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EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICOTICA DE ALGUNAS PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS EN LA COMUNIDAD NASA COLOMBIA EN
TRATAMIENTOS DE MICOSIS CUTAacuteNEAS SUPERFICIALES Y OTRAS INFECCIONES GENERADAS POR HONGOS
TATIANA VILA TORRES
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
SANTAFE DE BOGOTA DC
2012
EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICOTICA DE ALGUNAS PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS EN LA COMUNIDAD NASA COLOMBIA EN
TRATAMIENTOS DE MICOSIS CUTAacuteNEAS SUPERFICIALES Y OTRAS INFECCIONES GENERADAS POR HONGOS
TATIANA VILA TORRES
DIRECTORA MARIA XIMENA RODRIGUES
CO-DIRECTORA SILVIA RESTREPO
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIOacuteN
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO
211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2112 USOS ETNOMEDICOS
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2122 USOS ETNOMEDICOS
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2132 USOS ETNOMEDICOS
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2142 USOS ETNOMEDICOS
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
215 Alteranthera albotomentosa
2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2152 USOS ETNOMEDICOS
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2154 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
222 ETIOLOGIA
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Trichophyton mentagrophytes
2232 Microsporum canis
2233 Candida albicans
23 EVALUACIOacuteN DE ACTIVIDAD ANTIFUacuteNGICA ndash DIFUSIOacuteN EN AGAR TEacuteCNICA
DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO
3 OBJETIVOS
31 GENERAL 32 ESPECIFICOS
4 MATERIALES Y METODOS 41 AREA DE ESTUDIO 42 MATERIAL VEGETAL 43 PREPARACIOacuteN DE EXTRACTOS 431 EXTRACCIOacuteN ALCOHOacuteLICA TOTAL 432 EXTRACCIOacuteN ALOCHOacuteLICA FRACCIONADA 44 POBLACIOacuteN DE ESTUDIO 441 MICROORGANISMOS 442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO 45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD 5 RESULTADOS 51 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ETANOLICOS TOTALES Y FRACCIONADOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA 52 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA EN LOS MICROORGANISMOS ANALIZADOS PARA CADA UNO DE LOS EXTRACTOS OBTENIDOS 521 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Calbicans 522 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Tmentagrophytes 523 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Mcanis 53 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR ANTIFUNGICO COMERCIAL 54 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR SOLVENTES 6 CONCLUSIONES
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 FOTOS DE CADA ESPECIE VEGETAL
ANEXO 2 FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA
FRACCIONADA
ANEXO 3 MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO COMPONENTES Y
PREPARACIOacuteN
ANEXO 4 DIAGRAMA DE FLUJO DE EXTRACCION CON ETANOL ANEXO 5 DIAGRAMA DE FLUJO DE FRACCIONAMIENTO LIQUIDO-LIQUIDO ANEXO 6 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANEXO 7 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
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37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
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tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICOTICA DE ALGUNAS PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS EN LA COMUNIDAD NASA COLOMBIA EN
TRATAMIENTOS DE MICOSIS CUTAacuteNEAS SUPERFICIALES Y OTRAS INFECCIONES GENERADAS POR HONGOS
TATIANA VILA TORRES
DIRECTORA MARIA XIMENA RODRIGUES
CO-DIRECTORA SILVIA RESTREPO
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIOacuteN
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO
211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2112 USOS ETNOMEDICOS
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2122 USOS ETNOMEDICOS
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2132 USOS ETNOMEDICOS
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2142 USOS ETNOMEDICOS
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
215 Alteranthera albotomentosa
2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2152 USOS ETNOMEDICOS
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2154 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
222 ETIOLOGIA
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Trichophyton mentagrophytes
2232 Microsporum canis
2233 Candida albicans
23 EVALUACIOacuteN DE ACTIVIDAD ANTIFUacuteNGICA ndash DIFUSIOacuteN EN AGAR TEacuteCNICA
DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO
3 OBJETIVOS
31 GENERAL 32 ESPECIFICOS
