng de muestra de ADN.
• Discrimina secuencias que difieren en un nucleótido.
• MLPA puede usarse en muestras con ADN
parcialmente degradado, como tejido fijados en
parafina o formalina.
MLPA: Amplificación de múltiples sondas ligadas
•Cada sonda de MLPA está compuesta por
un par de oligonucleotidos
•Si cada sonda se encuentra con su secuencia
blanco en la muestra los oligonucleotidos
hibridan uno al lado del otro
•Cada sonda hibridada luego se conecta
ligándola
•Las sondas ligadas son amplificadas todas
en un PCR múltiple con solo un par de
primer
•Cada sonda genera un único producto
de amplificación de tamaño determinado
entre 130-490 nt
•Los productos amplificados son luego
analizados por electroforesis capilar
Ventajas
• Puede identificar el número de copias de mas de 40 secuencias de ADN en una única reacción.
• Técnica rápida y económica.
• Alto rendimiento.
• Reproducible y fácil de realizar.
• Alta sensibilidad.
• Sólo requiere de un termociclador y un equipo de electroforesis capilar.
• Identifica secuencias que presentan un cambio de un sólo nucleótido (SNP).
• Requiere poca cantidad de ADN.
limitaciones
• Reacciones de MLPA son más sensibles a
contaminantes.
• No se puede realizar en una única célula, se
requieren de al menos 3000 células.
• No pude detectar translocaciones balanceadas.
• Limitación en la disponibilidad de Sondas (kit
comerciales).
PCR: Reacción en cadena de polimerasa
PCR: reacción en cadena de
polimerasa
• Amplifica el DNA varios millones de veces en pocas horas.
• Permite el análisis de un gen de secuencia única.
• Permite estudiar incluso el ADN de una célula única.
• No requiere conocer la secuencia del gen a estudiar.
• Requiere conocer la secuencia del DNA que flanquea a la zona en estudio.
Estudios moleculares
disponibles en Chile
• Secuencias del Y • Duchenne y Becker • BRCA 1 y 2 • Metilación Prader Willi y
Angelman • Xq frágil • MTHFR • McCune Albright • Atrofia muscular espinal
tipo I • acondroplasia e
hipoacondroplasia
• 21 hidroxilasa • fibrosis quística • Hemofilia • HIV • HLA • alpha 1 anti-tripsina • Hemocromatosis • Conexina 26 y 30 • Mala absorción de lactosa • translocaciones en
cánceres hematológicos.
Microarray
Microarray
• Una de las técnicas más usadas en biología molecular.
• Permite observar en forma simultánea el genoma completo o genes de interés en relación con una patología.
• Permite comparar el DNA de células sanas con el DNA del paciente.
• Permite comparar DNA con mutaciones conocidas con el DNA del paciente
Microarray de hibridación genómica
comparada (aCGH)
Permite al clínico e investigador testear hipótesis a nivel
genómico a una resolución nunca antes vista.
Disponible en Chile, alto costo.
Microarray: aumenta la tasa de diagnóstico
a 15-20%
Cariograma: Tasa de diagnóstico 3.7-9.5%
CGH MICROARRAYS
Síndromes de microduplicación /
microdeleción emergentes
• Síndrome de
microdeleción 1p36, se
detecta con FISH
subtelomérico o con
a-CGH
• Síndrome de
microdeleción 2q23.1
• Síndrome de
microdeleción 2q37
• Síndrome de
microduplicación7q11.3
• Síndrome de
microdeleción 15q13.3
• Síndrome de
microdeleción16p11.2
• Síndrome de deleción
17q21.31
• Microduplicación22q11.2
Del ADN a la proteína
Estructura del gen: promotores, potenciadores, silenciadores.
coactivador
Promotor mínimo Promotor proximal
Factores de transcripción específicos
Factores de transcripción específicos
Unidad transcripcional
Genome wide associaton study:
Secuenciación masiva
Genome wide associaton study:
Secuenciación masiva
• Analiza asociación entre genes y patologías
específicas o factores de riesgo.
• Confirmación del diagnóstico
• Información sobre el riesgo de enfermar
• Programas de prevención individual de
complicaciones
• Selección de tratamiento específicos, evitar
efectos adversos
Técnicas de captura del ADN
Sobreposición de segmentos
secuenciados
Disponibles en Chile
• PANELES
Síndromes de Cánceres Hereditarios, Cáncer de Colon
Hereditario, Cánceres Hereditarios de las Mujeres,
Ciliopatías, Síndrome de Noonan y trastornos relacionados
• GENES
Genes con utilidad clínica conocida, selecciona un gen o
varios o todos.
Incluye exones codificantes, + 10 pares de bases de
secuencias de intrones adyacentes y secuencias no
codificantes con variantes patológicas conocidas.
Limitaciones
• Capaz de identificar aquellas variantes
que se encuentran en la región de
codificación de los genes.
• Queda 99% del genoma humano que
no está cubierto usando secuenciación
exoma.
• Gran cantidad de datos generados
Gracias!