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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
PROYECTO FODECYT No. 088-2006
“DETECCIÓN DE VIRUS COMUNES EN CRISANTEMO UTILIZANDO
PRUEBAS ELISA EN SAN JUAN Y SAN PEDRO SACATEPÉQUEZ,
GUATEMALA”
SARA BARRIOS
Investigador Principal
GUATEMALA, 31 ENERO DE 2008
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EQUIPO DE INVESTIGACIÓN
Lcda. Sara Barrios- Investigador Principal
Lcda. Margarita Palmieri- Investigador Asociado
Inga. Agr. Mónica Espinoza- Investigador Asociado
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AGRADECIMIENTO
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero de la línea
FODECYT, dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La
Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
v
OTROS AGRADECIMIENTOS
Se agradece también el apoyo del Instituto de Investigaciones de la Universidad del
Valle de Guatemala, especialmente al Departamento de Protección Vegetal, en cuyos
laboratorios se llevó a cabo el diagnóstico del material colectado durante el trabajo de campo.
Finalmente, pero no menos importante, se agradece a las comunidades de San Juan y San
Pedro Sacatepéquez y en especial a los productores de crisantemo por la ayuda brindada al
presente estudio. Gracias por permitirnos ingresar a sus invernaderos y por la atención que nos
brindaron.
vi
INDICE
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ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE GRÁFICAS
RESUMEN
VII
IX
IX
X
ABSTRACT XI
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
I.2.1 Antecedentes en Guatemala 3
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 5
I.3 OBJETIVOS 7
I.3.1 General 7
I.3.2 Específicos 7
I.3.3 Hipótesis 7
I.4 METODOLOGÍA 8
PARTE II
II.1 MARCO TEORICO 13
II.2 RESULTADOS 35
II.2.1 Discusión de resultados 46
PARTE III
III.1 CONCLUSIONES 52
III.2 RECOMENDACIONES 53
III.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
III.4 ANEXOS
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ilustración de morfología de crisantemo (Chrysanthemum
coccineum de Chrysanthemum roseum Web. / Mohr.)
Figura 2. Crisantemos tipo uniflor y spray cultivados en San Juan
Sacatepéquez.
Figura 3. Ilustración de distintos tipos de inflorescencia de
crisantemos.
Figura 4. Crisantemos de la variedad Pinocho blanco, del área de San
Pedro Sacatepéquez.
Figura 5. Daño causado por Septoria chrysanthemi y daño causado por
Cercospora chysabthemi.
Figura 6. Daño causado por mildiu polvoriento.
Figura 7. Rosas mostrando infección con moho gris y flores de
crisantemo mostrando el moho gris.
Figura 8. Hojas con síntomas de roya (P. chrysanthemi) y síntomas de
roya causada por Puccinia horiana.
Figura 9. Daño causado por Psedomonas cichorii.
Figura 10. Tallos con daño causado por Erwinia carotovora.
Figura 11. Hojas con daño foliar cuasado por nemátodos.
Figura 12. Daño ocasionado por Fusarium.
Figura 13. Daño foliar por Vertycillium.
Figura 14. Sintomatología foliar clásica de Didymella ligulicola.
Figura 15. Sintomatología característica de Stemphylium lucopersici.
Figura 16. Síntomas causados por el viroide del enanismo del
crisantemo (CSVd) en crisantemo, síntomas en hojas, diferencia en
tamaño y floración de dos crisantemos infectados por el CSVd
comparados con un crisantemo sano y síntomas en las flores.
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Figura 17. Microscopía electrónica de partículas de TAV, daño foliar
causado por TAV en lechuga y daño causado por TAV a la flor del
crisantemo.
Figura 18. Síntomas causados por el virus del crisantemo (CVB).
Figura 19. Sintomatología de virus TSWV en hojas de Aster y en la
planta.
Figura 20. Síntomas de Aster yellows en crisantemo y resultados en
fotografía de crisantemos.
Figura 21. Esquema de principio de ELISA y de procedimiento de
ELISA competitivo por antígeno de captura.
Figura 22. Inclusiones virales ocasionadas por TSWV (tospovirus).
Figura 23. Inclusiones virales ocacionadas por CMV (cucumovirus).
Figura 24. Esquema de electroforesis de poliacrilamida (PAGE).
Figura 25. Invernadero cerrado visitado en la zona 3, San Pedro
Sacatepéquez, plantación techada visitada en el área de San Juan y
plantación a campo abierto visitada en la aldea Bellavista en San Pedro
Sacatepéquez.
Figura 26. Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo.
Figura 27. Mapa de distribución del virus de la aspermia del tomate
(TAV) en el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.
Figura 28. Mapa de distribución del virus B del crisantemo (CMB) en
el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.
Figura 29. Mapa de distribución del virus del bronceado del tomate
(TSWV) en el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.
Figura 30. Síntomas presentados por plantas de tomate injertadas con
crisantemo contaminado con TAV, CVB y TSWV
Figura 31. Clorosis y mosaico en crisantemos con TAV.
Figura 32. Síntomas de necrosis tanto en tallo como en hojas.
Figura 33. Síntomas de TSWV y CVB, Síntomas de Erwinia
chrysanthemi con manchas bastante acuosas y grandes.
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ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Reacciones de tinción de los constituyentes de la célula
hospedera en tejidos vegetales.
Cuadro 2. Incidencia de los tres virus encontrados en el área de
estudio.
Cuadro 3. Frecuencia aparición de virus y resultado de la prueba X2
Cuadro 4. Número de plantas infectadas con alguno de los 3 tres virus
encontrados según rango de altitudes en ambos departamentos.
Cuadro 5. Número de plantas según cada categoría mostrada en
gráfica 5
Cuadro 6. Plantas indicadoras utilizadas y virus inoculados
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Resultados del número de plantas infectadas con alguno
de los cinco virus estudiados en San Juan y San Pedro Sacatepéquez,
Guatemala, 2007.
Gráfica 2. Incidencia de CVB, TAV y TSWV a diferentes rangos de
altitudes en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala en 2007.
Gráfica 3. Porcentaje de la presencia de los tres virus encontrados en
plantas infectadas con 1 sólo virus.
Gráfica 4. Porcentaje de plantas de crisantemo infectadas por uno,
dos y tres virus en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala,
2007.
Gráfica 5. Porcentaje de plantas infectadas con CVB-TAV, CBV-
TSWV y TAV-TSWV.
Gráfica 6. Porcentaje de infecciones por 1, 2, ó 3 virus comparadas
con las sanas en los dos rangos de altitud muestreado en los
municipios de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala,
durante 2007.
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RESUMEN
El crisantemo es un cultivo de gran importancia económica en varias partes del mundo,
especialmente en China. En Guatemala, en las poblaciones de San Juan y San Pedro
Sacatepéquez se trabajan alrededor de 25 variedades de esta flor, la cual ocupa el tercer lugar en
las exportaciones de flores de corte a los Estados Unidos. Estos dos municipios son
considerados las principales zonas productoras del país. A pesar de esto, hasta ahora no se
habían realizado estudios acerca de las enfermedades virales que pueden estar afectando las
plantaciones de crisantemo en esas áreas. El objetivo de este estudio fue la detección de los virus
más comunes reportados en el cultivo de crisantemo y determinar su incidencia y distribución
dentro del área trabajada. Para lograrlo se realizaron varias visitas a los campos de cultivo de
San Juan y San Pedro Sacatepéquez, en donde se detectaron visualmente síntomas de
enfermedad y se tomaron muestras de material vegetal. Este material fue diagnosticado
mediante pruebas ELISA en el laboratorio de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de
Guatemala. En todos los campos trabajados se detectó la presencia del virus del bronceado del
tomate (TSWV), el cual ya había sido reportado en Guatemala pero no para esta área. También
se encontró el Virus de la Aspermia del Tomate (TAV) y el Virus B del Crisantemo (CVB) los
cuales no habían sido reportados para el país.
El CVB fue el virus predominante (89%), en ambas regiones, seguido por TAV (60%) y
TSWV presente en el 8% de los casos. Se encontraron que las infecciones por dos virus
simultáneamente en los crisantemos predominaron (53%), siendo la asociación de CVB y TAV
la que predominó (97%). Se encontró en un 6% de los casos infección triple e infecciones sin
asociación a otro virus en un 34%. La prueba de Ji cuadrado no mostró diferencia significativa
para la distribución de los virus en la zona de trabajo por lo que se concluye que su distribución
es homogénea en el área de estudio.
xi
ABSTRACT
Chrysanthemum is a crop of great economical importance in many parts of the world,
especially China. In Guatemala, it is the third more important cut flower product of exportation
to the United States. San Juan and San Pedro Sacatepéquez grow around 25 varieties; these two
towns are the most important places for chrysanthemum production in Guatemala. Nevertheless,
viral diseases were not tested in those plantations until now. The main objective of this study
was the detection of the most common viruses already reported for this type of flower and to
determine their incidence and distribution in the area. Field samples of leaves from plants with
viral symptoms in all fields of the area were taken and were tested by ELISA at the Plant
Protection Laboratory at the Universidad del Valle de Guatemala. Tomato Spotted Wilt Virus
(TSWV) was found. This virus was already reported in Guatemala but for a different crop and
another location. We also found two viruses not reported previously for Guatemala: Tomato
Aspermia Virus (TAV) and Chrysanthemum Virus B (CVB).
El CVB was the most predominant virus in the fields of both regions (89%), followed by
TAV (60%); TSWV was present in only 8% of the cases. We found that infection with two
viruses at the same time was more frequent in chrysanthemums (53%), with the association
between CVB y TAV the most predominant (97%). We found in 6% of the cases triple infection
and infections with only one virus in 34% of the cases. No significant difference was found in
the distribution of the viruses between the two localities using Chi Square. We concluded that
the distribution of the viruses in the zone where we sampled was homogeneous.
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PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
El crisantemo es una flor ornamental que ha sido considerada como representante
de culturas como la japonesa o la china. Es una flor llena de simbolismo, es utilizada
tradicionalmente en el Día de los Difuntos en coronas y arreglos florales en Guatemala y
algunos países latinos, pero en otros países es una planta ornamental muy utilizada en
varias ocasiones. En países asiáticos como Japón y China es utilizada en ceremonias
rituales y representa longevidad. Es una flor muy resistente que permanece viva por
varios días en los arreglos y es fácil de cultivar en el campo. Se presenta en varios
colores, formas y posee buen aroma aunque no es perfumado. Esto se debe a que se
conocen más de 200 especies e innumerables variedades, tanto que los crisantemos
actuales pueden considerarse como híbridos. Además, es importante mencionar que tiene
propiedades medicinales y este aspecto es muy apreciado y de gran utilidad.
El crisantemo es originario de China en donde ha sido empleado ornamentalmente
desde hace más de dos mil años. Su cultivo se trasladó a Japón donde se convirtió en una
flor sagrada que se utiliza en ceremonias, es un símbolo de larga vida. El crisantemo fue
introducido en Europa a través de Francia en el último tercio del siglo XVIII (Infoagro
2003). Según Horst (1990) en Estados Unidos se volvió un cultivo predominante
alrededor del año 1820, siendo establecido como planta de invernadero alrededor de 1850
(Anmirato et al. 1990). No se tienen datos exactos de cuándo empezó el cultivo de esta
planta en Guatemala, pero se cree que a principios del siglo pasado ya era cultivado en
pequeñas huertas familiares y jardines. Más tarde fue cultivado en pequeñas parcelas de
la región de San Juan y San Pedro Sacatepéquez para suplir la demanda del país
(Orellana com. pers. 2006). Este cultivo ha representado para estas comunidades la
oportunidad de comercializar no sólo a nivel nacional sino a nivel centroamericano e
internacional, ayudando a aumentar sus movimientos financieros e involucrando a
diversos sectores de las poblaciones. Actualmente, el crisantemo ha adquirido
importancia económica para el país ya que es una de las flores de corte con mayor
demanda para la exportación a Estados Unidos, ocupando el tercer lugar en importancia
en exportación de flores de corte.
En los últimos años, el crisantemo ha sufrido algunas enfermedades,
principalmente hongos han sido identificados, sin embargo, se han presentado algunos
síntomas similares a éstos de los cuales no se han podido identificar patógenos. La
sintomatología, la facilidad de transmisión de los síntomas a plantas indicadoras y la
forma de aparición de los síntomas, nos hicieron pensar que algún virus podría estar
involucrado en esta patología. Esto nos estimuló a proponer este proyecto para poder
ayudar en la identificación de los posibles virus que estaban afectando a este cultivo y
sobre todo para poder proponer alguna medida de control y principalmente preventiva
para lo que se identificara. Estimamos también que sería muy conveniente poder elaborar
un manual en forma de trifoliar informativo para que los agricultores tuvieran
información sobre lo que estaba sucediendo o que podía suceder de acuerdo a los
síntomas, virus y vectores que se identificaran.
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El crisantemo para San Pedro Sacatepéquez y para San Juan Sacatepéquez es de
mucha importancia ya que tienen el clima y la tierra adecuada para su siembra. La
comunidad se ha agrupado en cooperativas y/o asociaciones para propiciar una mejor
producción y para poder optar a mercados más fuertes e importantes como grupo. Esta
forma de producción ha ayudado a que el crisantemo sea considerada por la AGEXPORT
(http://www.negociosgt.com/main.php?id= 22&show_item=1&id_area=98), en el año
2005, como una de las principales flores de corte para la exportación. Una asociación
que ha tenido mucho impacto en estas poblaciones es la de ASOFLORSA (Asociación de
Floricultores Sanjuaneros). Este estudio fue hecho principalmente con la colaboración de
los socios de ASOFLORSA.
ASOFLORSA colaboró en este estudio prestando sus terrenos para que se
hicieran los muestreos, dando información sobre la forma como ellos llevan a cabo el
cultivo, lo cortan y lo comercializan. Así también colaboraron brindando facilidades para
poder fotografiar sus plantaciones y las diferentes variedades de crisantemo. Así
pudimos observar de cerca una producción de crisantemo que es apoyada por muchos
agricultores en la que participan todos los miembros de la familia.
La producción de crisantemo es muy importante para los agricultores de estas
comunidades y la presencia de enfermedades o de vectores de enfermedades hace que la
producción sea más difícil, elevando los gastos de la cosecha y evitando obtener las
ganancias planificadas. Los virus son entidades subcelulares que no pueden eliminarse
fácilmente agregando un químico, porque generalmente los químicos que afectan a los
virus también hacen daño a las células vivas o a los organismos. Por esto, es necesario
saber la identidad de lo que queremos controlar o eliminar. Hay un dicho que dice que es
necesario conocer al enemigo para poderlo controlar. En cuanto a virus, es importante
conocer características de ellos pero también características como su forma de
transmisión, su rango de hospederos, si existen diferentes cepas y otros aspectos. Por lo
tanto, en este proyecto trataremos de identificar los virus únicamente para saber quién
puede ser su probable vector. Con esto, podemos orientar el control y la prevención
hacia el vector del virus identificado para romper el ciclo de transmisión o de dispersión.