4 MATERIALES Y METODOS 41 AREA DE ESTUDIO 42 MATERIAL VEGETAL 43 PREPARACIOacuteN DE EXTRACTOS 431 EXTRACCIOacuteN ALCOHOacuteLICA TOTAL 432 EXTRACCIOacuteN ALOCHOacuteLICA FRACCIONADA 44 POBLACIOacuteN DE ESTUDIO 441 MICROORGANISMOS 442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO 45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD 5 RESULTADOS 51 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ETANOLICOS TOTALES Y FRACCIONADOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA 52 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA EN LOS MICROORGANISMOS ANALIZADOS PARA CADA UNO DE LOS EXTRACTOS OBTENIDOS 521 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Calbicans 522 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Tmentagrophytes 523 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Mcanis 53 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR ANTIFUNGICO COMERCIAL 54 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR SOLVENTES 6 CONCLUSIONES
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 FOTOS DE CADA ESPECIE VEGETAL
ANEXO 2 FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA
FRACCIONADA
ANEXO 3 MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO COMPONENTES Y
PREPARACIOacuteN
ANEXO 4 DIAGRAMA DE FLUJO DE EXTRACCION CON ETANOL ANEXO 5 DIAGRAMA DE FLUJO DE FRACCIONAMIENTO LIQUIDO-LIQUIDO ANEXO 6 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANEXO 7 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIOacuteN
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO
211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2112 USOS ETNOMEDICOS
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2122 USOS ETNOMEDICOS
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2132 USOS ETNOMEDICOS
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2142 USOS ETNOMEDICOS
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
215 Alteranthera albotomentosa
2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
2152 USOS ETNOMEDICOS
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
2154 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
222 ETIOLOGIA
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Trichophyton mentagrophytes
2232 Microsporum canis
2233 Candida albicans
23 EVALUACIOacuteN DE ACTIVIDAD ANTIFUacuteNGICA ndash DIFUSIOacuteN EN AGAR TEacuteCNICA
DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO
3 OBJETIVOS
31 GENERAL 32 ESPECIFICOS
4 MATERIALES Y METODOS 41 AREA DE ESTUDIO 42 MATERIAL VEGETAL 43 PREPARACIOacuteN DE EXTRACTOS 431 EXTRACCIOacuteN ALCOHOacuteLICA TOTAL 432 EXTRACCIOacuteN ALOCHOacuteLICA FRACCIONADA 44 POBLACIOacuteN DE ESTUDIO 441 MICROORGANISMOS 442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO 45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD 5 RESULTADOS 51 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ETANOLICOS TOTALES Y FRACCIONADOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA 52 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA EN LOS MICROORGANISMOS ANALIZADOS PARA CADA UNO DE LOS EXTRACTOS OBTENIDOS 521 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Calbicans 522 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Tmentagrophytes 523 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Mcanis 53 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR ANTIFUNGICO COMERCIAL 54 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR SOLVENTES 6 CONCLUSIONES
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 FOTOS DE CADA ESPECIE VEGETAL
ANEXO 2 FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA
FRACCIONADA
ANEXO 3 MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO COMPONENTES Y
PREPARACIOacuteN
ANEXO 4 DIAGRAMA DE FLUJO DE EXTRACCION CON ETANOL ANEXO 5 DIAGRAMA DE FLUJO DE FRACCIONAMIENTO LIQUIDO-LIQUIDO ANEXO 6 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANEXO 7 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
23 EVALUACIOacuteN DE ACTIVIDAD ANTIFUacuteNGICA ndash DIFUSIOacuteN EN AGAR TEacuteCNICA
DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO
3 OBJETIVOS
31 GENERAL 32 ESPECIFICOS
4 MATERIALES Y METODOS 41 AREA DE ESTUDIO 42 MATERIAL VEGETAL 43 PREPARACIOacuteN DE EXTRACTOS 431 EXTRACCIOacuteN ALCOHOacuteLICA TOTAL 432 EXTRACCIOacuteN ALOCHOacuteLICA FRACCIONADA 44 POBLACIOacuteN DE ESTUDIO 441 MICROORGANISMOS 442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO 45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD 5 RESULTADOS 51 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ETANOLICOS TOTALES Y FRACCIONADOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA 52 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA EN LOS MICROORGANISMOS ANALIZADOS PARA CADA UNO DE LOS EXTRACTOS OBTENIDOS 521 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Calbicans 522 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Tmentagrophytes 523 INHIBICION DE CRECIMIENTO PARA Mcanis 53 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR ANTIFUNGICO COMERCIAL 54 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA PARA LA INHIBICIOacuteN DE CRECIMIENTO POR SOLVENTES 6 CONCLUSIONES
