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Edición Genómica: La tecnología CRISPR-Cas9 y su aplicación en enfermedades humanas
Patricia Hinojar Merín1, Elvira Román Gónzalez2
1Grado en Farmacia UCM, 2Departamento de Microbiología II, UCM
INTRODUCCIÓN
El sistema consta de dos componentes: • Cas9: endonucleasa más ampliamente estudiada y u1lizada en la
tecnología CRISPR. Realiza un corte de doble cadena, que posteriormente es reparado por recombinación homóloga (HDR) o recombinación no homóloga (NHEJ) Para realizar el corte, Cas9 debe hallarse con1gua a la secuencia PAM (NGG), presente en la secuencia diana, que provoca un cambio conformacional en la enzima.
• gRNA: Complementario a la secuencia que se desea modificar, guía a Cas9 a la secuencia diana.
El descubrimiento del sistema CRISPR-‐Cas9 y su aplicación en la edición genómica ha tenido un enorme impacto en una amplia diversidad de áreas de inves1gación. Actualmente, representa el método más extendido en inves1gación para generar modelos de ratón que recapitulen la patología de múl1ples enfermedades humanas. La versa1lidad, eficacia y sencillez del sistema a la hora de generar dichos modelos experimentales, ha posibilitado el desarrollo exponencial de estudios aplicados. Entre ellos, se incluyen aquellos diseñados para el ensayo de fármacos
y/o terapias en modelos animales, o aquellos que aplican la edición genómica en combinación con el trasplante autólogo para el tratamiento de enfermedades humanas. En el presente trabajo se ha llevado a cabo la revisión de diversos arVculos relevantes en el campo de la inves1gación clínica. En dicha revisión se pone en relieve el alcance y la importancia de los resultados obtenidos, que postulan a CRISPR/Cas9 como el futuro de la edición genómica en general, y de la terapia génica en par1cular.
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Modificado de Hsu, P.D. et al. (2014)
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OBJETIVOS Eficacia de CRISPR-Cas9 como método de edición genómica El obje1vo del presente trabajo es la realización de una revisión bibliográfica acerca de este método de edición génica, mostrando resultados que reflejan la eficacia del sistema en la edición de células en cul1vo.
Aplicación experimental y clínica de CRISPR-Cas9 en enfermedades humanas Se describen varios casos representa1vos de la aplicabilidad de este sistema para el estudio y tratamiento de enfermedades de diferente naturaleza, con el obje1vo de reflejar la versa1lidad del sistema.
La dependencia del sistema en los sistemas de reparación celulares permite la introducción de inserciones o deleciones (indels), lo que diversifica las posibilidades de edición. Se ha demostrado que Cas9 es altamente eficaz en la introducción de indels así como en la edición bialélica.
Descubrimiento CRISPR Primeras evidencias de aplicación en edición genómica
Expansión
ANTECEDENTES
RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Aplicación de CRISPR-Cas9 para el tratamiento de enfermedades infecciosas
Hemofilia A
Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV)
Beta Talasemia
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Causa de la enfermedad Síntesis anormal (o inexistente) de ß-globina componente esencial de la hemoglobina
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Componentes y funcionamiento de CRISPR-Cas9
Enfermedades víricas
Figura 3.3. Ensayo funcional in vivo de la corrección mediante CRISPR-‐Cas9 de la mutación causante de la enfermedad en el gen de la ß-‐globina. Células procedentes de 2 donantes (sano/enfermo) fueron trasplantadas en un modelo murino de la enfermedad. El ensayo de rescate de expresión de HBB se ensayó en 3 grupos: • niPSCs: células procedentes de donante sano. • ciPSCs: células procedentes de paciente beta talasemia
corregidas mediante CRISPR. • piPSCs: células procedentes de paciente beta talasemia.
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Aplicación de CRISPR-Cas9 para el tratamiento de enfermedades genéticas
Enfermedades hereditarias monogénicas
Causa de la enfermedad (Hemofilia severa) Inversión intrón 1/ intrón 22 gen F8 gen codificante para el Factor de coagulación VIII
Figura 3.1. Corrección de la inversión parcial del gen F8 (intrón1) en CMPIs procedentes de un paciente de Hemofilia A. Ensayo de endonucleasa T7 para RGEN01. (b) PCR de los clones modificados por CRISPR-‐Cas9 y sus respec1vos controles posi1vo y nega1vo.
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Figura 3.2. Rescate funcional de la deficiencia del factor VIII en modelo murino de Hemofilia mediante uLlización de CMPIs con mutación reverLda por CRISPR-‐Cas9. Compara1va de expresión del Factor VIII en células endoteliales WT, células madre inducidas de los pacientes 1 y 2 (Pa-‐1 y Pa-‐2) y células madre inducidas tras la corrección con CRISPR de los pacientes 1 y 2 (Pa1-‐Co1 y Pa2-‐Co2). La modificación por CRISPR-‐Cas9 de la mutación en el gen F8 en células procedentes de pacientes enfermos y su posterior trasplante en un modelo murino de la enfermedad permi1ó rescatar el feno1po enfermo. MODELO DE APLICACIÓN CLÍNICA DE CRISPR
Paciente
Bio-productos vía edición genómica
Mutación genética
CRISPR
CMPIs derivadas del paciente
Descubrimiento de fármacos
Doudna et al. (2014)
Figura 3.4. Comparación de la eficiencia de CRISPR vs. TALENs para la edición del gen CCR5. Ensayo de PCR sobre clones de linfocitos CD4+ humanos, para ambos métodos de edición. HR: banda de referencia de proceso de reparación del ADN. CCR5: Banda de evaluación de la eficiencia de la edición en los clones. P: Control de células no editadas. (b) Tabla compara1va de la eficiencia (en porcentaje) de CRISPR-‐Cas9 y TALEN para la edición de CCR5 en clones de linfocitos CD4+.
Observación de la enfermedad e hipótesis de partida: (CCR5Δ32 mutación natural) Pacientes con deleción de 32 pares de bases en CCR5 Resistentes a la infección
Ou et al. (2016)
Ye et al. (2014)
Figura 3.5. Presencia de anSgeno viral p24 en culLvos de linfocitos CD4+ WT o modificados mediante CRISPR tras inocularlos con HIV-‐1. Se muestra la concentración de p24 (pg/mL) frente al 1empo post-‐inoculación. En cul1vos WT se observó un fuerte incremento en la carga viral mientras que la modificación del receptor en las células editadas impidió la propagación viral.
CONCLUSIONES • El sistema CRISPR-‐Cas9 ha supuesto una revolución en la Genómica por su sencillez, versa1lidad, y aplicabilidad
sobre cualquier 1po de célula. • En la terapéu1ca moderna, se ha demostrado su u1lidad en enfermedades con causas muy diferentes: trastornos
hereditarios, procesos infecciosos, y procesos oncológicos, a través de la combinación del sistema con la metodología del trasplante autólogo.
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Park et al. (2016)
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