Se eliminarán las plantas infectadas, es decir, se eliminará el inóculo y los pocos vectores
presentes no podrán encontrar inóculo viral y no habrá infección ni dispersión del mismo.
Por lo tanto, la enfermedad desaparecerá de los campos de cultivo.
Hay varias formas de control y/o prevención que se explican más adelante, éstas
podrán ser de mucha utilidad para el manejo de estas enfermedades y sobre todo para
prevenir la presencia de ellas en el campo. Creemos que si se manejan los cultivos
adecuadamente, principamente mediante medidas de prevención y utilizando no sólo un
acercamiento sino uno integrado, estas enfermedades virales disminuirán o desaparecerán
en el mejor de los casos, ayudando a que la producción sea mejor, sin tantos gastos y sin
riesgos para la salud y el ambiente
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala.
Las enfermedades causadas por virus son y han sido históricamente las causantes
de grandes pérdidas económicas en cultivos, tanto agrícolas como ornamentales. Los
virus se dispersan con suma facilidad en las áreas a las que han logrado ingresar debido a
que son transmitidos por vectores cuando éstos se alimentan. Además, son capaces de
permanecer en un área dada aún en ausencia de cultivos ya que son capaces de utilizar
malezas y plantas silvestres como hospederos. En el caso de los crisantemos, el problema
se agrava debido a que la forma tradicional de reproducción es por medio de esquejes,
con lo que las plantas de cada nuevo ciclo de cultivo son clones de las del ciclo anterior y
si éstas están contaminadas con virus, las nuevas también lo estarán. Cuando un virus se
ha introducido en un campo de cultivo, o en un invernadero, no es posible tratar las
plantas para eliminarlo, la única solución es eliminar todas las plantas infectadas.
Este proyecto se propuso para llevarse a cabo en San Pedro y San Juan
Sacatepéquez y para evaluar la presencia de virus debido a que en los años 2005 y 2006,
se reportaron pérdidas en el cultivo de crisantemo entre el 10 y el 90% debido a una
enfermedad que no se sabía su identidad y su origen. Esta enfermedad no había sido
reportada y no se pudo aislar hongos o bacterias de las muestras. Los síntomas
coincidían con los que produce el virus del bronceado del tomate (TSWV) por la necrosis
en tallos y hojas y por aparecer principalmente durante la floración. Se consideró que la
identificación del patógeno era muy importante para poder saber qué medidas preventivas
y de manejo se podían aplicar y sobre todo porque el TSWV es un virus de cuarentena en
varios países, al menos para tomate. Era de aprovechar este proyecto para poder
identificar otros virus reportados en la literatura para determinar si estaban presentes en
estos campos ya que muchos virus no se presentan aislados y no siempre hay un solo tipo
de vector de estas enfermedades. Además, en el crisantemo hay otros virus que pueden
transmitirse sistémicamente que afectarían la reproducción por esquejes. Esto nos daría
un panorama más completo y el manejo del cultivo tendría una visión más amplia y
adecuada a la realidad.
Por esto, en este proyecto se trabajó bajo la premisa que en el área de estudio no
se encontraba ningún cultivo libre de virus, no importando cuál virus de los estudiados
fuera, pero que podría causar pérdidas económicas a los agricultores. Esta premisa surgió
porque la forma como reproducen al crisantemo año con año no es con semillas sino es a
través de esquejes que no se sabe si están o no infectados por virus antes de
reproducirlos. Para demostrarlo se escogieron los cinco virus más comunes en
crisantemo reportados en la literatura, para detectarlos en el área trabajada. Se realizaron
muestreos espaciados a lo largo de un año, para cubrir las diferentes estaciones climáticas
y ver si éstas afectan de alguna manera la presencia y/o distribución de los diferentes
virus o si las mismas permanecen invariables a lo largo del año. Los muestreos se
realizaron viajando al área de estudio y visitando todos los campos de crisantemo que se
encontraron y a los que nos dieron permiso de entrar, de esta manera se cubrió la mayor
área posible. ASOFLORSA fue la asociación que nos puso en contacto con los
4
agricultores al inicio. Esta asociación fue fundada el 14 de junio del 2005 y es no
lucrativa. Está conformada por 50 socios que se dedican a la comercialización de
crisantemos de variedades no definidas y de rosas. Tienen un invernadero en común con
sistema de riego pero cada socio tiene unidades productivas en sus viviendas. La
asociación está formada por productores de nueve comunidades de San Juan
Sacatepéquez que son beneficiarios del Programa de Encadenamientos Empresariales de
AGEXPORT. Los productores miembros de esta Asociación se dedican a fortalecer el
manejo empresarial de la producción, así como la parte agronómica (nuevas variedades,
mejoramiento de imagen, inocuidad y buenas prácticas agrícolas). Esta asociación espera
que mediante la generación de empleo e ingresos se mejore la competitividad y ofertas
productivas para apoyar la reducción de pobreza y el desarrollo económico de la región.
Las variedades de crisantemos que ellos producen se encuentran en el siguiente enlace: http://www.tikoj.com/index.php?option=com_content&view=article&id=48&Itemid=62&lang=e
s.
5
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
La mejor justificación para este trabajo es la necesidad y preocupación
evidenciadas por los agricultores de San Pedro y San Juan Sacatepéquez al llegar a
solicitar la realización de este trabajo. ASOFLORSA fue durante todas las etapas del
proyecto un valioso aliado. Como evidencia de la importancia que tiene esta actividad
para estos agricultores están los datos que ellos mismos publican en su página web
(http://www.encadenamientosempresariales.com/Portal/
Home.aspx?tabpath=Questionaries%2fCompanyDetail&CID=27&companyName=ASOF
LORSA&CategoryName=\ASOFLORSA&tabPathBack=Encadenamientos%2fEncadena
mientos+Empresariales), en los cuales ellos establecen los montos anuales de ventas de la
Asociación y de los socios, que están alrededor de $50,000 a $60,000.00. Cada socio
recibe anualmente entre $3,750.00 a $4,250.00 y el número de personas que están
vinculadas a esta actividad es aproximadamente de 150. Esta actividad es de suma
importancia para la comunidad ya que cuenta con mercados tanto locales como
centroamericanos que debe conservar.
El desconocimiento de esta enfermedad ha causado muchos problemas en la
producción de crisantemo, a tal punto que abandonaron el cultivo de algunas variedades
muy buenas para comercializar pero que les estaban causando muchas pérdidas, esto a
pesar de estar tratando de aplicar medidas adecuadas. Sin embargo, para esta enfermedad
o grupo de enfermedades, las prácticas fitosanitarias fueron inadecuadas, el mal manejo
de las plantaciones y la reproducción asexual de plantas de crisantemo infectadas por
virus, condujo a la rápida diseminación de plagas y enfermedades virales dentro de los
campos de cultivo. Esto causó grandes problemas y pérdidas económicas a los
productores, en el caso del crisantemo. De las enfermedades reportadas para este cultivo,
los virus conforman un grupo de gran importancia. Las infecciones por virus provocan
deformaciones, cambios de color y tamaño de plantas, flores y hojas, así como la muerte
temprana no sólo de plántulas individuales sino también la pérdida de tablones enteros.
Estas deformaciones, cambios de color y de tamaño conducen a la reducción de la calidad
y cantidad de flor de corte producidas. En Guatemala, el cultivo de crisantemo está
considerado como uno de los cultivos más prometedores para exportación, pero para
comunidades como San Juan y San Pedro Sacatepéquez quienes se dedican a sembrar
flores de corte para exportación y el crisantemo es uno de los más cotizados, es más
importante aún. El crisantemo es una buena fuente de ingresos tanto para estas
comunidades como para el país. En los últimos años las importaciones de flores de corte
y follajes de Estados Unidos provenientes de Guatemala han alcanzado importantes
posiciones con respecto a otros abastecedores de este mercado. En el caso de flores de
corte y capullos frescos, Guatemala tiene un 1.5% de participación en el mercado,
ocupando la tercera posición a nivel mundial. En lo que respecta a flores de corte, los
crisantemos ocupan el tercer lugar en la preferencia del mercado estadounidense
(AGEXPRONT et al. 2006). Este mercado se caracteriza por ser altamente competitivo y
por tener un comportamiento estacional. Aunque la mayoría de flores frescas cortadas no
requieren permisos de entrada, todo embarque es revisado en las aduanas para determinar
la ausencia de plagas o enfermedades (AGEXPRONT et al. 2006). Debido a esto es
6
importante tener control sobre las enfermedades que puedan encontrarse en las
plantaciones de flores de corte.
Aunque en Guatemala se han reportado diversos síntomas indicadores de virus en
los campos cultivados, sobre todo en las zonas de San Juan y San Pedro Sacatepéquez,
hasta ahora no se había realizado un estudio formal de la presencia y distribución de
ninguno de los virus que afectan al crisantemo comúnmente. Hasta ahora se desconocía
tanto la presencia como la incidencia y síntomas típicos de los virus de la aspermia del
tomate, bronceado del tomate y virus B del crisantemo en campos de cultivo de la
principal zona productora de Guatemala. En el presente proyecto se trabajó sobre la
sospecha de que en el área de trabajo existía la presencia de virus en las plantaciones
debido a muestras que fueron enviadas al Laboratorio de Protección Vegetal para ser
analizadas. Es por esto que se consideró de suma importancia su estudio.
Las técnicas ELISA, junto con la caracterización de síntomas en plantas
indicadoras, son los métodos más frecuentemente utilizados para la detección y
diagnóstico de virus en cultivos hortícolas y ornamentales. Ambas técnicas presentan
ventajas, como el hecho de ser relativamente simples de realizar, bajo costo económico
(comparado con técnicas de extracción de ADN) y su confiabilidad, una vez han sido
estandarizadas. En este trabajo se propone la utilización de ambas técnicas de manera
complementaria, es decir, realizando diagnósticos de los virus por medio de ensayos
serológicos y caracterizando sus síntomas producidos en plantas indicadoras en
condiciones de invernadero.
7
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
1.3.1.1 General
Detectar, por medio de pruebas ELISA, la presencia de virus en los campos de
cultivo de crisantemo de las zonas de San Juan y San Pedro Sacatepéquez.
I.3.1.2 Específicos
Determinar la incidencia de los virus estudiados en los campos de cultivo de la
zona trabajada.
Caracterizar los síntomas producidos por los virus estudiados en plantas
indicadoras.
Determinar la distribución de los virus estudiados y hacer un mapa preliminar de
la misma en la zona estudio.
Elaborar un manual preliminar con los resultados obtenidos.
I.3.2 Hipótesis:
Los crisantemos de San Juan y San Pedro Sacatepéquez no están infectados por
virus.
La distribución de los virus en San Juan y San Pedro Sacatepéquez no es
uniforme.
8
I.4 METODOLOGÍA
1.4.1 Localización y condiciones atmosféricas:
San Juan Sacatepéquez se encuentra a 1,845 metros sobre el nivel del mar
(msnm) y tiene una extensión de 242 km2. Las temperaturas oscilan de 15 a 23°C
durante el año (http://medicina.ufm.edu/cms/es/san-juan-sacatepequez). San Pedro
Sacatepéquez se encuentra a 2,033 msnm y tiene una extensión de 48 km2. Su clima va
de templado a frío durante el año (http://info.worldbank.org/etools/docs/library/130392
/Guatemala%20-%20San%20Pedro%20 Sacatep%E9quez.pdf). Los datos de latitud de
los lugares muestreados se encuentran en el Anexo 1 de este informe. No se tomaron
datos de humedad relativa ni de temperatura ya que no eran relevantes para el estudio
(ver anexo 1).
1.4.2 Las variables:
I.4.2.1 Variables dependientes: Las variables dependientes son los tres virus
encontrados, TSWV, TAV y CBV.
I.4.2.2 Variables independientes: Estas variables los dos departamentos y la
distribución de los virus.
1.4.3 Indicadores:
El indicador principal es la presencia o ausencia de los diferentes virus en las
diferentes plantaciones de crisantemo.
1.4.4 Estrategia metodológica
1.4.4.1 Población y muestra: Para este proyecto se necesitaron hacer varios viajes
de colecta a los departamentos de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, municipios de
Guatemala, en el carro de doble tracción del Departamento de Biología de la Universidad
del Valle de Guatemala. Se realizaron 9 viajes. En estos viajes, se colectaron muestras
de tallos y hojas en bolsas plásticas sin aire dentro de una hielera o en macetas con tierra
si se traía a la planta entera. Se tomaron datos de georreferencia y de altitud con un GPS
marca Garmin modelo Etrex Color, los cuales se registraron en una base de datos en la
cual se colocaron los datos de la localidad, número de colecta y variedad (cuando se
conocía). Asimismo se detectaron visualmente los síntomas de posibles infecciones
causados por virus en plantas de crisantemo de diferentes variedades. Las plantas
muestreadas se encontraban en distintas etapas de desarrollo. Se tomaron fotos de las
plantas que presentaban síntomas de infección. El muestreo fue dirigido a sintomatología
y se colectaron por lo menos 10 plantas cada visita. Esto fue aproximadamente un 2%
del total de plantas encontradas con síntomas. El número varió de acuerdo a los síntomas
encontrados. Los síntomas se clasificaron según si las plantas presentaron manchas
necróticas, clorosis en el borde de las hojas, deformación en hojas nuevas, manchas
moradas en el tallo, enanismo y algunas que no presentaron síntomas pero parecían
9
enfermas. Se recolectaron también algunas muestras de plantas que estaban alrededor de
la planta con síntomas para detectar la posible enfermedad prematuramente.
I.4.5 El método:
El material colectado se llevó a la Universidad del Valle de Guatemala en donde
se le asignó un número de identificación de laboratorio y se registraron en la base de
datos del proyecto. Seguidamente, se almacenaron las muestras a 4 grados centígrados
deshidratadas en casos o se sembraban en macetas si venían en bolsas de tierra, hasta su
evaluación.
Las muestras fueron analizadas mediante pruebas de ELISA directo con kits de la
casa AGDIA, Inc. La técnica utilizada aparece en el anexo 2. Se corrieron pruebas para
el virus de la aspermia del tomate (TAV), virus del mosaico del pepino (CMV), virus del
bronceado del tomate (TSWV), virus de la mancha necrótica de Impatiens (INSV) y virus
B del crisantemo (CVB). El diagnóstico se realizó en las instalaciones del laboratorio de
virología en el departamento de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de
Guatemala, el cual proveyó el siguiente equipo: lavador automático de placas ELISA,
lector de placas ELISA, cuarto frío para el almacenaje de las muestras, micropipetas,
cristalería y algunos químicos para los amortiguadores utilizados.
Los resultados completos obtenidos se colocaron en una tabla de Excel (apéndice
1), la cual fue utilizada para realizar el mapeo tanto de los sitios visitados como de los
virus encontrados en cada uno de ellos. Para llevar a cabo esta actividad se utilizó el
programa DIVA-GIS, el cual puede obtenerse libremente en internet.