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 FOTOS DE CADA ESPECIE VEGETAL
ANEXO 2 FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA
FRACCIONADA
ANEXO 3 MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO COMPONENTES Y
PREPARACIOacuteN
ANEXO 4 DIAGRAMA DE FLUJO DE EXTRACCION CON ETANOL ANEXO 5 DIAGRAMA DE FLUJO DE FRACCIONAMIENTO LIQUIDO-LIQUIDO ANEXO 6 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANEXO 7 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
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tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
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38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 FOTOS DE CADA ESPECIE VEGETAL
ANEXO 2 FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA
FRACCIONADA
ANEXO 3 MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO COMPONENTES Y
PREPARACIOacuteN
ANEXO 4 DIAGRAMA DE FLUJO DE EXTRACCION CON ETANOL ANEXO 5 DIAGRAMA DE FLUJO DE FRACCIONAMIENTO LIQUIDO-LIQUIDO ANEXO 6 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANEXO 7 FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
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vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
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38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
INTRODUCCIOacuteN
Los remedios naturales hacen parte de una muy difundida tradicioacuten empiacuterica en
nuestro paiacutes apoyada en elementos culturales y en la notable diversidad de nuestra
flora estimada en maacutes de 50000 especies de plantas Sin embargo las investigaciones
farmacoloacutegicas en esta aacuterea han sido relativamente bajas (12)
Las infecciones por hongos superficiales son las micosis maacutes comunes en todo el
mundo y constituyen un problema de salud puacuteblica especialmente en paiacuteses tropicales
(3) Las micosis cutaacuteneas son infecciones causadas por dermatofitos estos son un
grupo de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir infecciones en la
piel pelo y untildeas tanto en humanos como en animales (4) La incidencia de las micosis
muestra un aumento notable debido a diferentes factores que favorecen la aparicioacuten
de estas enfermedades como lo son el clima huacutemedo la sobrepoblacioacuten y las malas
condiciones higieacutenicas que han conducido a un aumento de la prevalencia de estos
patoacutegenos (1) y que unido a la resistencia que presentan estos microorganismos a los
antimicoacuteticos disponibles conduce a una constante buacutesqueda de alternativas
terapeacuteuticas como parte de la solucioacuten al problema Medicamentos tales como
imidazoles butenafina y terbinafina son utilizados pero presentan periodos
prolongados de tratamiento alta toxicidad resistencia fuacutengica y algunas veces altos
costos (5)
Los extractos naturales de plantas son una alternativa para encontrar soluciones a
estas infecciones Se obtienen normalmente mediante la separacioacuten de porciones
bioloacutegicamente activas presentes en los tejidos de plantas mediante el uso de un
solvente (agua alcohol mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de
extraccioacuten (6)
La comunidad Nasa en el municipio de Paacuteez Tierradentro se encuentra ubicada en
una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia en la zona nor-oriental del
departamento del Cauca en las estribaciones de la Cordillera Central en liacutemites con
los departamentos del Huila y Tolima (7) Estudios etnobotaacutenicos sobre el uso y
manejo de los recursos vegetales de esta comunidad caracterizada por una fuerte
tradicioacuten indiacutegena han demostrado que las plantas empleadas con fines medicinales
constituyen el recurso terapeacuteutico fundamental de esta cultura la cual es suministrada
a la comunidad por los meacutedicos tradicionales Tewualas quienes poseen un gran
conocimiento botaacutenico el cual forma parte de la herencia cultural de este pueblo y el
cual se encuentra seriamente amenazado (8)
Por esta razoacuten en el presente estudio se evaluoacute actividad antimicoacutetica de diferentes
extractos vegetales de plantas seleccionadas por la comunidad Nasa y se realizaron
pruebas de susceptibilidad por la teacutecnica de difusioacuten en disco para diferentes agentes
causales de micosis superficiales
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
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the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
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Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
1 FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIOacuteN
El aumento en el nuacutemero de casos por infecciones fuacutengicas y su creciente incidencia
diversidad de las infecciones y el incremento de resistencia a los tratamientos
convencionales ha despertado el intereacutes por mejorar el conocimiento que se tiene
acerca de las micosis y las posibilidades de nuevas terapias alternativas (3)
Tierradentro se encuentra ubicada en una de las regiones maacutes biodiversas de Colombia
con una gran riqueza de especies vegetales y presenta factores que favorecen la
aparicioacuten de infecciones cutaacuteneas debido al clima tropical a las condiciones de vida y
al trabajo de los habitantes La comunidad Nasa posee un gran conocimiento
etnobotaacutenico de la zona Es por esto que el propoacutesito de este estudio fue evaluar
actividad antimicoacutetica de diferentes extractos vegetales de hojas de cinco plantas de
uso medicinal para los Tewualas La determinacioacuten de dicha actividad antimicoacutetica
puede servir para futuros estudios que aporten a la continua buacutesqueda de nuevas
alternativas de tratamiento para el manejo de las micosis los cuales beneficien a los
pacientes que estaacuten siendo afectados por estas infecciones
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
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37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
2 MARCO TEORICO
21 ESPECIES DE PLANTAS DE ESTUDIO (Anexo 1) 211 Gliricidia sepium
2111 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arboles perennes de tamantildeo medio hasta 10 m de alto Hojas de 30 cm de largo
aproximadamente 5-19 foliolos ovalados a eliacutepticos 2-7 cm de longitud 1-3 cm de
ancho Flores rosadas y lilas a blancas en racimos de 4-15 de longitud Legumbre
oblonga aplanada hasta 15 cm longitud y 2cm de ancho (9)
Esta especie es originaria de Centroameacuterica y en Colombia se cultiva para sombra y como postes vivos en los climas caacutelidos Crece en climas huacutemedos a subhuacutemedos hasta una altura de 2000m Es tolerante al fuego despueacutes de este rebrota (10) Familia Fabaceae
Nombre comuacuten Mataratoacuten madreado acacia
2112 USOS ETNOMEDICOS
La hoja fresca o cocida se aplica toacutepicamente sobre el impeacutetigo y otras enfermedades
de la piel El cocimiento de las hojas y corteza se usa para tratar afecciones
gastrointestinales (diarrea dolor de estoacutemago) Las hojas semillas y raiacuteces se usan
para matar ratas y como insecticida Las hojas en emplasto se aplican para granos y
erisipelas y la infusioacuten de ellas como expectorante Las hojas mediante decoccioacuten se
usan como bantildeos en algunas afecciones epideacutermicas (9)
2113 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Estudios de la actividad antimicrobiana in vitro demuestran que la maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas y corteza no inhibe enterobacterias patoacutegenas (11)
2114 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Se ha reportado la presencia de los compuestos Astragalina 27 dihidroxi-3metoxi-isoflavano gliricidina robinina robinetina sepinol sepiol canavanina pinitol y sacarosa (9)
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
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vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
212 Psidium guajava
2121 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hojas eliacutepticas u oblangas 4-12 cm de longitud y 35-45 cm de ancho venacioacuten
prominente 12-16 nervios laterales de cada lado Peduacutenculos axilares pubescentes 1-
3 flores pubescentes El caacuteliz envuelve las yemas peacutetalos 15-2 cm de longitud Baya en
forma de pera globosa La madera es chocolatosa o rojiza (9)
Esta especie es nativa de Ameacuterica Tropical Se encuentra distribuida desde Meacutexico y
Centroameacuterica hasta Sudameacuterica Antillas y el sur de Florida Habita en climas caacutelido
semicaacutelido y templado Es una especie con potencial para reforestacioacuten productiva en
zonas degradadas y se encuentra a la orilla de los caminos y senderos (13)
Familia Myrtaceae
Nombre comuacuten Guayaba blanca
2122 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas son empleadas tradicionalmente para tratar la diarrea aguda simple Es
utilizada por sus actividades farmacoloacutegicas como hipoglicemiantes antimicrobianos
antivirales antiinflamatorios antioxidantes antidiarreicos antialeacutergicos e
hipotensores (14) Se utilizan emplastos de esta especie junto con otras plantas sobre
infecciones en la piel y untildeas
2123 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de las hojas es activa contra Shigella dysenteriae
Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae
(12) En la decoccioacuten de las hojas se encontroacute actividad contra Epidermophyton
floccosum (15)
Las hojas han demostrado actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Drechslera oryzae
