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LGN0232 – Genética molecular
Maria Carolina QuecineDepartamento de Genética
mquecine@usp.br
Aula Prática
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Suspensão de células competentes
+Moléculas de DNA
recombinante
= Incubar 30 min no gelo
Choque térmico (42°C/90 s)
CHOQUE TERMICO
I. Transformação bacteriana (Escherichia coli) por choque térmico e seleção de clones
transformantes
1. Descongelar no gelo o microtubo com as células competentes de E. coli DH5α;
2. Ligar banho-maria e deixar meio LB aquecendo a 42ºC;
3. No gelo, adicionar aos 40 μL das células competentes 1 a 2 μL de DNA do plasmídeo.
Homogeneizar a mistura e incubar por 90 segundos à 42 oC;
4. Transferir o microtubo para o gelo por 3 - 5 minutos
5. Remover o microtubo e adicionar 300 μL de meio LB. Rapidamente, mas com cuidado,
ressupenda as células com pipeta.
6. Transferir as células para um microtubo e incubar a 37 ºC por 1 hora sob agitação (180 rpm)
7. Plaquear 100 μL da suspensão de células em meio LB contendo kanamicina (usar
10 µL de uma concentração 100 mg/mL). Incubar por toda a noite (overnight) a 37oC, com
placas invertidas.
II. Aula prática – Transformação bacteriana (Escherichia coli) por eletroporação e
seleção de clones transformantes
1. Descongelar no gelo o microtubo com as células competentes de E. coli DH5. Para
cada amostra, colocar uma cubeta no gelo;
2. Ligar banho-maria e deixar meio LB aquecendo a 37ºC;
3. No gelo, adicionar aos 40 L das células competentes 1 a 2 L de DNA do plasmídio.
Homogeneizar a mistura e incubar no gelo por cerca de 1 minuto;
4. Transferir a mistura de células e DNA para a cubeta resfriada e fazer a suspensão
alcançar o fundo da cubeta. Colocar a cubeta na câmara de eletroporação. Empurrar
a cubeta até encaixar entre os eletrodos. Pulsar apenas uma vez.
5. Remover a cubeta da câmara de eletroporação e adicionar mL de meio LB pré-
amornado a 37 ºC. Rapidamente, mas com cuidado, ressupenda as células com pipeta.
6. Transferir as células para um microtubo e incubar a 37 ºC por 1 hora sob agitação
(180 rpm).
II. Transformação bacteriana (Escherichia coli) por eletroporação e seleção de
clones transformantes
Gene lacZ = codifica a enzima β-galactosidase
SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES
Produção da enzima β-galactosidase
X-gal é clivado = colônia azul
Não há produção da enzima β-galactosidase
X-gal não é clivado = colônia brancaÁgar + ampicilina + X-gal
Sítio múltiplo de clonagem
pUC8Vieira & Messing,
1982
Gene de resistência à ampicilina
Agrobacterium
• Bactéria do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta;
• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA para as células da planta;
Bombardeamento
• Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido);
• As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da célula;
• Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o uso de Agrobacterium - em monocotiledôneas.
MÉTODOS PARA A INTRODUÇÃO DO TRANSGENE NA PLANTA
Transformação Genética de Arabidopsis
Arabidopsis thaliana Pequeno porte
Ciclo de vida curto
Elevado número de sementes
Genoma pequeno e sequenciado
Diversidade de mutantes (estudo de
genômica funcional)
Fonte: http://www-ijpb.versailles.inra.fr/ en/arabido/arabido.htm
Planta Modelo
Tipos de transformação
Explantes de raízes (Valvekens et al., 1988)
Infiltração a vácuo (Bechtold et al. 1993)
Floral-dip (Clough & Bent, 1998)
Vantagens do Floral-dip
Método simples e rápido
Sem variação somaclonal
Dispensa uso de condições estéreis
Transformação genética de Arabidopsis thaliana pelo método Floral-dip
Clough & Bent (1998), The Plant Journal 16:735-743
1. Crescer Agrobacterium tumefaciens em meio líquido contendo antibiótico de
seleção até a fase estacionária de crescimento (OD600 = 0,8-1,0)
2. Centrifugar cultura de A. tumefaciens por 5 min a 4000 rpm
3. Descartar sobrenadante e ressuspender pellet em solução contendo 5%
sacarose e 0,02% Silwet L-77 (surfactante)
4. Mergulhar flores em estágio inicial de desenvolvimento na suspensão de A.
tumefaciens
5. Manter plantas no escuro em câmara úmida por 24 h e repetir todo
procedimento após 7 dias
Crescer material vegetal
Preparar suspensão de Agrobacterium
Agrobacterium em
LB sólido Agrobacterium em
LB líquido
Centrifugar
Agrobacterium
Ressuspender
péllet
5% sacarose
0,02% Silwet L-77
Fonte: https://blog.addgene.org/tips-for-arabidopsis-transformation
Mergulhar flores em
suspensão de AgrobacteriumRemover síliquas
Método de Transformação Floral-dip
Câmara úmida e
escuro por 24h
Columbia em MS + higromicina
homozigota _/_ heterozigota R/_
homozigota _/_
heterozigota R/_
homozigota R/Rhomozigota R/R
Germinação de sementes T3 em meio de cultura seletivo
Confirmação de transformação genética pelo sistema GUS
GUS report system in rice. a : Control callus. b and c : Transgenic calli. d , e , and f Transgenic plantlets. g , h , and i : Transgenic plant, leaves, and roots
Kaikavoosi et al., 2015. Applied Biochemistry and Biotechnology, 177, DOI 10.1007/s12010-015-1827-4.
Solanum lycopersicum
Justificativas do uso na pesquisa
Pequeno porte
Ciclo de vida curto
Elevado número de sementes
Genoma conhecido
Diversidade de mutantes (estudo
de genômica funcional)
Protocolo de transformação
genética já estabelecido
Transformação genética de tomateiro
MT
Transformação genética de tomateiro
Cultura bacteriana crescida overnight a 28ºC
Centrifugação
Ressuspendida em meio MS Suspensão bacteriana
OD600 = 0,2-0,3
+Acetoseringona Explantes cotiledonares
Co-cultivo2 dias25ºC
Meio MS com antibióticos para seleção
Formação de gemas
adventícias
Formação de raízes
Plantas aclimatizadas
Selecionadas com aplicação de kanamicina Plantas resistentes a seleção serão
analisadas por testes moleculares de confirmação de introgressão transgênica
e inoculadas com o patógeno
RESULTADOS PRELIMINARES Transformação genética de tomateiro
D E
A B C
Controle MT MT MT-Rg1
MT MT-Rg1
Meio de regeneração
Meio de enraizamento
RESULTADOS PRELIMINARES Transformação genética de tomateiro
MT MT-Rg1
Casa-de-vegetação
Auto-fecundadas e produzirão sementes T1
Sementes T1 serão germinadas e as plântulas serão selecionadas com aplicação de kanamicina, para
posterior inoculação com o patógeno