El trabajo de invernadero se llevó a cabo en las instalaciones del inverdadero C de
la UVG, en donde se obtuvieron las plantas indicadoras utilizadas. En este proyecto se
utilizaron: Nicotiana glutinosa, N. clevelandii, N. tabacum, Lycopersicum esculentum,
Phaseolus vulgaris y Datura stramonium. Durante el trabajo de invernadero se tomaron
muestras de las plantas que salieron positivas para los diferentes virus y se realizaron
inoculaciones mecánicas e injertos. Estas se tuvieron en observación durante 40 días para
evaluar y documentar el desarrollo de síntomas. Para las inoculaciones mecánicas se
diluyó el inóculo (tejido infectado por virus) en un amortiguador de fosfatos con un pH
básico (8) y se frotaron sobre la superficie de las hojas de las plantas indicadoras
previamente rociadas con carborumdum para causar heridas en las hojas y facilitar la
penetración del virus al interior de las plantitas. Se hicieron anotaciones de las
observaciones diarias después de la inoculación y luego cada 3 días.
I.4.5.1 Pruebas llevadas a cabo en las muestras colectadas:
I.4.5.1.1 Pruebas del ensayo inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA):
La prueba de ELISA fue hecha a todas las muestras colectadas. Fue un ensayo directo de
doble sandwich, es decir, que se usó un anticuerpo dirigido al virus específico tanto antes
de agregar la muestra como después para determinar si había presencia de virus o no.
Este método se basa en reacciones de antígeno-anticuerpo que se explicarán con más
10
detalle en el marco teórico. Se usó un kit diferente para cada virus ya que los anticuerpos
son muy específicos. La descripción detallada de la técnica se encuentra en el apéndice
2. Se utilizó un lector de ELISA marca Biotek, modelo ELx800, un lavador de placas
marca BioRad modelo 1575 Immuno-wash, micropipeta multicanal marca Eppendorf
Research modelo Multi-8channel 30-300 ul y micropipetas individuales de diferentes
voúmenes (0-20 ul, 20-200 ul y 100-1000 ul) marcha Eppendorf Research. Los kits de
ELISA fueron de la casa AGDIA y traían las placas para la prueba incluídas.
I.4.5.1.2 Inoculación mecánica a plantas indicadoras o bioensayos: La técnica
de plantas indicadoras aunque usada hace mucho tiempo, sigue siendo una de las más
exactas. Esta metodología puede tener variantes y las más usadas son la inoculación
mecánica y los injertos. En esta técnica se usan generalmente plantas herbáceas para que
los resultados se obtengan más rápidamente pero pueden ser usadas algunas plantas
leñosas jóvenes. Lo que se busca es transmitir los síntomas que tenía la planta infectada
a una planta sana y que se cumplan los principios de Koch. Se usa no un solo tipo de
plantas sino varias que se haya comprobado que presentan reacciones diferentes a la
presencia del virus. Antiguamente se usaban baterías de 10 o más plantas, en la
actualidad se seleccionan menos pero que se conozca que presentan reacciones diferentes
con diferentes virus. Esta técnica puede llevarse a cabo no sólo utilizando carborundum
o una lejía, puede llevarse a cabo mediante la inyección del extracto con el mismo búfer
directamente a la vena o al tronco de la plántula, al xilema o al floema. Para llevar a cabo
estas técnicas se procede como se describe en el anexo 3. Las plantas indicadoras
utilizadas fueron: Lycopersicum esculentum, Datura stramonium, Chenopodium quinoa,
C. amaranticolor, Nicotiana tabacum, Nicotiana clevelandii, N. tabacum, N. glutinosa
Phaseolus vulgaris.
Si es un virus restringido a floema o un virus inestable o en baja concentración, es
más fácil obtener la transmisión por medio de la técnica de injerto. El injerto es la
operación por la cual una parte de la planta se une a otra planta (una es el pie y la otra es
la variedad). A la planta sana que es el pie se le injerta un trozo de la planta enferma para
transmitir la infección
En cuanto a los tipos de injerto son muy variados, siendo unos métodos más
aconsejables que otros para determinadas plantas o para la época en que se realicen. En
general destacaremos como más usuales y de una manera simplificada los siguientes:
I.4.5.1.2.1 Injerto de aproximación
I.4.5.1.2.2 Injerto de hendidura
I.4.5.1.2.3 Injerto a la inglesa
I.4.5.1.2.4 Injerto en plancha
I.4.5.1.2.5 Injerto de escudete o de yema
I.4.5.1.2.1 Injerto de aproximación: Es el más fácil y el que usan la mayoría de los
viveristas para dar robustez a las plantas ornamentales. Consiste en unir entre sí 2
plantas afines.
11
I.4.5.1.2.2 Injerto de hendidura o púa terminal o lateral: Se mete la estaca dentro
de un corte longitudinal en el patrón realizado previamente procurando que la
corteza del patrón y la de la estaca se toquen, a fin de que el cambium de ambos
pueda unirse. Este tipo de injerto recibe este nombre porque la parte a injertar es
una estaca, es decir, una rama pequeña en la que hay 2 ó 3 yemas. Puede
injertarse una sola vez o con varias púas. En la púa lateral se realiza un corte en
el patrón y en una cara de la estaca del injerto para introducirla en este corte.
I.4.5.1.2.3 El injerto a la inglesa: Aquí tanto el patrón como el injerto tienen
diámetros iguales o similares. Se hace un corte en bisel en ángulos inversos en
cada una de las ramas (patrón e injerto) en uno de los extremos, el largo será
mayor a 3 veces el diámetro de la rama.
http://www.bonsai-arte-viviente.com/los_injertos.html
I.4.5.1.2.4 Injerto de parche o plancha: Se hacen 4 cortes hasta formar un
rectángulo de una longitud aproximada a un tercio del diámetro del árbol y una
profundidad suficiente como para llegar al fondo de la corteza. Se procede de la
misma forma en el vástago y se acopla la corteza de éste al patrón, rematándolo
con una cinta selladora.
12
I.4.5.1.2.5 Escudete o de yema: es uno de los más utilizados y produce un
porcentaje muy elevado de éxitos. Sobre la corteza del patrón se realiza un corte
donde se acopla la yema cortada, este corte puede ser de T o T invertida. Se
introduce en la T la yema. Al finalizar se sella con cinta aislante o cualquier
material sellador para que se fijen bien las partes.
En el proyecto se utilizó el de púa terminal porque se trabajó con plántulas
pequeñas de más o menos 15 a 20 días. El injerto de púa terminal es mucho más fácil de
utilizar porque sólo se elimina la parte terminal, se hace un corte y se introduce en este
corte la punta de la púa que se formó con la ramita de la planta a injertar (la infectada).
Todas las ramas y hojas nuevas aparecerán con síntomas si hubo transmisión.
13
PARTE II
II.1 MARCO TEORICO
II.1.1 Descripción del cultivo de crisantemo:
El género Chrysanthemum pertenece a la familia Asteraceae. Sus hojas pueden
estar recubiertas de un polvo fino blanquecino que le da un color grisáceo y generalmente
son aromáticas. Lo que se conoce como flor es realmente una inflorescencia en capítulo
(Infoagro 2003). Esta clase de inflorescencia está formada por dos tipos de flores:
femeninas (radiales) y hermafroditas (concéntricas, que corresponden a las centrales). El
receptáculo es plano o convexo y está rodeado de una envoltura en brácteas (Infoagro
2003). Ver Figura 1.
Figura 1: Ilustración de morfología de crisantemo (Chrysanthemum coccineum de
Chrysanthemum roseum Web. & Mohr.).
Fuente: Grieve M, en: www.botanical.com/botanical/mgmh/p/pelper21-l.jpg
Los crisantemos presentan gran diversidad de colores, tamaños y formas de flor.
Pueden cultivarse de dos formas: tipo uniflor (eliminando las yemas axilares para
producir una sola flor terminal) o tipo spray (permitiendo el desarrollo de las yemas
axilares y eliminando la yema terminal) (Figura 2).
14
Figura 2. Crisantemos tipo uniflor (a) y tipo spray (b) cultivados en el área de San Juan
Sacatepéquez.
a) b)
Fuente: FD 088-2006 (Foto Sara Barrios 2007). Fuente: FD 088-2006 (Foto Sara Barrios 2007).
Según su forma, este tipo de inflorescencia se puede clasificar en:
Sencillas (comúnmente conocidas como Shasta): tipo margarita, compuestas de
una o dos hileras de flores radiales y con flores hermafroditas centrales.
Anémonas: flores concéntricas tubulares y alargadas.
Recurvadas: en forma globular, con flores recurvadas hacia adentro.
Reflejas: forma redonda con flores radiales doblándose hacia adentro y abajo.
Araña, pluma, cuchara, hirsuta: flores radiales se doblan hacia afuera y abajo.
Pompones: forma globular, constituidos por flores radiales cortas y uniformes.
No hay flores concéntricas.
Decorativas similares a los pompones, pero las hileras exteriores son más largas
que las interiores dando una inflorescencia plana e irregular. Ver Figura 3.
Figura 3: Ilustración de distintos tipos de inflorescencia de crisantemos. Pintura
histórica por Dodd, Mead and Company, 1902.
Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/File:NIEdot318.jpg
15
La multiplicación comercial del crisantemo se hace de forma vegetativa,
utilizando esquejes que salen de una “planta madre”. La obtención de éstos es un proceso
que dura alrededor de 3 meses y medio; después de este tiempo se elimina la planta
adulta para evitar que su degeneración perjudique la calidad de los esquejes producidos.
Una planta puede producir 14 ó 15 esquejes, los cuales son cortados de manera uniforme
con 5 - 6 centímetros u 8 - 10 centímetros de longitud (Herreros 1995, Infoagro 2003).
Los esquejes obtenidos se almacenan en cajas de cartón rodeadas de polietileno (para
evitar que se deshidraten) hasta por seis semanas, a temperaturas entre 0 - 3º C. También
pueden ser enraizados, con sombreado ligero, humedad relativa alta y temperatura entre
18 - 22º C. El proceso de enraizado se completa en 3 ó 4 semanas (Herreros 1995).
Cuando la planta ha sido establecida en el invernadero se produce su desarrollo
vegetativo y floración. Esta última depende de la temperatura y longitud del día
(Herreros 1995, Infoagro 2003). En la mayoría de las variedades, el exceso de calor
atrasa el proceso, mientras que el frío puede adelantarlo (Herreros 1995). Las
temperaturas recomendadas para las plantas en proceso de floración varían entre 16º C
durante la noche y 25º C durante el día. Para obtener flor de corte se pueden emplear
temperaturas de 11 º C por la noche y 16 - 24 º C durante el día. Si la temperatura es muy
alta pueden hacer palidecer el color de las flores, mientras que el frío excesivo puede
provocar la aparición de tintes rosados en las flores blancas (Figura 4). Las fluctuaciones
constantes de temperatura pueden causar falta de uniformidad en la floración (Herreros
1995). La floración de los crisantemos es muy sensible al fotoperíodo (Infoagro 2003,
Herreros 1995). Con más de 15 horas luz/día las plantas tienden a mantener su desarrollo
vegetativo, sin florear. El punto crítico para que se induzca la floración está por debajo
de las 13 horas luz/día dependiendo la variedad (Herreros 1995) aunque en el informe de
Infoagro (2003) se reporta que la longitud crítica de horas luz para la floración es 14.5
horas.
La intensidad de luz puede influir en la calidad de la flor, así, al plantar
crisantemos en zonas sombrías en general se obtienen tallos más delgados y flores más
pequeñas que en zonas soleadas, aunque también hay variedades más sensibles que otras
a esta influencia. Para la producción de flores durante todo el año se pueden aplicar
regímenes ya sea aumentando las horas luz artificialmente o acortando el día con plástico
o tela negra (Herreros 1995).
Figura 4. Crisantemos de la variedad Pinocho blanco, San Pedro Sacatepéquez. Se puede
observar la coloración morada provocada por el frío extremo al que se ven expuestas
Fuente: Foto tomada por Wendy Tort 2007
16
II.1.2 Plagas y enfermedades del crisantemo
Los crisantemos son susceptibles a numerosas plagas y enfermedades. Debido a
esto, es importante mantener un cuidado especial en su sanidad, ya que es determinante
para mantener una buena calidad en flores y hojas.
Se han reportado numerosas plagas que afectan los cultivos de crisantemo,
algunas de ellas son:
II.1.2.1 Artrópodos
Áfido del crisantemo (Macrosiphoniella sanborni).
Mosca del crisantemo (Liriomyza trifolii) cuya larva se desarrolla en el follaje,
teniendo preferencia en el haz de las hojas donde causa minas serpenteadas (Infoagro
2003, Herreros 1995).
Nemátodos, como el Aphelenchoides ritzemabosi, que se diseminan por los
estomas junto a las salpicaduras del agua causando lesiones angulares de color verde
oscuro- café en las hojas (Infoagro 2003); o los del género Pratylenchus, que causan daño
en las raíces (Herreros 1995).
Araña roja (Tetranychus urticae) que causa daño en las hojas, las cuales toman un
color grisáceo a medida que avanza el ataque y en las flores por deformación de pétalos.
Trips, de suma importancia por ser considerados como posibles transmisores de
virus sistémicos y persistentes a los cultivos de crisantemos. Entre las especies más
frecuentes se encuentran Frankliniella occidentalis, Thrips palmi, T. tabaci y F. intosa,
que provocan la decoloración y desfiguración de los pétalos. F. occidentalis es una
plaga de más de 200 especies de plantas y es un eficiente transmisor del virus del
bronceado del tomate (TSWV) y otros tospovirus. Su rango de alimentación incluye
tanto plantas hortícolas como ornamentales y de corte (crisantemo, rosa, clavel,
impatiens, gerberas, asteráceas en general, prímulas y cinerarias), vegetales (pepino,
lechuga, tomate, frijol, berenjena, chile) y frutas (fresa y frutas de hueso) (EEPO 2005).
II.1.2.2 Enfermedades bacterianas, fúngicas y causadas por nematodos.
Existen varias enfermedades que atacan el follaje y flores de las plantas de
crisantemo que afectan al crisantemo y que pueden causar algunos sintomatologías
similares a las causadas por virus, entre ellas se encuentran:
Manchas foliares: Generalmente son causadas por hongos que incluyen las
especies Septoria chrysanthemi, S. chrysanthemella, Alternaria spp. y Cercospora
chrysanthemi . La sintomatología inicial incluye la aparición de manchas amarillas que
cambian de marrón a negro. La infección ocurre primero en las hojas inferiores, las
17
cuales de manchas amarillas se convierten en grandes áreas necróticas que finalmente
causan la muerte de la hoja completa. (Bicklow 2006). La figura 5 muestra algunas
manchas causadas por estos patógenos.
