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“Aspectos metrológicos asociados con la técnica de PCR: Consideraciones para su
aplicación en análisis de muestras clínicas y de alimentos"
Dr. BQ. Esteban Paredes-Osses
Instituto de Salud Pública
Día Mundial de la Metrología 2021“Metrología para la Salud”
Conventional qPCR is made more complicated by a number of factors that can create additional uncertainties and inaccuraciesin the process of quantification. Among the most important is that the results are highly sensitive to small changes inamplification efficiency; for example, over 20 amplification cycles, a 2% difference in amplification efficiency betweenreference materials and test sample results in up to 50% change in the estimated amount of DNA.
PCR digital
• La técnica dPCR se basa en el concepto de dilucioneslimitantes.
• La partición de la muestra: micropocillos, emulsión deaceite y matrices de cámaras miniaturizadas consuperficies de unión de ácido nucleico.
• Distribución de Poisson• Divisiones o particiones se clasifican como positivas
(objetivo detectado) o negativas (no detectado
objetivo).
• Un método absoluto de cuantificación y difiere
significativamente de la qPCR convencional.
where Nλ represents the total number of target copies, N is the number of partitionspresent, and x is the number of positively classified partitions.
PCR digital
dMIQE Group, Huggett JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clin Chem. 2020 Aug 1;66(8):1012-1029. doi: 10.1093/clinchem/hvaa125. Erratum in: Clin Chem. 2020 Nov 1;66(11):1464. PMID: 32746458.
¿Problemas en PCR?
• Degradación o presencia de impurezas del material genético.
• Mal diseño de experimento con poca eficiencia en la amplificación yespecificidad de partidores.
• Calibración
• Curvas estándar
• Normalización y procesamiento de datos
Controles
• Negativos: Blanco (NTC) y específico.
• Positivos: Cualitativo-Cuantitativo y Control Interno.
Diseño
• Selección del amplicón (menor a 250pb)
• Diseño de sondas y primers
• Evaluación in silico de la especificidad (base de datos).
• Contaminación ADN/ARN
Optimización
• Señal de fluorescencia:
• Temperatura de alineamiento
• Número de ciclos de PCR
• Concentración de primers y sonda
• Resolución (PCR digital)
• Especificidad
Validación PCR
• Precisión
• LOQ
• LOD
• Linealidad
• Veracidad
• Robustez
• qPCR: repetitividad y reproducibilidad
• dPCR: precisión en rango
Trazabilidad y comparabilidad de la medición de la cuantificación de ácidos nucleicos
• Trazabilidad metrológica
• Uso de materiales de referencia
• Calibración instrumentos
“Aspectos metrológicos asociados con la técnica de PCR: Consideraciones para su
aplicación en análisis de muestras clínicas y de alimentos"
Dr. BQ. Esteban Paredes-Osses
Instituto de Salud Pública
Día Mundial de la Metrología 2021“Metrología para la Salud”
Diagrama Causa y efecto. Contribuciones de incertidumbredel proceso completo para procedimiento de mediciónmediante qPCR.