Dysdercus cingulatus Ustilago hordei y Ustilago tritici) y virus del mosaico del tabaco
(16)
2124 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
Se encuentra en las hojas y caacutescaras en aceite esencial flavonoides y alcoholes
sesquiterpeacutenicos y aacutecidos triterpenoides Se ha reportado la presencia de arabinosa
aacutecido asiaacutetico aacutecido protobaacutesico B-bisaboleno aacutecido brahmico cadideno
calameneno oxalato de calcio canfeno B- cariofileno casuarinina 18- cineol acido-
trans-cinaacutemico curcumeno A y B-copaeno daucosterol aacutecido gaacutelico farmeseno
guaiijaveriana (flavonoide) guavina ABCD Leucociadinina humulento (9)
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
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25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
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26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
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27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
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28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
213 Lippia alba
2131 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba perenne erecta algunas veces arbusto hasta 2 m de alto con un fuerte olor a
limoacuten lima o menta densamente pubescente Hojas decusadas opuestas laacutemina
ovada u oblonga 2- 7 cm de longitud maacutergenes serrados Inflorescencias axilares
solitarias o raras veces en pares Flores hicrateriformes de color azul a rosado lila a
violeta algunas veces blanca o amarillenta en la superficie interna (9)
Nativa de Ameacuterica Es una planta aromaacutetica que crece en la las laderas a la orilla de
caminos y riberas de los riacuteos en alturas hasta 1800 Msmm (17)
Familia Verbenaceae
Nombre comuacuten Pronto alivio
2132 USOS ETNOMEDICOS
Se usa como sedante y para la diabetes Se utilizan emplastos de las hojas frescas y
cocidas junto con otras plantas sobre infecciones en la piel cuero cabelludo y untildeas La
infusioacuten de las hojas y flores se emplea para trastornos gastrointestinales y digestivos
como antiespasmoacutedico en coacutelicos hepaacuteticos como expectorante y febriacutefugo Ademaacutes
se le atribuyen actividades antiseacutepticas y astringentes (9)
2133 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
El aceite esencial posee actividad contra Trichophyton mentagrophytes Candida
albicans y Neurospora crassa (18) La tintura en Guatemala ha demostrado actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (19) La maceracioacuten hidroalcohoacutelica de
las hojas tiene actividad contra hongos fitopatoacutegenos (Dreschlera oryzae Fusarium
moniliforme) (9)
2134 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA Los principales componentes del aceite esencial son alcanfor dihidrocarvona
cariofileno 18-cineol acetato de citronelol p-cimeno metildecilcetona lipiona
mirceno neral metiloctil-cetona piperitona y sabineno En un estudio de tamizaje
foitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la presencia de alcaloides e iridoides en las
hojas y los tallos y flavonoides en los tallos (9)
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
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37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
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tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
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38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
214 Senna occidentalis
2141 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Arbusto aromaacutetico anual o perenne de hasta 2 m peciolo con glaacutendulas en la base
foliolos de 4 a 6 pares aovados- lanceolados racimos axilares seacutepalos de 6-9 mm
peacutetalos de hasta 2 cm amarillos legumbre linear plana de 6 ndash 10 cm (9)
Originaria de Meacutexico y distribuida por Centroameacuterica y Surameacuterica Habita en clima
semicaacutelido templado y huacutemedo desde el nivel del mar hasta los 1600 m (20)
Familia Caesalpiniaceae
Nombre comuacuten cafecillo
2142 USOS ETNOMEDICOS
Las hojas estrujadas se usan localmente para afecciones cutaacuteneas y el zumo de hojas
se frota sobre la piel para la ldquomala calidad de la sangrerdquo La raiacutez se emplea como
contraveneno Las infusiones sirven como diureacutetico y antihisteacuterica Para curar las
afecciones respiratorias se utiliza en forma de un jarabe La infusioacuten de hojas y frutos
combinada con achiote (Bixa orellana) se utiliza para la inflamacioacuten estomacal (9)
2143 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
La hoja tiene actividad depurativa y laxante Las hojas y semillas muestran propiedades
antimicrobianas La decoccioacuten de la hoja tiene actividad inhibidora de los dermatofitos