Figura 5: (A) Daño causado por Septoria chrysanthemi y (B) Daño causado por
Cercospora chrysanthemi
A B
Fuente: www.forestryimages.org/search/action.cfm?q=sy)
Mildiu polvoriento (Erysiphe cichoracearm ): Caracterizado por un crecimiento
gris ceniciento en hojas y ocasionalmente en tallos. El follaje puede distorsionarse hasta
el punto de morir en casos de infecciones severas. La enfermedad es más seria cuando el
clima es caliente y húmedo. Para la infección con mildiu no es necesaria la presencia de
agua libre pero altos niveles de humedad estimulan el desarrollo de la enfermedad
(Bicklow, 2006). Su sintomatología es típica y se propaga rápidamente si no se manejan
las plantas adecuadamente. Un ejemplo de este patógeno se presenta en la figura 6.
Figura 6: Daño causado por mildiu polvoriento
Fuente: http://www.commanster.eu/commanster/Mushrooms/Asco/SuAsco/Erysiphe.cichoracearum.htm
Moho gris (Botrytis cinerea ): La sintomatología de esta patología puede ocurrir
en pétalos (tizones de inflorescencias), hojas y los tallos muestran manchas acuosas
18
marrón. Las plantas infectadas pueden estar cubiertas con masas polvorientas de esporas
de color café a gris. Los tejidos senescentes son más susceptibles a infección. El clima
húmedo, nuboso y mojado favorece el crecimiento de este moho (Bicklow 2006). La
figura 7 muestra algunos síntomas de esta enfermedad en rosas, ya que afecta a la
mayoría de plantas ornamentales si no se toman medidas de prevención.
Figura 7. (A) Rosas mostrando infección con moho gris (tomado de:
www.urbanext.illinois.edu) y (B) Flores de crisantemo mostrando el moho gris
Fuente: www.harrylawson.me.uk/Pestsanddiseases/pests.htm).
Roya: Existen dos especies de Puccinia causantes de la roya en crisantemos, la
P. chrysanthemi y P. horiana. P. chrysanthemi es común durante el verano y se
caracteriza por la aparición de pústulas marrón y manchas amarillo verdosas en la
superficie de las hojas. P. chrysanthemi causa daños menores en el campo y es poco
común en los invernaderos. Una infestación severa puede dañar áreas grandes de las
hojas provocando defoliación y reducción la producción de flores. P. horiana causa
pústulas rosáceas y marrones en la hoja y lesiones
blancas, amarillas y verdes en la superficie de las hojas (Bicklow 2006). Este tipo de
pústulas es visto en época de humedad relativa alta en algunas plantaciones de
Guatemala.
Figura 8: (A) Hojas con síntomas de roya (P.chrysanthemi) (tomado de: y (B y C)
síntomas de roya causada por Puccinia horiana.
Fuentes: A. http://www.asturnatura.com/fotografia /setas-hongos/puccinia-chrysanthemi-roze-1/3801.html, B y C: www.viarural.com.ar/.../puccinia-horiana.htm.
C
B
A
A B
19
Manchas foliares bacterianas (Pseudomonas cichorii): Los síntomas de esta
enfermedad son manchas marrones bordeadas de un tejido amarillento. Hay decoloración
prominente a lo largo de las venas de las hojas y las lesiones pueden volverse angulares si
el crecimiento bacteriano es limitado por las venas mayores. Generalmente la hoja muere
cuando la enfermedad está avanzada. Las bacterias persisten en las plantas infectadas,
semillas infectadas, herramientas y macetas (Bicklow 2006). En la figura 9 se presentan
algunos daños causados por esta bacteria.
Figura 9: Daño causado por Pseudomonas cichorii
Fuente: http://www.forestryimages.org/search /action.cfm?Start=1&q=brown&results=1367) y
www.infojardin.com/foro/showthread.php?p=1881867
Pudrición bacteriana (Erwinia carotovora): La sintomatología de esta
enfermedad se extiende a las hojas, los tallos que se llenan de agua, brotes que se
oscurecen, ennegrecimiento de las terminales y el colapso de la parte superior de la
planta. Esta bacteria sobrevive dentro de los escombros agrícolas y se ve favorecida por
alta humedad y altas temperaturas. Se dispersa fácilmente a través de herramientas, por
contacto o por plantas infectadas (Bicklow 2006). En la figura 10 se presentan daños en
los tallos de girasol.
Figura 10: Tallos con daño causado por Erwinia carotovora
Fuente:http://www.inta.gov.ar/parana/info/documentos/produccion_vegetal/girasol/enfermedades
/20311_071207_podr.htm
20
Nemátodos foliares (Aphelenchoides ritzema-bosi): Los indicadores de una
infección por nemátodos son el aparecimiento de manchas angulares de amarillo a café.
Los nemátodos nadan en un film de agua formado en las plantas para movilizarse a hojas
sanas. Las lesiones en las hojas eventualmente crecen hasta cubrir toda la hoja, la cual
muere y se cae (Bicklow 2006). En la figura 11 se presentan algunos síntomas vistos en
plantas susceptibles a este tipo de infección.
Figura 11: Hojas con daño foliar causado por nemátodos
Fuente: http://www.apsnet.org/pd/searchnotes/2007/PDIS-91-5-0637B.asp
Marchitez por Fusarium: Los primeros signos de esta enfermedad son el
amarillamiento del follaje y achicamiento. Las plantas pueden parecer estresadas y el
follaje puede ponerse color marrón y morir. Los tallos presentan una decoloración rojo-
marrón en el sistema vascular. El Fusarium se propaga en suelo contaminado y cortes
infectados la cual se ve favorecida por temperaturas cálidas, humedad relativa alta,
mucho riego y drenajes deficientes. Las variedades susceptibles son: 'Bravo',
'Cirbronze', 'Illini Trophy', 'Orange Bowl', 'Royal Trophy', y 'Yellow Delaware'
(Bicklow 2006). La figura 12 muestra los daños ocasionados en crisantemo.
Figura 12: Daño ocasionado por Fusarium.
Fuente: http://www.ppdl.purdue.edu/ppdl/weeklypics/8-31-09.html.
21
Marchitez por Verticillium: Los síntomas del marchitamiento por Verticillium
pueden aparecer después del florecimiento de los capullos; las plantas jóvenes y
vigorosas pueden no presentar síntomas. El follaje se pone amarillo y se marchita,
algunas veces esto sucede a lo largo de los márgenes y en un lado de la planta. Las hojas
empiezan a morir desde la base de la planta hacia arriba y generalmente permanecen
adheridas. Los tallos pueden exhibir rayas oscuras en el sistema vascular. Esta
enfermedad es favorecida por clima frío seguido por clima cálido. Como medidas de
seguridad se debe utilizar medio de cultivo pasteurizado. Evitar usar las variedades
susceptibles incluyendo 'Bright Golden Ann', 'Echo', 'Glowing Mandalay', Mountain
Peak', 'Paragon', 'Pert', 'Puritan' y 'Wedgewood' (Bicklow 2006). Ejemplo de los daños
causados por Verticillium se observan en la figura 13.
Figura 13. Daño foliar por Vertycillium
Fuente: http://www.forestryimages.org/search/ action.cfm?q=symptoms&Start=1&results=4440).
II.1.2.3 Enfermedades de flores
Didymella ligulicola: Esta enfermedad es causada por un hongo ascomiceto del
orden Dothideales y comúnmente llamado ascoquita del crisantemo, afecta los racimos y
se puede extenderse hasta los tallos de las flores. Las hojas bajas y el tallo también
pueden verse afectados. Los síntomas incluyen pudrición y deformación de las flores en
un lado. El rompimiento de los capullos puede ocurrir en casos severos. Las hojas bajas
y los tallos pueden pudrirse y el follaje puede distorsionarse o morir de un lado del tallo.
La Didymella ligulicola persiste en plantas muertas y esporas que se propagan por viento
y agua. La enfermedad es favorecida por sobre irrigación o lluvia. Se debe evitar mojar
el follaje y las flores y mantener baja la humedad. También se recomienda proteger el
follaje con fungicidas con ingredientes activos como el clorotalonil, mancozeb,
miclobutanil, propiconazole, o tiofanato de metilo (Bicklow 2006). En la figura 14 se
muestra un síntoma típico de esta enfermedad.
22
Figura 14. Sintomatología foliar clásica de Didymella ligulicola.
Fuente: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=0454020.
Stemphylium lycopersici: Causa lesiones pequeñas necróticas que van de color
marrón claro a marrón oscuro. Dichas lesiones pueden empeorar hasta causar la muerte
del retoño. El patógeno se ve favorecido por condiciones húmedas y temperaturas entre
60° y 85° F. Como medidas preventivas se deben cortar y desechar las plantas
infectadas. Debe proporcionarse una buena circulación de aire y no se deben sobrepoblar
los cultivos. Se debe evitar la sobreirrigación y se deben mantener las plantas secas
(Bicklow 2006). Síntomas causados por este hongo ascomiceto de la familia
Pleuroporaceae, se muestran en la figura 15.
Figura15. Sintomatología característica de Stemphylium lycopersici.
Fuente: http://www.nogyo.tosa.pref.kochi.lg.jp/byoki/daityou/sakumotu/tomato/hanten.html.
23
II.1.2.4 Enfermedades causadas por virus y viroides:
Aunque dentro de las enfermedades más comunes en el crisantemo se cuentan las
causadas por bacterias y hongos, son las infecciones virales quienes conforman el grupo
de mayor importancia. Esto se debe principalmente a que no se ha encontrado hasta el
momento maneras de control de la enfermedad una vez establecida y a que pueden
dispersarse rápidamente, principalmente por vectores o de forma mecánica. Entre los
vectores de estas enfermedades encontramos a los insectos como los trips, áfidos y mosca
blanca. Estos vectores son ejemplos de vectores muy eficientes de estas enfermedades.
Además, muchos de estos virus infectan sistémicamente a la planta y si el cultivo como el
crisantemo se propaga por esquejes, la infección se expande desde que se inicia la
plantación. En Guatemala, se ha iniciado el estudio de estas enfermedades pero se
necesita hacerlo de una manera formal para dejarlas bien documentadas.
Las enfermedades producidas por virus no fueron reconocidas sino hasta 1945. El
enanismo del crisantemo, reportado como un problema viral por Dimock en 1947, llegó a
ser un serio problema en 1949 para la industria. En 1973 Diener y Lawson reportaron
que la enfermedad es producida por un viroide, el viroide del enanismo del cristantemo
(CSVd) (Anmirato et al. 1990). Los síntomas que presentan las plantas afectadas
incluyen palidez o amarillamiento en el follaje y disminución en el tamaño y maduración
temprana de las flores, que pueden abrir una semana antes de las normales (Infoagro
2003). Las plantas en general alcanzan la mitad de su altura normal y pueden presentar
pequeños puntos o manchas de tejido muerto en las hojas (Moorman sin fecha). En la
figura 16 se muestran síntomas diferentes que causa el viroide del enanismo del
crisantemo (CSVd) en su hospedero.
Figura 16. Síntomas causados por el viroide del enanismo del cristantemo (CSVd) en
crisantemo.
(A) Síntomas en hojas (fuente: www.apsnet.org/online/archive/1998/chrys34.htm). (B) Diferencia en
tamaño y floración de dos crisantemos infectados por el CSVd comparados con un crisantemo sano (centro)
(fuente: photos.eppo.org/index.php/image/1950-csvd00-02). (C) Síntomas en las flores, se puede observar
la coloración amarilla en los pétalos de la flor comparado con uno normal de color rojo
(fuente:www.forestryimages.org/browse/subthumb.cfm?su).
24
Las enfermedades causadas por viroides incluyen el “Chrysanthemum chlorotic
mottle viroid” y el “Chrysanthemum Stunt viroid”mencionado en el párrafo anterior. Los
viroides son ARNs pequeños y autorreplicables. Son capaces de inducir una amplia
variedad de sintomatologías en plantas hospederas susceptibles, las cuales incluyen
papas, tomate, pepino, coco, árboles frutales y plantas con flores como el crisantemo.
Los viroides son hebras sencillas de ARN que tienen un tamaño que va de 250 a 400
nucleótidos y existen como una estructura circular con un alto grado de
complementariedad. Sus pequeños genomas contienen información relacionada al
tráfico intracelular, localización, replicación y patogenicidad. En la actualidad se
conocen 30 especies de viroides y sus variantes. Los viroides se pueden clasificar en dos
familias: Pospiviroidae y Avsunviroidae. Los viroides de la familia Pospiviroidae la
estructura secundaria de ARN es casi de doble hebra, mientras que los viroides de la
familia de Avsunviroidae tienen estructuras secundarias altamente ramificadas. Estos
viroides también se diferencian por otras propiedades como la presencia o ausencia de
secuencias funcionales y estructurales y por el modo de replicación (Matsushita y
Penmetcha 2009).
Alrededor de 1950 fueron descubiertas otras afecciones virales, las cuales
causaron problemas en la producción de crisantemo. El virus de la aspermia de
crisantemo ChAV o CAV (Chrysanthemum aspermy cucumovirus) fue reportado por
Hollins en Inglaterra y Brierley en Estados Unidos en 1955 (Anmirato et al. 1990). Es un
virus de ARN de una sola banda en sentido positivo, perteneciente al género
Cucumovirus, está formado por partículas icosahédricas de 29 nm de diámetro
aproximadamente. Este virus puede formar cuerpos de inclusión en forma de cristales y
pueden encontrarse en el mesófilo, en el citoplasma y en las vacuolas. Sus inclusiones
son restos de virus (Brunt et al. 1996). Este virus produce deformación en la
inflorescencia (reduce y cambia el color de las flores) Los síntomas de esta enfermedad
no necesariamente se presentan el primer año; en la mayoría de variedades no se
presentan síntomas en las hojas, pero puede aparecer un jaspeado, acompañado de una
reducción de crecimiento y más raramente de enanismo. Este virus puede ser transmitido
por vectores (generalmente pulgones), o de manera mecánica (herramientas y de forma
manual) (Infoagro 2003). Es común la trasmisión a través de esquejes ya que los virus se
transportan a través de la savia. Por esto, es muy importante evaluar los crisantemos de
los cuales se sacará material para iniciar plantaciones nuevas. Si hay presencia de virus
en el crisantemo madre, seguramente las nuevas plántulas también estarán afectadas y la
calidad del crisantemo puede iniciar a deteriorarse aunque al principio no sea muy
evidente. Actualmente se le reconoce como sinónimo del virus de la aspermia del tomate
(TAV). En la figura 17 se pueden observar micrografías electrónicas del virus y daño
foliar causado por TAV.
El rango de hospederos de este virus se restringe a 9 familias entre las cuales
tenemos a Cannaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae, y otras. El pepino
(Cucumis sativus) es no susceptible. En un estudio llevado a cabo en Korea se encontró
que algunas plantas presentaron únicamente lesiones locales, entre éstas se encuentran
Chenopodium spp., Vigna unguiculata y Tetragonia expansa. Otras plantas presentaron
síntomas de infección sistémico como: Nicotiana spp., Capsicum annuum, Datura
25
stramonium, Petunia hybrida, Gomphrena globosa, Physalis floridana y Lycopersicon
esculentum „Rutgers‟ (Chung et al. 1999)
Figura 17. El virus de la aspermia del tomate (TAV) y los daños que causa.
Fuentes: (A) Microscopía electrónica de partículas de TAV, fuente: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ICTV
db/ICTVdB/00.010.0.04.003.htm, (B) Daño foliar causado por TAV en lechuga, fuente:
http://nyxt.zsagri.gov. cn/scbch/Boundary/PlantProtection/DiseasesAndInsectDetail. aspx?uqid=315 y (C)
Daño causado por TAV a la flor del crisantemo, fuente: www.harrylawson.me.uk/Pestsanddiseases
/pests.htm.
Otro virus que afecta el crisantemo es el virus del mosaico del crisantemo
(ChMV), el cual fue reportado en 1950 por Keller. En 1952, Noordam en Holanda
reportó el virus del mosaico del crisantemo B (CVB). Estos dos virus se presume son
similares. El CVB pertenece al género Carlavirus. Es un virus helical de 685 nm y 7500
nucleótidos de longitud, con ARN de una banda en sentido positivo. Este virus es
transmitido mecánicamente pero no por contacto entre plantas, es transmitido por áfidos
de forma no persistente y no se transmite por semilla.
El rango de hospederos de este virus incluye familias como Compositae,
Leguminosae-Papilionoidae, Passifloraceae, Solanaceae y Tetragoniaceae. En las hojas
de las plantas afectadas aparece un moteado clorótico seguido por el amarillamiento total
(Anmirato et al. 1990) dando como resultado una clorosis severa debido a la inhibición
de producción de clorofila (Horst et al. sin fecha). Plantas infectadas que han crecido
bajo condiciones de poca luz y con temperatura promedio inferior a 20 º C no muestran
síntomas visibles (Moorman sin fecha). Esta enfermedad es diseminada principalmente
por pulgones. Los síntomas son muy variables dependiendo del cultivar, edad de las
plantas y condiciones del cultivo, pero suelen ser más acentuados en esquejes y plantas
jóvenes. En algunas variedades se ha observado una caída anormal de las hojas (Infoagro
2003). En la figura 18 se muestran algunos síntomas como el amarillamiento de las hojas
y el debilitamiento de las flores por falta de fotosíntesis de sus hojas. El virus puede
detectarse en cualquier parte de la planta aunque los viriones se encuentran en el
citoplasma de la planta. Este virus no produce inclusiones virales.
A
B
C
26
Figura 18. Síntomas causados por el virus del cristantemo B (CVB)
Fuente: www.poljoberza.net/AutorskiTekstoviJedan.aspx.
El virus de la necrosis del tallo del crisantemo (CSNV) fue descrito por primera
vez en 1995 y está estrechamente relacionado con el virus del bronceado del tomate
(TSWV). Este virus se ha encontrado en las variedades de crisantemo Cocarde, Fiji,
Reagan, Majoor Bosshardt, Spider, Tiger, Tigerrag, Viquingo y en otras plantas de
importancia económica como gerbera, pepino, lechuga, berenjena, frijol, arveja, chile y
tabaco. Este virus, al igual que todos los tospovirus, es un virus de ARN de una banda en
sentido negativo, tripartito, icosahédrico, envuelto (Francki et al. 1985). Es transmitido
por insectos de la familia Thripidae (Thysanoptera) de forma persistente, siendo los
principales vectores Frankliniella schultzei y F. occidentalis. Los síntomas del CSNV
son muy similares a los del TSWV; las plantas infectadas presentan manchas necróticas
sobre los tallos, marchitez de tallos y hojas y manchas necróticas en forma de anillo sobre
las hojas, pedúnculos y flores (EEPO 2005).
Además, se han encontrado reportes de la presencia de TSWV (Tomato Spotted
Wilt Virus), INSV (Impatiens Necrotic Spot Virus), IYSV (Iris Yellow Spot Tospovirus)
y TCSW (Tomato Chlorotic Spot Tospovirus) asociados al cultivos de crisantemo (EEPO
2005). Se ha reportado que TSWV causa síntomas severos en una gran variedad de
plantas ornamentales, especialmente geranios, prímulas, fuscias, ciclamen e Impatiens.
El vector principal de este virus es F. occidentalis (www.agric.nsw.gov.au
/Hort/ascu/insects/wft.htm). En Guatemala, TSWV se ha encontrado con mayor
frecuencia en crisantemo que el INSV (Comunicación personal, Palmieri 2007
palmieri@uvg.edu.gt). En la figura 19 se presentan síntomas de TSWV en Aster sp. en
donde se pueden apreciar las manchas cloróticas y necróticas en las hojas principalmente
y a uno de los posibles vectores Frankliniella schultzei.
27
La transmisión del virus es persistente, circulativa y propagativa. El virus es
adquirido por las larvas al alimentarse de tejidos vegetales infectados absorbiendo
partículas virales. Estas partículas pasan del intestino a la cavidad bucal donde se
replican (Wijkamp et al. 1993). El tiempo entre la adquisición de las partículas virales y
su llegada a las glándulas salivales es largo, es superior al que precisa la larva para pasar
a estado ninfal, por lo que los adultos son los que transmiten la enfermedad. Otra
característica es que se ha observado que el virus no se transmite transováricamente y que
los adultos no pueden adquirir el virus, sólo transmitirlo.
Figura 19. Sintomatología causada por el Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) y uno de
sus vectores.
(A) Sintomatología de virus TSWV en hojas de Aster y (B) en la planta (fuente: diagnosingplantdiseases.
blogspot.com/2008_12. (C) Frankliniella schultzei, vector de TSWV (fuente: http://anic.ento.csiro.au
/thrips/identifying_thrips/Thripinae.htm).
El “Aster Yellows” es una enfermedad severa causada por fitoplasmas. Un
fitoplasma se define como un grupo de bacterias pequeñas carentes de pared celular y que
viven en el sistema vascular de una planta causando enfermedades (Guariguata & Kattan
2002). El Aster Yellows resulta en follaje clorótico, achicamiento de la planta, brotes
amarillentos, pocas o ninguna flor, distorsión de las flores y fallas en la coloración de la
flor. Los síntomas causados por virus y viroides en plantas infectadas en cambio,
incluyen el achicamiento, crecimiento anormal y formación de rosetas densas. Las flores
pueden ser pequeñas, distorsionadas o pueden exhibir rayas o interrupción del color. La
A
B
C
28
sintomatología foliar incluye amarillamiento, aparición de anillos, manchas, mosaico,
distorsión, marchitez y caída de la hoja. Muchas de las enfermedades producidas por
fitoplasmas son transmitidas por insectos los como saltahojas o cicadélidos. No hay cura
para las plantas infectadas con virus y viroides (Bicklow 2006). Para las plantas
infectadas con fitoplasmas dependiendo del avance de la enfermedad, se usa la poda de
las ramas infectadas. Los fitoplasmas se definen como ya que los fitoplasmas están
restringidos al floema.Algunos fitoplasmas pueden presentar remisión de síntomas con el
uso de antibióticos como tetraciclina, pero en algunos casos su efecto no es permanente,
vuelven a aparecer los fitoplasmas después de cierto período de tiempo. En crisantemos
el Aster Yellows es una enfermedad que se ha reportado en varias especies
principalmente en Italia, causando enanismo, formación de rosetas y ramificación
excesiva (Chung et al. 2002). En la figura 20 se presentan síntomas de la enfermedad y
un experimento en el que se usan aplicaciones foliares de oxitetraciclina a diferentes
concentraciones.
Figura 20. Síntomas de Aster yellows en crisantemo
Fuente: http://urbanext.illinois.edu/ hortanswers/detailproblem.cfm?PathogenID=153) y los resultados en
fotografía de crisantemos tratados con oxitetraciclina por un mes usando un spray foliar (A y E son
crisantemos no tratados; B aplicación de 100 mg/l; C aplicación de 200 mg/l; D 400 mg/l; F, 400 mg/l; G,
800 mg/l; H,1,200 mg/l. Esta foto fue tomada al mes después de iniciar el tratamiento (Chung et al. 2002).
En general, las enfermedades virales han sido las principales causas de pérdidas
económicas en plantaciones de crisantemo. El CSNV o TSWV es un virus que se ha
esparcido muy rápidamente a través del mundo ya que no sólo ha causado daños
importantes en crisantemo sino en otros cultivos como el tomate (EEPO 2005). El
ChMV y ChAV causan reducciones aproximadas de 5 % en el tamaño de la flor y 11 %
del largo de los tallos, lo que supone daños considerables en las plantaciones y pérdidas
económicas elevadas (EEPO 2005, Anmirato et al. 1990).
29
II.1.2.5 Técnicas de detección de virus
Debido a que la detección visual de síntomas en campo es una técnica con muchas
limitaciones, se han desarrollado varios procedimientos para realizar un diagnóstico más
adecuado de la presencia de los agentes virales; los más comunes son:
II.1.2.5.1 Ensayos serológicos: Las pruebas serológicas son altamente
específicas y proveen resultados inmediatos. El desarrollo y uso de ELISA ha mejorado
la confiabilidad de estas técnicas ya que se trabaja con sistemas antígeno-anticuerpo, los
cuales son específicos para cada virus. Esta especificidad dependerá del tipo y calidad de
anticuerpo que se produzca.
La detección en este tipo de ensayos depende del uso de una o más posibles
reacciones que pueden cuantificar en el rango de picogramos después de la elaboración
de la curva de calibración. La fosfatasa alcalina y la peroxidasa son las más utilizadas
como rastreadores de enzimas, lo que facilita pruebas que son más seguras, fáciles,
baratas y muchas veces más sensibles que los radioinmunoensayos, en los cuales el
antígeno o anticuerpo generalmente están marcados con un emisor de rayos gamma
(Glick y Thomson 1993).
Hay tres tipos de ensayos de ELISA:
a) Competitivo con antígeno de captura: Este método se utiliza comúnmente para
análisis de hormonas y otros compuestos de bajo peso molecular que pueden ligarse a
una proteína comercial y al complejo usado para generar la producción de los anticuerpos
contra el analito de interés.
Los más adecuados para utilizar en la detección de virus en plantas para este proyecto
son:
b) ELISA directo con antígeno de captura: A pesar de que se prefiere usar antígenos
purificados para minimizar la reactividad cruzada y el fondo, este tipo de ELISA se usa
comúnmente con extractos parcialmente purificados o crudos, en casos cuando no está
disponible un antígeno altamente purificado. Este es un ensayo no competitivo en el cual
dos anticuerpos se unen a un mismo antígeno pero no uno al otro. Los anticuerpos
monoclonales de dos diferentes especies pueden ser usados. Una población de
anticuerpos monoclonales está libre, y otra conjugada a una enzima. Si se utilizan
anticuerpos policlonales, una porción de esa población es marcada con la enzima.
c) Detección indirecta con antígeno de captura: El antígeno de interés se une a las
paredes de la placa de microtitulación, seguido por la unión del anticuerpo primario
(mono o policlonal), el cual luego es detectado por un anticuerpo policlonal secundario
ligado a una enzima y el cual actúa como marcador. Esto es conveniente de usar cuando
se tienen suficientes cantidades de antígeno altamente purificado para cubrir los pozos, de
esta forma el fondo no oscurece la detección. En algunos casos no se requiere un
antígeno de alta pureza si ambos sets de anticuerpos son altamente específicos (Dumbroff
30
y Gepstein, 1993). El segundo anticuerpo es un anticuerpo universal ya que se ha
producido contra la inmunoglobulina G de ratón o de otro animal, por eso se le llama
conmunmente que es un antianti-inmunoglobulina. Este anticuerpo se puede usar en
cualquier prueba de virus siempre y cuando se use como primer anticuerpo una
inmunoglobulina G. La figura 21 muestra los diferentes tipos de ELISA, el primero en el
que el anticuerpo es marcado con la enzima y se agrega después de añadir el antígeno (A)
y en el segundo caso se marca el antígeno pero se añade primero el anticuerpo (B).
Figura 21: Esquema de principio de ELISA (A) y de procedimiento de ELISA
competitivo por antígeno de captura (B).
A B
Fuente: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=imm&part=A2395.
Ligación Anticuerpo anti A
a placa
Agregar antígeno A
marcado
Agregar antígeno A
marcado + antígeno
no marcado
Lavar antígeno lo ligado
Cuantificar antígeno ligado y marcado
Agregar anticuerpo anti A ligado
covalentemente a la enzima
Lavar anticuerpo no
ligado
Enzima colorea producto
Se mide absorbancia de producto
coloreado
31
II.1.2.5.2 Bioensayos: En esta prueba se usa una serie de plantas como
indicadoras, seleccionadas de diferentes familias que puedan ser hospederas del virus
(que presenten infecciones locales y sistémicas) y otras que no sean susceptibles a él.
Luego son mecánicamente infectadas o se injertan con la planta infectada del virus que se
desea detectar. La técnica consiste en la detección de síntomas específicos que se
desarrollan para cada virus en la planta generalmente en los crecimientos nuevos. Los
síntomas se esperan son los mismos o similares en plantas del mismo tipo que la
infectada pero pueden variar en las otras plantas de la serie (principios de Koch). Sin
embargo, los síntomas son los mismos en cada una de las plantas siempre que esté
infectando el mismo virus. Los resultados no se obtienen de forma inmediata, pueden
durar meses de pendiendo del tipo de planta que se utilice como planta indicadora. Si es
herbácea es más rápida la respuesta y si es leñosa tardará más tiempo. Esta prueba
aunque lenta pero es quizá la más confiable para detectar la presencia de virus.
II.1.2.5.3 Ensayos de cuerpos de inclusión. Muchos virus de plantas
inducen la formación de inclusiones intracelulares. Estas inclusiones pueden contener
partículas virales y/u otros productos del genoma viral, y en algunos casos pueden
modificar los constituyentes de la célula. Muchas inclusiones muestran gran consistencia
a lo largo de varios hospederos. Su detección puede proporcionar una solución rápida de
detección de una infección viral. En muchos casos las inclusiones son el producto del
genoma viral y el estudio de su desarrollo puede proporcionar información valiosa acerca
de los procesos involucrados en las infecciones virales (Christie y Edwardson 1994). Los
resultados obtenidos por esta técnica son únicamente hasta familia.
Los estudios citológicos de las inclusiones pueden llevarse a cabo con
microscopía de luz y electrónica. La microscopía electrónica proporciona información
acerca de las inclusiones y de su ambiente a nivel ultra estructural. La microscopía de luz
posee varias características que la hacen invaluable, principalmente que es una técnica
sencilla de llevar a cabo, no es costosa, pero necesita experiencia para la visualización y
la identificación de las inclusiones. Este tipo de microscopía permite monitorear la
morfología y desarrollo de la inclusión, así como la relación de estos procesos desde el
punto de vista de la célula completa. La microscopía de luz puede ser valiosa para
revelar alteraciones citológicas causadas por los virus, restos de virus o proteínas y/o
ácidos nucleicos anormales estimulados por la infección viral. Generalmente se
manifiestan como cristales, lámina o laminillas en el citoplasma, en la membrana o en el
núcleo de las células. Si las inclusiones son protéicas se manifiestan mejor con
colorantes específicos para proteínas como el Orange Green. Las inclusiones protéicas se
tiñen de color café amarillentas hasta verde amarillentas. Las inclusiones formadas por
ácidos nucleicos se manifiestan mejor con colorantes para ácidos nucleicos, como el
Azure A. Estas inclusiones se colorean azules si son de ADN y fucsia si son de ARN.