Epidermophyton floccusom y Microsporum gypseum (20)
2144 COMPOSICIOacuteN BIOQUIMICA
La hoja contiene glicosidos flavonoides y antraquinonas crisofanol emodina fiscion y
sus derivados En un estudio de tamizaje fitoquiacutemico de esta especie se determinoacute la
presencia de alcaloides e iridoides en las hojas y los tallos y flavonoides en los tallos
(9)
215 Alteranthera albotomentosa 2151 DESCRIPCIOacuteN BOTAacuteNICA
Hierba postrada o rastrera hasta 1 m de altura Tallo verde a rojizo tricomas
abietiformes blancos hasta 1 mm de largo Hojas pecioladas peciacuteolo 02-1 cm de
largo laacutemina eliacuteptica a obovada glabra en hojas adultas y tomentosa en las joacutevenes
aacutepice mucronado Inflorescencias en cabezuelas axilares solitarias o en grupos de 2-3
globosas a ciliacutendricas seacutesiles blancas estramiacuteneas o verde amarillentas braacutectea 1
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
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32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
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36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
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37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
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tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
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38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
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40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
coacutencava Fruto 1-2 mm de largo globoso a ciliacutendrico Semilla 1 elipsoide ca 15 mm
de largo parda rojiza (9)
Es una especie nativa del noroccidente de Surameacuterica distribuida desde Colombia hasta Peruacute Crece hasta 2500 m de altitud (17) Familia Amarantaceae Nombre comuacuten Amor seco abrojo 2152 USOS ETNOMEDICOS Las hojas son utilizadas en implastos sobre infecciones de la piel Las infusiones sirven
para el dolor estomacal y la gastritis
2153 FARMACOLOGIA Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Esta especie se ha reportado con la capacidad de absorber metales pesados (21)
22 MICROORGANISMOS
221 GENERALIDADES
Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonoacutemicamente relacionados que tienen la capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel pelo y untildeas) del hombre y animales y producir una infeccioacuten dermatofitosis llamada comuacutenmente tintildea (22) El grupo de los dermatofitos comprende especies de los geacuteneros Trichophyton Epidermophyton y Microsporum (232425) ) Han sido clasificados en el grupo Deuteromicota (formas asexuales)Presentan las hifas septadas y los conidios pueden asentarse directamente en las hifas o bien en conidioacuteforos Pueden formar microconidios o macroconidios que son uacutetiles para su identificacioacuten (26) Morfoloacutegicamente los dermatofitos estaacuten clasificados en tres geacuteneros Trichophyton se caracteriza por formar macroconidios multicelulares de pared lisa y pueden existir microconidios Microsporum forma macroconidios de pared rugosa y pueden haber microconidios y Epidermophyton por producir solo macroconidios de pared lisa y delgada (22) 222 ETIOLOGIA
Se han reportado cuarenta y dos especies de dermatofitos pero la mayor parte de las
infecciones son causadas por once especies de las cuales las maacutes frecuentes en
Colombia son Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans y Epidermophyton flocosum
(2426)
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Microsporum spp invade principalmente la dermis y el cabello y algunas veces las
untildeas Epidermophyton spp afecta la dermis y las untildeas pero no el cabello a diferencia
de Trichophyton spp que se desarrolla en todas las estructuras queratinizadas (2224)
223 DESCRIPCION DE LAS ESPECIES
2231 Tricophytum mentagrophytes
Este microorganismo causa las entidades conocidas como tineas capitis cruris
corporis pediacutes barbae y unguium inclyendo infeccioacuten directa de la placa ungueal (26)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias planas con centro ligeramente elevado
de superficie pulvurenta o algodonosa y de color blanquecino que al envejecer se
vuelve color crema El reverso puede ser blanco amarillento anaranjado rojo o cafeacute
algunas producen un pigmento melanoide difusible (26 28)
Microscoacutepicamente se observan hifas delgadas septadas con microconidios redondos a
piriformes en racimos o a lo largo de la hifa algunos aislamientos presentan
macroconidios clavados las hifas en espiral son frecuentes (26 28)
2232 Microsporum canis
Hongo considerado como primera causa de tineas corporis pediacutes manuum y unguium
Presenta una distribucioacuten mundial y es causante de tintildea en gatos perros y monos