Estos colorantes o compuestos químicos reaccionan con los componentes estructurales de
la célula hospedera y del virus. En el cuadro 1 se muestra los constituyentes celulares y
la tinción que hace posible su visualización y su diferenciación de los componentes
virales a identificar. Muchos de los ensayos citoquímicos y enzimáticos que son difíciles
de llevar a cabo con microscopía electrónica se pueden hacer con la microscopía de luz
(Christie y Edwardson 1994).
32
Cuadro 1. Reacciones de tinción de los constituyentes de la célula hospedera en tejidos
vegetales.
Constituyente Reacciones de tinción
Tinción con Azure A Tinción O-G
Pared celular Incolora Amarillo-verde
Cromatina Azul Verde
Citoplasma Incoloro Amarillo-verde
Cristales inorgánicos Incoloro Incoloro
Microcuerpos y
microcristales
Incoloro Verde
Nucléolo Rojo-violeta Verde
Nucleoplasma Claro Naranja
Plástidos Incoloro Amarillo-verde
Proteína P Incoloro Verde
Gránulos de almidón Incoloro Incoloro Fuente: Christie y Edwardson, 1994)
Las figuras 22 y 23 muestran ejemplos de cuerpos de inclusión vistos con
microscopía de luz en preparaciones coloreadas con colorantes para proteínas (Orange-
Green) y con colorantes para ácidos nucleicos (Azure A).
Figura 22: Inclusiones virales ocasionadas por TSWV (tospovirus).
Fuente: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5265087.
INCLUSIONES PROTÉICAS
NÚCLEO
NUCLEOLO
33
Figura 23: Inclusiones virales ocasionadas por CMV (cucumovirus).
Fuente: http://www.forestryimages. org/browse/detail.cfm?imgnum=5265056.
II.1.2.5.3.1 Cuerpos de inclusión de cucumovirus: Los
virus de este grupo tienen partículas isométricas que miden aproximadamente 30 nm de
diámetro. Entre este grupo se encuentra el CMV y el TAV. En muestras de tejidos
infectados con CMV se encontraron muchas inclusiones virales, las cuales no estaban
distribuidas uniformemente. Dichas inclusiones ocurren principalmente en las células
mesófilas, y a veces en la epidermis de la hoja. En estudios efectuados con secciones
delgadas de tejido con inclusiones masivas se encontró que había grandes cantidades de
partículas virales agrupadas. Estos agregados principalmente se encontraban en la
vacuola central, y ocasionalmente en el citoplasma (Christie y Edwardson 1994).
La tinción con azure A de hojas de tomate infectadas con TAV muestran
inclusiones grandes de color rojo-violeta. Estas inclusiones ocurren predominantemente
en el mesófilo, así como las inclusiones del CMV. Los estudios con secciones finas de
tejidos revelan arreglos virales en el citoplasma y agregados pequeños dentro de la
vacuola central (Christie y Edwardson 1994).
II.1.2.5.3.2 Cuerpos de inclusión de tospovirus: El TSWV
pertenece al grupo de los tospovirus de la familia Bunyaviridae. Las partículas de TSWV
se agregan en pequeños grupos dentro del citoplasma y del retículo endoplasmático. Se
han observado masas densas de material proteináceo dentro del citoplasma de la Datura
stramonium y de la Nicotiana benthamiana (Christie y Edwardson 1994).
II.1.2.5.4 Geles de poliacrilamida con electroforesis (PAGE). Esta
técnica sirve para analizar ssRNA y dsRNA asociado a infecciones virales; este método
ha sido muy efectivo para el análisis de virus y viroides en crisantemo. Han sido
altamente eficientes para la detección de ChSV en tejidos infectados (Horst y Kawamoto
1980).
NÚCLEO
CUERPOS DE
INCLUSIÓN DE ARN
(FUSCIA).
34
Esta electroforesis conlleva el uso de un gel de agarosa desnaturalizante ya que el
ARN forma estructuras secundarias extensivas vía apareamiento de bases
intramoleculares, y esto previene la separación estrictamente por tamaño
(http://www.ambion.com/techlib/append/ supp/rna_gel.html). La figura 24 muestra el
principio de la electroforesis de poliacrilamida.
Figura 24: Esquema de electroforesis de poliacrilamida (PAGE).
Fuente: http://www.answers.com/topic/sds-polyacrylamide-gel-electrophoresis.
Microscopia electrónica: Tiene limitaciones cuando se remueven partes de la planta con
una cantidad baja de virus o si están restringidos a los haces vasculares. La preparación
de las muestras para su observación no es compleja pero requiere de personas con
conocimiento sobre el funcionamiento y la forma de identificación de las partículas
virales y cuerpos de inclusión en las muestras. En Guatemala no existe microscopio
electrónico.
35
PARTE III
III. RESULTADOS
Durante los viajes de campo se visitaron tanto plantaciones a campo abierto como
plantaciones techadas e invernaderos cerrados (figura 25). En todas ellas se detectaron
síntomas de infecciones virales.
Figura 25. Vistas de plantaciones de crisantemos protegidos y a campo libre en San
Pedro y San Juan Sacatepéquez.
a) invernadero cerrado visitado en la zona 3, San Pedro Sacatepéquez (fuente: 088-2006); b) plantación
techada visitada en el área de San Juan (fuente: 088-2006; c) plantación a campo abierto visitada en la
aldea Bellavista en San Pedro Sacatepéquez (fuente: 088-2006).
En total se colectaron 288 muestras de plantas con sintomatología parecida a la
producida por los diferentes virus trabajados (Figura 26). Entre los síntomas
identificados como de infección virótica se encontraban: clorosis intervenal, con un claro
oscurecimiento de las venas (figura 26b), amarillamiento y acolochamiento de hojas
nuevas y brotes (figura 26g), manchas necróticas en tallo (figura 26i); deformidades y
marchitamiento de flores (figura 26e y j) y otros.
Figura 26. Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo, éstos son
indicativos de enfermedad y en todos los casos las plantas estaban infectadas con al
menos un virus.
a)
)
a
.
b
.
c
.
Enaciones y deformidad hojas
(FODECYT 088-2006)
a
.
b
. Mosaico (FODECYT 088-2006).
36
Figura 26 (continuación). Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo,
éstos son indicativos de enfermedad y en todos los casos las plantas estaban infectadas
con al menos un virus.
i j
Necrosis en el tallo (FODECYT 088-2006) Enanismo y deformación de la flor
(FODECYT 088-2006)
g
.
h
. Clorosis y deformación hojas (FODECYT
088-2006)
Deformación hojas y clareado de venas
(FODECYT 088-2006)
Mosaico (FODECYT 088-2006)
d
. Moteado (FODECYT 088-2006)
e
.
f
. Necrosis floral (FODECYT 088-2006) Manchas necróticas (FODECYT 088-2006)
c
.
37
Se encontró gran cantidad de ejemplares con clorosis severa en hojas nuevas,
manchas necróticas o necrosis en tallo, reducción de tamaño de la flor. Algunas de las
variedades de cristantemo incluidas en el estudio se pueden apreciar en el Anexo 4.
Se corrieron pruebas ELISA para cinco virus, de los cuales sólo se encontraron
los siguientes tres: Virus de la aspermia del tomate (TAV), Virus del bronceado del
tomate (TSWV) y el Virus B del crisantemo (CVB). La incidencia de estos virus en el
área trabajada se muestra en el cuadro 2. En ninguno de los puntos trabajados se
encontró el virus de la mancha necrótica de impatiens (INSV), ni el virus del mosaico del
pepino (CMV).
El total de infecciones encontradas en los dos municipios (San Juan y San Pedro
Sacatepéquez) se presenta en la gráfica 1. La mayor incidencia fue la de CVB, luego
TAV y finalmente TSWV en los dos municipios muestreados (gráfica 1).
Gráfica 1. Resultados del número de plantas infectadas con alguno de los cinco virus
estudiados en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.
Los números en el cuadro sobre o en las columnas muestra el número de plantas encontradas positivas para el virus
correspondiente. Fuente: FODECYT 088-2006.
Cuadro 2. Incidencia de los tres virus encontrados en el área de estudio
Virus Incidencia (%)
Virus B del crisantemo (CVB) 90%
Virus de la Aspermia del Tomate (TAV) 61%
Virus del Bronceado del Tomate (TSWV) 7% Fuente: FODECYT 088-2006.
Se corrieron pruebas de Ji cuadrado para las frecuencias de aparición de los virus
encontrados en el área de trabajo, así como para la frecuencia de cada uno de ellos en los
38
dos diferentes municipios muestreados, encontrando diferencias significativas en la
primera pero no en la segunda (Cuadro 3).
Cuadro 3. Frecuencia aparición de virus y resultado de la prueba X2
Virus San Juan
Sacatepéquez
San Pedro
Sacatepéquez
X2 Toda la
zona
X2
TAV 63 112 2.42* 175
CVB 99 160 1.31* 259 189.96**
TSWV 12 10 1.48* 22 *X
2(0.95,1)= 3.841
**X2(0.95,2)= 5.991
Fuente: FODECYT 088-2010.
La distribución de estos tres virus en los dos municipios es similar ya que no se
encontró diferencia significativa en sus distribuciones en los municipios individuales sino
sólo en el área muestreada en general. CVB es el virus predominante en el área
muestreada. La distribución para cada virus encontrado se muestra en las figuras 27, 28 y
29.
Figura 27. Mapa de distribución del virus de la aspermia del tomate (TAV) en el área de
San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.
Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: FODECYT 088-2010.
39
Figura 28. Mapa de distribución del virus B del crisantemo (CVB) en el área de San
Juan y San PedroSacatepéquez, Guatemala.
Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: FODECYT 088-2006.
Figura 29. Mapa de distribución del virus del bronceado del tomate (TSWV) en el área
de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.
Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: 088-2006.
La distribución de los virus también fue analizada agrupando los datos según la
altitud a la cual se encontraban los cultivos muestreados. Los dos municipios
muestreados se encuentran a altitudes mayores de de 1500 msnm. Sin embargo, se
usaron dos rangos de altitud con una diferencia de 500 msnm en los dos municipios (área
total) para evaluar si este factor podría tener alguna repercusión en la incidencia o
presencia de los virus. La gráfica 2 muestra el comportamiento de los tres virus a las
40
diferentes altitudes. El cuadro 4 muestra el número de plantas infectadas con cada virus a
las diferentes altitudes en San Juan y San Pedro Sacatepéquez.
Gráfica 2. Incidencia de CVB, TAV y TSWV a diferentes rangos de altitudes en San
Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala en 2007.
Fuente: FODECYT 088-2006.
Cuadro 4. Número de plantas infectadas con alguno de los tres virus encontrados según
rango de altitudes en ambos departamentos.
Fuente: FODECYT 088-2006.
En estos resultados se puede ver que el factor altitud no presenta ningún efecto
significativo en la distribución de los virus en los cultivos de crisantemo. La diferencia
de altitud no es un factor que esté afectando en estos lugares para la incidencia de los
virus. En ambos lugares a pesar de la diferencia de altitudes hay infección en cantidades
similares. La altitud no es un factor que pueda explicar la presencia de los virus en estos
lugares.
ALTITUD – msnm CVB TAV TSWV
1500 a 2000 109 72 12
>2000 150 101 10
TOTAL 259 173 22
41
En la gráfica 3 se puede observar la infección por un sólo virus en las plantas
muestreadas. De las 99 muestras encontradas con infección de 1 sólo virus, 89 mostraron
infección por CVB. Esta gráfica pone de manifiesto más aún, la importancia que CVB
tiene en estas plantaciones.
Gráfica 3. Porcentaje de la presencia de los tres virus encontrados en plantas infectadas
con 1 sólo virus.
Los números en los cuadrados representan el número de plantas encontradas con el virus respectivo.
Fuente: FODECYT 088-2006
La mayor parte de infecciones en los crisantemos no se encontraron aisladas, es
decir, no fue un sólo virus el encontrado en cada planta. Usualmente, se encontró
infecciones por 2 ó más virus (infecciones mixtas). Esto indica que los vectores
respectivos en el campo pueden no ser sólo 1 o según sea el vector para cada virus, los
vectores pueden transmitir más de un virus a las plantas. En la gráfica 4 se muestra el
porcentaje de infecciones por 1 o más tipos de virus (infecciones mixtas) a las plantas del
estudio comparado con las plantas sanas que se detectaron en el estudio.
42
Gráfica 4. Porcentaje de plantas de crisantemo infectadas por uno, dos y tres virus en
San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.
Fuente: FODECYT 088-2006.
En vista que las infecciones mixtas y, sobre todo, las de dos virus fueron tan altas,
se analizó cuáles eran las parejas de virus presentes en las plantas. La gráfica 5 muestra
el porcentaje de veces que se encontraron los diferentes virus relacionados. Se puede
observar que la relación entre CVB y TAV es predominante. La relación entre TSWV y
CVB no es tan importante, pero debemos tomar en cuenta que el TSWV en la época que
muestreamos los crisantemos no tuvo una incidencia muy alta (2007). La relación entre
TAV y TSWV no se encontró.
Los casos de infecciones triples fueron 17 (5.90%) de las cuales 9 infecciones se
encontraron a menos de 2000 msnm y 8 infecciones se encontraron a más de 2000 msnm.
Esto indica que no hay diferencia entre las altitudes en cuanto a la posibilidad que existan
infecciones mixtas por 3 virus. En la gráfica 6 se presenta la incidencia de infecciones
simples y mixtas, pero haciendo diferencias por rango de altitud. La barra para plantas
sanas representa el número de plantas sanas que se encontró en este estudio para cada
rango de altitud. El cuadro 5 muestra la cantidad de plantas que está representada en
cada barra de porcentaje de la gráfica 6.
43
Gráfica 5. Porcentaje de plantas infectadas con CVB-TAV, CVB-TSWV y TAV-
TSWV.
Fuente: FODECYT 088-2006.
El número en el cuadrado representa las plantas encontradas con la pareja de virus al mismo tiempo.
Gráfica 6. Porcentaje de infecciones por 1,2 ó 3 virus comparadas con las sanas en los
dos rangos de altitud muestreado en los municipios de San Juan y San Pedro
Sacatepéquez, Guatemala, durante 2007.
Fuente: FODECYT 088-2006.
44
Cuadro 5. Número de plantas según cada categoría mostrada en la gráfica 6.
Fuente: FODECYT 088-2006.
La diferencia entre altitudes para encontrar infecciones mixtas por uno o tres virus
no es tan relevante en estos dos rangos de altitud. Sin embargo, la incidencia de
infecciones por dos virus tiende a ser más relevante aunque no sea significativa. Lo que
sí podemos apreciar es que a rangos de altitud mayores a 2000 msnm, tiende a haber
mayores problemas con infección y hay menos plantas sanas que en el rango de altitud
más bajo.
Se realizaron tres inoculaciones a plantas indicadoras. El primer lote estaba
compuesto por la batería estándar que se usa en el Laboratorio de Protección Vegetal (L.
esculentum, D. stramonium, C. quinoa, N. tabacum y C. amaranticolor). No se
obtuvieron resultados positivos (síntomas) en estas plantas, por lo que se cambió la
composición de indicadoras utilizadas tomando en cuenta las recomendadas para el
estudio de cada uno de los virus trabajados (cuadro 6). El segundo y tercer lote de
plantas inoculadas tampoco presentaron síntomas. En la última inoculación se realizaron
también algunos injertos en tomate; estas plantas presentaron algunos síntomas (figura
30). El tomate es hospedero susceptible para los tres virus, los síntomas encontrados en
tomate después de la injertación no fueron típicos de ninguno de los tres virus inoculados.
Esto se debe a que los tres virus producen en tomate clorosis, enaciones, deformación de
las hojas y enanismo. Sin embargo, nos mostró la presencia de estos virus en las
muestras injertadas ya que coinciden con los síntomas de los crisantemos injertados sólo
que en grado diferente. La identidad de los virus se hizo por ELISA más adelante.
Cuadro 6. Plantas indicadoras utilizadas y virus inoculados Inoculación Especie TAV CBV CMV TSWV INSV
1 Lycopersicum esculentum X X
1 Datura stramoniun X X
1 Chenopodium quinoa X X
1 C. amaranticolor X X
1 Nicotiana tabacum X X
2 y 3 Nicotiana clevelandii X X X
2 y 3 N. tabacum X X X X
2 y 3 N. glutinosa X X X
2 y 3 Lycopersicum esculentum X X X
2 y 3 Datura stramonium X X X
2 y 3 Phaseolus vulgaris X X X Fuente: FODECYT 088-2006.
la planta fue inoculada con el virus
X la planta no fue inoculada con el virus
Msnm Sanas
Infección
1 virus
Infección
2 virus
Infección
3 virus
1500-2000 12 49 59 9
>2000 6 50 94 8
Totales 18 99 153 17
45
Figura 30. Síntomas presentados por plantas de tomate injertadas con crisantemo
contaminado con TAV, CVB y TSWV
Fuente: FODECYT 088-2006. Fuente: FODECYT 088-2006.
Clorosis y deformación de la hoja. Enaciones y deformación de la hoja.
46
III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Durante los viajes de campo se visitaron tanto plantaciones a campo abierto como
plantaciones en invernaderos cerrados o al menos techados. En todos los casos se
encontraron plantas con síntomas de infecciones por virus aunque en diferente medida.
Al parecer la severidad con que la plantación se ve afectada se relaciona con la cantidad
de insectos (potenciales vectores) que viven y se alimentan en ellas. La cantidad de los
mismos está directamente relacionada con el grado de protección que tenga la plantación.
En invernaderos cerrados y con buen control prácticamente no se encontraban insectos,
pero en aquellos a campo abierto o solamente techados los había en abundancia. Sin
embargo, esto no se midió estadísticamente durante la ejecución de este trabajo.
La utilización de síntomas para recoger el material de campo fue difícil ya que
cada una de las variedades de crisantemo encontradas presentan distintos patrones de
crecimiento, color, tamaño y forma tanto en tallo como en hojas. A pesar de esto, se
pudo distinguir un patrón de clorosis que en todos los casos presentaron plantas que
resultaron positivas para TAV. Este patrón se puede observar en la figura 31.
Figura 31. Clorosis y mosaico en crisantemos con TAV.
Fuente: FODECYT 088-2006. Fotos tomadas por miembros del Laboratorio de Protección
Vegetal.
En el caso de TSWV se pudo identificar que la mayoría de muestras con manchas
necróticas (no con coloración morada) estaban infectadas con este virus, sin embargo, se
presentaron casos en que los síntomas no estaban presentes y la prueba fue positiva. Esto
fue importante porque la variedad de crisantemo Shasta (anexo 4) presentan de manera
natural manchas con coloración morada en el tallo durante su desarrollo y se confunden
con los síntomas virales si no se tiene experiencia. Este virus, TSWV, produce manchas
necróticas de color café, no moradas pero es muy fácil confundirlas. A diferencia de los
síntomas de TAV y CVB, aquí predomina la necrosis que la clorosis o mosaico. La
figura 32 muestra algunos síntomas relacionados a TSWV en crisantemo.
47
Figura 32. Síntomas de necrosis tanto en tallo como en hojas producidas en la
infección por TSWV en crisantemo.
Fuente: FODECYT 0-88-2006. Fotos tomadas por miembros del Laboratorio de Protección
Vegetal.
La enfermedad llamada “cáncer” o “tizón”por los cultivadores puede ser confusa
ya que según sea el lugar y los síntomas que se presenten, puede referirse a una
enfermedad causada por virus (TSWV) o a una enfermedad causada por bacterias
(Erwinia chrysanthemi) o a una enfermedad causada por hongos (Alternaria sp. o
Alternaria chrysanthemi Simmons). En San Juan y San Pedro Sacatepéquez puede
deberse a cualquiera de las causas antes mencionadas pero durante el período previo al
inicio del estudio y durante la primera colecta, se debió principalmente al virus TSWV.
Esto se puede aseverar basado en resultados obtenidos mediante pruebas de ELISA en el
laboratorio de Protección Vegetal y a los resultados negativos que se obtuvieron en
cultivos para bacterias y hongos. Los síntomas encontrados en el campo la mayor parte
del tiempo fueron similares a los presentados en la figura 32 y no como los presentados
en la figura 33 que son producidos por Erwinia chrysanthemi o por Alternaria sp. Los
síntomas producidos por Erwinia chrysanthemi son síntomas más acuosos y parecen más
una pudrición que los síntomas producidos por TSWV y los síntomas que produce
Alternaria chrysanthemi, son manchas más secas y mejor delimitadas que las producidas
por TSWV. En las figura 33 se pueden ver los tres casos. La figura 33a. salió positiva
para TSWV pero también salió positiva para CVB y TAV. Se pueden ver claramente los
48
patrones de necrosis que corresponden a TSWV y los patrones de clorosis y deformación
de las hojas que corresponden a CVB. Este es un claro ejemplo de una infección mixta
de virus que se encontró en el campo. Por el otro lado, también se encontraron plantas
que no presentaron síntomas de ningún tipo y salieron positivas para TAV y CVB. Esto
puede deberse a que la concentración de virus necesaria para que la prueba de ELISA
detecte al virus es baja, por lo tanto puede detectarlos aún antes de que la planta presente
sintomatología. Es importante notar que aunque la planta no presente síntomas, no quiere
decir que el tamaño de la flor no se verá afectada durante la floración.
Figura 33. Síntomas de TSWV, CVB, Erwinia chrysanthemi y Alternaria
chrysanthemi.
A- Síntomas de TSWV y CVB, foto tomada por Protección Vegetal (Fuente: FODECYT 088-2006). B-
Síntomas de Erwinia chrysanthemi con manchas bastante acuosas y grandes. Tomado de
www.eppo.org/.../ERWICH_images.htm. C- Sintomas de Alternaria chrysanthemi con manchas secas,
concéntricas y bien delimitadas. Tomada de www.forestryimages.org/search/action.cfm?q=cl.
Como puede verse en los mapas elaborados, en todas las plantaciones se
encontraron los virus de la aspermia del tomate, el virus B del crisantemo y el virus del
bronceado del tomate, siendo los dos primeros los de mayor incidencia. Para Guatemala
no está formalmente reportada la presencia y/o frecuencia para ninguno de los tres virus
A
B
C
49
en crisantemo. Solamente TSWV ha sido reportado para tomate. La presencia de estos
virus consideramos que debe ser monitoreada porque en realidad no se conoce la relación
que tiene con diferentes factores que intervienen en un cultivo como lo es lluvia,
temperatura, vectores, manejo de las plantaciones, etc. Solamente se pudo identificar que
TSWV había sido un gran problema en años anteriores en crisantemo pero no se sabía su
relación con CVB o TAV. Tampoco se conoce si la infección de estos virus es estacional
o permanentes. Por lo encontrado, el CVB es un virus que ya se ha establecido y al
parecer el TAV se ha establecido pero la mayor parte del tiempo en asociación con CVB,
únicamente en el 5% de los casos fue encontrado aislado, en el resto de los casos fue
encontrado en asociación con el CVB. Otros estudios como el llevado a cabo por Chung
et al. 1999, quien estudió la incidencia de CVB y TAV en crisantemo en Korea, también
encontró que la incidencia de CVB fue de 97.5%, que TAV no fue encontrado aislado
sino en todos los casos en co-infección con CVB (20.9% de los casos). En Guatemala, se
evaluaron 285 plantas de crisantemo para estos dos virus y se encontró que sí había
presencia de TAV aislado en crisantemo en un 3% pero la total detección de TAV en
crisantemo fue de 61%, lo cual indica que el 58% se encontró en infección mixta con
CVB. El total de infección de CVB fue un poco más bajo que en Korea (97.2%), fue de
90.5% pero el 32.6% fue lo que se presentó libre de TAV. Esta relación es muy estrecha
y alta por lo visto no sólo en Guatemala, por lo que sería muy interesante poder estudiar
más profundamente qué tipo de relación existe entre estos dos virus. Finalmente, no se
encontró ninguna relación entre TAV y TSWV.
A pesar de estar ampliamente distribuidos, el CVB y el TAV, los agricultores
consideran que no afectan al crecimiento y producción de flores de corte en las
localidades visitadas. Sin embargo, ellos no consideran el debilitamiento que puede
sufrir una planta ante una infección viral y la facilidad con que otras enfermedades
pueden afectarles. Tampoco están considerando al parecer, la deformidad que están
sufriendo las plantas y el tamaño reducido de la flor que al principio no se observa, pero
poco a poco se va perdiendo el tamaño original y la especie del crisantemo sufre
modificaciones, muchas veces permanentes, no pudiendo recuperar las características
originales de la variedad.
También se puede observar de los resultados obtenidos, que los síntomas aislados
de cada virus fueron imposible de obtener. La mayoría de los casos presentaba
infecciones mixtas. Es necesario poder aislar la sintomatología para poder identificar a
los virus en el campo pero en estos campos no fue factible, especialmente si el TAV y el
CVB son transmitidos por el mismo vector, áfidos. Este vector puede estar ya infectado
con los dos virus al mismo tiempo aunque para comprobarlo haría falta continuar con el
presente estudio y enfocarse a los vectores y a estudios de invernadero para aislar los
virus mediante plantas indicadoras y detectarlos mediante pruebas serológicas y/o
moleculares. La caracterización de los síntomas en plantas indicadoras no tuvo
resultados positivos, esto se debe principalmente a dos motivos, el primero son las
infecciones mixtas (157 de las 287 plantas tienen dos virus y 17 tres), lo que hace
sumamente difícil aislar los virus para observar el desarrollo de síntomas característicos
del virus en ella. Los síntomas que produce cada virus en sí, son poco diferentes y por
50
esto no fue posible encontrar un hospedero común al que sólo le afectara uno de los virus
para aislarlo, sobre todo para CVB y TAV.
El TSWV en cambio, es transmitido por trips. Este vector adquiere el virus en su
etapa ninfal y lo transmite de adulto. La presencia de TSWV indicaría que el virus ha
estado ya por algún tiempo, al menos durante un ciclo de vida del trips, presente en las
plantaciones. Para TSWV, sí se obtuvieron síntomas típicos como lo es el bronceado de
la hoja en tomate así como manchas necróticas en plantas de tomate pero no en otros
hospederos. Este es un virus muy lábil y quien hace el procedimiento debe hacerlo
rápidamente para que el virus no se degrade.
Una consideración importante para el trabajo llevado a cabo en los invernaderos
fue su temperatura interna. En esa época todavía no estaba bien controlada ésta ya que el
sistema de enfriamiento se estaba probando. La temperatura es un factor muy importante
para la transmisión del virus, pero es más importante para la aparición de síntomas. Si la
temperatura es alta, los síntomas no aparecen aunque la planta salga positiva en una
prueba de ELISA.
Al correr pruebas de Ji cuadrado a las frecuencias de aparición del virus, se
obtuvo que hay diferencias significativas en la frecuencia de aparición de los tres virus en
toda el área de trabajo, pero al correr la prueba para comparar las frecuencias de aparición
de cada uno de ellos en las dos localidades (cuadro 3), se encontró que no hay diferencias
significativas en las mismas, lo que indica que aunque su incidencia es diferente, su
distribución en ambos municipios es bastante homogénea. Esto es importante porque se
puede deducir de estos datos que el problema viral en los dos municipios es bastante
similar y sobre todo que es posible que la causa sea la misma. Este resultado se ve
apoyado al observar las figuras 27, 28 y 29, ya que los tres virus se encuentran en todos
los puntos muestreados, siendo la principal diferencia la incidencia. Consideramos que
como estos virus son transmitidos o pueden ser transmitidos mecánicamente, la
homogeneidad de su distribución en el área puede deberse a la utilización de esquejes
para propagación, que es la forma que todos los agricultores de estos municipios usan
para continuar con sus plantaciones año con año. Ellos no inician de semillas.
Generalmente cada productor genera sus esquejes a partir de las plantas que posee, pero
en ocasiones los obtienen de plantaciones de otras áreas, y esto ayuda a que los virus
puedan moverse con mayor efectividad y a que se mantengan dentro del área a pesar de
utilizar insecticidas u otras formas de manejo y control. Otra causa puede ser las malas
prácticas dentro de los invernaderos en lo que se refiere a higiene en el manejo de las
plantas, desinfección de manos, herramientas de trabajo y otras.
51
52
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES:
El método de ELISA sirvió para detectar los virus presentes en las plantaciones de
San Pedro y San Juan Sacatepéquez y resultó ser un método fácil y bastante
sensitivo para la detección de los virus.
Los virus presentes en plantaciones de crisantemo de San Pedro y San Juan
Sacatepéquez fueron: El virus del bronceado del tomate o TSWV presente en un
7%, el virus de la aspermia de tomate o TAV presente en un 61% y el virus B del
crisantemo o CVB presente en un 90% de las muestras.
Los síntomas más relacionados a la presencia de CVB y TAV son la clorosis y
deformación de las hojas o flores, en crisantemo. Los síntomas en plantas
indicadoras no pudieron aislarse para cada uno de estos virus pero en ambos
casos, tanto la necrosis como la clorosis predominaron.
Los síntomas más relacionados a la presencia del TSWV son los síntomas de
necrosis en los tallos, hojas, en plantas indicadoras y en tallos, hojas y flores, en
crisantemo.
La distribución de los tres virus en los dos municipios es similar ya que no se
encontró diferencia significativa en sus distribuciones en los municipios
individuales sino sólo en el área muestreada en general. En el trabajo se
presentan los mapas (figuras 27, 28 y 29) en donde se muestra la distribución de
dichos virus.
Se elaboró un manual en forma de trifoliar con los resultados obtenidos e
información sobre los virus encontrados que puede ser de utilidad para los
agricultores.
El virus B del crisantemo es el virus predominante en los campos de crisantemo
en los municipios de San Juan y San Pedro Sacatepéquez.
En todas las plantaciones de crisantemo muestreadas se encontró la presencia de
virus. No hay plantación libre de éstos.
La mayoría de virus se encontró en infecciones mixtas y de estas asociaciones
predominó la asociación de dos virus en la misma planta (57%). La asociación
por tres virus fue de únicamente 6% y la presencia de un solo virus fue en 37% de
los casos.
La hipótesis nula que dice que no hay presencia de virus en crisantemos en las
localidades de San Juan y San Pedro Sacatepéquez queda descartada porque sí se
encontró infección por virus en el 93% de los casos analizados.
La hipótesis nula que establece que la distribución de los virus en San Juan y San
Pedro Sacatepéquez no es uniforme, también queda descartada porque como se
vio en los mapas anteriores (figuras 27,28 y 29), la distribución de estos es
bastante uniforme.
53
IV.2 RECOMENDACIONES
Es importante que los agricultores de esta área inicien sus plantaciones utilizando
material libre de virus, de lo contrario las enfermedades provocadas por los virus
o por algunas bacterias permanecerán en los campos y en la región. Las
variedades originales de crisantemo producidas pueden desaparecer o cambiarán
su calidad modificándose en tamaño, forma o color de la flor así como las
características de la planta. Otra alternativa es que desaparezcan algunas
variedades (ej. Bombón y amarillo pache) porque no se podrían producir y se
sustituirían por variedades más resistentes, pero quizá no con las características
que se quisieran.
Pueden utilizar material proveniente de cultivo de teiidos y verificado que esté
libre de patógenos.
Deben establecer una plantación madre con estos crisantemos provenientes de
cultivo de tejidos y colocarlos en un invernadero que llene los requisitos
necesarios para que no ingresen vectores y con las normas de calidad necesarias
para el buen manejo de las plantaciones.
Es necesario capacitar a los agricultores sobre el manejo y propósito de los
invernaderos para hacer efectivo el uso de los mismos.
Se deben monitorear los virus y los vectores en las plantaciones para establecer
épocas críticas y de esta manera minimizar el daño que producen a las
plantaciones.
Es necesario aprender a evitar la transmisión mecánica de los virus dentro del
invernadero para evitar la presencia de virus transmitidos de esta manera.
Es necesario que se capacite a los agricultores en lo que son enfermedades virales
principalmente y sobre todo en su relación con los vectores y sus formas de
transmisión.
Es importante colaborar con los agricultores para establecer planes de manejo del
cultivo, principalmente dirigidos a prevención y adecuados a los problemas que
presentan.
54
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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59
IV.4 ANEXOS
60
Anexo 1. Cuadro de ingresos de las muestras colectadas en campo y resultados
obtenidos.
No.
Campo
ID lab X Y Msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
1 1 -90.700767 14.714350 1955 0 1 0 1 0
2 2 -90.677917 14.709450 1858 0 1 0 1 0
3 3 -90.677917 14.709450 1789 0 1 0 1 0
4 4 -90.677983 14.710150 1868 0 1 0 1 0
5 6 -90.700783 14.714117 1960 0 1 0 1 0
6 7 -90.677917 14.709450 1790 0 1 0 1 0
7 8 -90.700783 14.714133 1494 0 0 0 0 0
8 9 -90.677983 14.710150 1862 0 1 0 1 1
9 10 -90.676283 14.710117 1868 0 1 0 1 1
10 11 -90.691133 14.709483 1876 0 1 0 1 0
11 12 -90.676417 14.710183 1869 0 1 0 1 0
12 13 -90.676550 14.710217 1869 0 1 0 1 0
13 14 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0
14 15 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0
15 16 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 1 0
16 17 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 1 0
17 18 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0
18 19 -90.640650 14.705383 1759 0 0 0 1 0
19 20 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0
20 21 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0
21 22 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 0 0
22 23 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0
23 24 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0
24 25 -90.640650 14.705383 1759 0 0 0 1 0
25 26 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 1
26 27 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0
27 28 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0
28 29 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 1
29 30 -90.649300 14.710833 1802 0 0 0 1 0
30 31 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0
31 32 -90.649170 14.694333 2037 0 1 0 1 0
32 33 -90.649170 14.694333 2037 0 1 0 1 0
33 34 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0
34 35 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0
61
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
35 36 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0
36 37 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0
37 38 -90.662867 14.727550 1706 0 0 0 1 0
38 39 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0
39 40 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0
40 41 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0
41 42 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 1
42 43 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0
43 44 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0
44 45 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0
45 46 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 1 0
46 47 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 1 0
47 48 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0
48 49 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0
49 50 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0
50 51 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0
51 52 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 0 0
52 53 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 0 0
53 54 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
54 55 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
55 56 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
56 57 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
57 58 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
58 59 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
59 60 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0
60 61 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0
61 62 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0
62 63 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0
63 64 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0
64 65 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0
65 66 -90.640633 14.689417 2049 0 1 0 1 1
66 67 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
67 68 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
68 69 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
69 70 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
70 71 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
71 72 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
62
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
72 73 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
73 74 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
74 75 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
75 76 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
76 77 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
77 78 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 1
78 79 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
79 80 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
80 81 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
81 82 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
82 83 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
83 84 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
84 85 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
85 86 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 R 0
86 87 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0
87 88 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0
88 89 -90.631383 14.727950 1770 0 0 0 0 0
89 90 -90.631383 14.727950 1770 0 0 0 0 0
90 91 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
91 92 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
92 93 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
93 94 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
94 95 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
95 96 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0
96 97 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0
97 98 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0
98 99 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
99 100 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0
100 101 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
101 102 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 1
102 103 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
103 104 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0
104 105 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
105 106 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
106 107 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
107 108 -90.633617 14.727633 1781 0 R 0 0 0
108 109 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0
63
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
109 110 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
110 111 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 1
111 112 -90.633617 14.727633 1781 0 R 0 1 0
112 113 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0
113 114 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 1
114 115 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0
115 116 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0
116 117 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0
117 118 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0
118 119 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0
119 120 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0
120 121 -90.633650 14.727733 1783 0 1 0 0 0
121 122 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0
122 123 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0
123 124 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0
124 125 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0
125 127 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
126 128 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
127 129 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
128 130 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
129 131 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 1 0
130 132 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
131 133 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
132 134 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
133 135 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
134 136 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0
135 137 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
136 138 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
137 139 NST NST NST 0 0 0 0 0
138 140 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
139 141 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
140 142 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
141 143 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 1 0
142 144 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0
143 145 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0
144 146 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
145 147 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 1
64
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
146 148 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0
147 149 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 0 0
148 150 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 0 1
149 151 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 1 1
150 152 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0
151 153 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0
152 154 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
153 155 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
154 156 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
155 157 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
156 158 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
157 159 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
158 160 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
159 161 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
160 162 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 0 0
161 163 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
162 164 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
163 165 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
164 166 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
165 167 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 1
166 168 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
167 169 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
168 170 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 0
169 171 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0
170 172 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
171 173 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
172 174 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0
173 175 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0
174 176 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 1
175 177 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
176 178 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 0 0
177 179 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
178 180 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 1
179 181 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0
180 182 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
181 183 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
182 184 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
65
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
183 185 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 1
184 186 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 1
185 187 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0
186 188 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 0
187 189 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 1 0
188 190 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0
189 191 -90.645533 14.680083 2080 0 0 0 0 0
190 192 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0
191 193 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0
192 194 -90.645533 14.680083 2080 0 0 0 1 0
193 195 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 1 0
194 196 -90.657600 14.673267 2115 0 0 0 1 Sd
195 197 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0
196 198 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0
197 199 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0
198 200 -90.657967 14.681500 2147 0 1 0 1 0
199 201 -90.657967 14.681500 2147 0 0 0 0 Sd
200 202 -90.657967 14.681500 2147 0 1 0 0 0
201 203 -90.657967 14.681500 2147 0 0 0 0 0
202 204 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0
203 205 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0
204 206 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0
205 207 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0
206 208 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0
207 209 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0
208 210 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0
209 211 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0
210 212 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0
211 213 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
212 214 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0
213 215 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
214 216 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
215 217 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
216 218 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0
217 219 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
218 220 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
219 221 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
66
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
220 222 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
221 223 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0
222 224 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
223 225 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
224 226 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
225 227 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
226 228 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0
227 229 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0
228 230 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
229 231 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0
230 232 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0
231 233 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
232 234 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
233 235 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
234 236 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
235 237 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0
236 238 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0
237 239 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
238 240 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
239 241 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0
240 242 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
241 243 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
242 244 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
243 245 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
244 246 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
245 247 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0
246 248 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0
247 249 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
248 250 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
249 251 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
250 252 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
251 253 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
252 254 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
253 255 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 1
254 256 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
255 257 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 1
256 258 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0
67
Continuación anexo 1.
No.
Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV
257 259 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0
258 260 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
259 261 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
260 262 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
261 263 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
262 264 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
263 265 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
264 266 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0
265 267 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
266 268 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
267 269 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
268 270 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
269 271 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
270 272 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0
271 273 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
272 274 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
273 275 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
274 276 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0
275 277 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
276 278 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0
277 279 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 1
278 280 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0
279 281 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
280 282 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
281 283 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
282 284 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0
283 285 -90.669933 14.707433 1902 0 1 0 1 0
284 286 -90.669933 14.707433 1902 0 1 0 1 0
285 287 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0
286 288 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0
287 289 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 1
288 290 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0
0 = ausencia de virus
1 = presencia de virus
NST= no se tomó
68
Anexo 2. ELISA DIRECTO FOSFATASA ALCALINA PARA LA DETECCIÓN
DE VIRUS.
1. Anticuerpo de cobertura (para 96 pozos):
En un beaker colocar:
10 ml de buffer de cobertura
50 l de anticuerpo (Agdia)
Agitar por aproximadamente 10 minutos
Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape.
Incubar en cámara húmeda por 4 horas o toda la noche a 4o C.
2. Preparación de muestras
Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras
máximo, más los controles positivo y negativo.
En un tubo:
pesar 0.1 g de cada muestra
agregar 1.0 ml de buffer de extracción directo
Macerar
3. Lavado de la placa
Se utiliza el lavador de placas automático BIORAD ImmunoWash modelo 1575. Se
emplea PBST como solución de lavado.
4. Colocación de muestras
Colocar en dos pozos buffer de extracción directo lo cual servirá de blanco.
Realizar el mapa en duplicado.
Colocar control positivo de Agdia® (si no hay control positivo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja infectada)
Colocar control negativo de Agdia® (si no hay control negativo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja no infectada)
Colocar 100l de cada muestra en el pozo respectivo y en duplicado.
Cubrir con tape
Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente o toda la noche a 4oC
5. Lavado de placa
Véase Paso 3.
6. Anticuerpo Conjugado
En un beaker colocar (para los 96 pozos, sino ver cálculos en el paso 1):
10 ml de buffer de conjugado
50 l de anticuerpo conjugado
Agitar por 10 minutos.
Agregar 100l a cada pozo, cubrir con tape.
Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente.
69
7. Lavado de placa
Véase paso 3
8. Revelado de la placa
Agregar una pastilla de PNP (fosfatasa Alcalina) para cada 5ml de buffer de revelado,
disolverlo hasta desaparecer la pastilla.
Agregar 100ul de esta preparación a cada pozito y colocar la placa en camara
obscura (sin tape) por una hora
9. Lectura de placa
Se hacen de dos a tres lecturas (una hora, dos horas y/o hasta tres horas después de
agregado el sustrato y si es necesario a 405nm.
70
Anexo 3. MÉTODOS DE TRANSMISIÓN DE VIRUS A PLANTAS
INDICADORAS.
Inoculación mecánica. Se pretende exponer a una planta sana indicadora con un
extracto de material vegetal de una planta enferma. Hay una gran variedad de
amortiguadores o búfers utilizados para inoculación dependiendo del virus que se
trate. El que más se utiliza es el Búfer de Fosfato de sodio dibásico y monobásico
(Na2HPO4) 0.01M-0.1 M, pH 8.0.
1. Macerar hojas de plantas infectadas o posiblemente infectadas
(muestra de campo) con Búfer y un poco de carborundum (600 mesh.).
1. Espolvorear carborundum (romper paredes celulares) a las hojas que
se van ha inocular en la planta indicadora.
2. Frotar las hojas de las plantas a inocular con la solución preparada
(búfer + planta).
3. Dejar a la planta reposar durante 5-10 min.
4. Lavar la planta por completo con agua destilada
5. Cada vez que se va ha inocular una nueva planta con un virus o
muestra diferente, se debe limpiar completamente el área y lavar las
manos con jabón.
6. Depositar las macetas en las mesas a 15 cms. Entre macetas para evitar
el contacto entre ellas. Las macetas deben estar en platillo
desinfectados (Cloro 10%), para evitar la contaminación del área a la
hora de regar.
7. Se debe evitar la aplicación de agroquímicos quemantes, ataques de
insectos, enfermedades, para evita la confusión de daños producidos
por estos y, que la identificación de la enfermedad sea lo más
confiable posible.
Inoculación por inyección. Se inyecta a una planta sana indicadora con un
extracto de material vegetal de una planta enferma. Se utiliza el mismo búfer
utilizado en la inoculación mecánica. Esto se asemeja a la infección por vectores.
Es muy útil para transmitir virus altamente inestables que se encuentran
encapsulados en el xilema o en el floema.
71
Anexo 4 Algunas variedades de crisantemo encontradas durante el estudio en San
Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.
Chrysanthemum x grandiflorum (Euro) –
Polar blanca Chrysanthemum x grandiflorum (Pompon
Furore) – Centro verde
Chrysanthemum x grandiflorum (Poser)-
Penileño
Chrysanthemum x grandiflorum no
clasificada (Lemon Fiji) – Polar amarilla
Chrysanthemum leucanthemum - Shasta Chrysanthemum x grandiflorum (Penine
Marie)- Moradita
72
Anexo 4. Continuación.
Chrysanthemum weyrichii (Yellow
bomb)- Chao mein
Chrysanthemum x grandiflorum
(Pompon, Furore)-Pinocho
Chrysanthemum x grandiflorum (Yellow
Biarritz)- Lagrimita
Chrysanthemum x grandiflorum (Fiji)-
Amarillo pache.
Chrysanthemum x grandifolium (Gold
Creamest)- Bombón amarillo
Chrysanthemum leucanthemum -
Margaritón
73
Anexo 4. Continuación.
Fuente: FODECYT 088-2006. Nombres tomados de: Hogan, 2003.
Chrysanthemum x grandifolium (Single
Poser) - Rosado
Chrysanthemum x grandifolium (Spoon
Dublin) - Rojo