Puede ser tambieacuten un colonizador del pelaje de los animales pero sin causar
sintomatologiacutea Cuando se transmite al ser humano es una especie muy contagiosa
que da lugar a brotes epideacutemicos familiares o escolares (27)
Las colonias macroscoacutepicamente son generalmente blancas y de consistencia blanda
pulvurentas o algodonosas Este hongo filamentoso presenta macroconidios
abundantes fusiformes grandes pluriseptados de paredes muy gruesas y rugosas
Microconidios piriformes en breves racimos o seacutesiles que brotan lateralmente de la
hifa (25)
2234 Candida albicans
Este microorganismo es una levadura colonizadora habitual de la piel y mucosas del
cuerpo humano puede causar un amplio rango de infecciones superficiales e invasivas
como las candidiasis que son infecciones fuacutengicas que afectan piel untildeas y mucosas
(32) Es un hongo no dermatofito dimorfo que forma largas seudohifas hifas y
blastoconidios Asimilan y fermentan azuacutecares Presentan numerosas clamidosporas
unicelulares redondas u ovaladas con gruesa pared refringente (8-16 microm de
diaacutemetro) situadas al final de las hifas seudohifas o laterales sobre blastoconidios
ovalados Presentan crecimiento raacutepido (31)
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
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antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
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vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
La morfologiacutea macroscoacutepica muestra colonias de crecimiento circulares blandas lisas
blancas o cremosas de bordes precisos y centro ligeramente prominente (32)
23 TEacuteCNICA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFUacuteNGICA DIFUSIOacuteN EN AGAR CON DISCO En los uacuteltimos antildeos se han estandarizado varias teacutecnicas in vitro para la deteccioacuten de la resistencia de agentes etioloacutegicos con el fin de conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas y el espectro de accioacuten de los antifuacutengicos (38) La teacutecnica de difusioacuten en disco consiste en cuantificar la inhibicioacuten de crecimiento producida por el antifuacutengico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifuacutengico (39) El medio de cultivo pH tampoacuten inoacuteculo tiempo y temperatura de incubacioacuten deben ser especificas ya que una variacioacuten de estos paraacutemetros puede afectar los resultados El CLSI estandarizoacute el meacutetodo de difusioacuten en disco (documento M44-A) y en 1997 puacuteblico un documento sobre la estandarizacioacuten de las pruebas de sensibilidad a los antifuacutengicos en las levaduras del geacutenero Candida spp con el meacutetodo conocido como M27-A en el que se incorporan los puntos de corte de fluconazol itraconazol y 5-fluorocitosina y las CMI para las cepas control de calidad (39) En esta teacutecnica se inocula el hongo en la superficie del agar a la concentracioacuten correspondiente y luego se deposita un disco de papel sobre la superficie del agar con una concentracioacuten conocida de antifuacutengico para luego incubar Se produce entonces una zona de inhibicioacuten del crecimiento del hongo alrededor del disco Dependiendo del tamantildeo de la zona de inhibicioacuten se determina si el hongo es sensible resistente intermedio o indeterminado (29) Para poder realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a traveacutes del agar (30) Entre las ventajas de este meacutetodo se encuentra que la tasa de difusioacuten de cada antifuacutengico en el agar es generalmente predecible y reproducible La concentracioacuten de los antifuacutengicos disminuye exponencialmente difundiendo desde su punto de origen siendo los gradientes relativamente estables sobre el periodo de tiempo requerido para ver el crecimiento del hongo
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
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37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
3 OBJETIVOS
31 GENERAL Evaluar la actividad antimicoacutetica de extractos vegetales de hojas de las especies Lippia alba Senna occidentalis Alteranthera albotomentosa Gliricidia sepium y Psidium guajava en pruebas de susceptibilidad antifuacutengica por el meacutetodo de difusioacuten en disco para los hongos Microsporum canis Trichophyton mentagrophytes y Candida albicans 32 ESPECIFICOS
a Determinar la eficiencia de los extractos usando el tamantildeo de halos de
inhibicioacuten generado por los extractos para cada uno de los dermatofitos
b Determinar si existen diferencias en el grado de efectividad entre el extracto
crudo y las partes fraccionadas
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
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26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
4 MATERIALES Y MEacuteTODOS
41 Aacuterea de Estudio El municipio Paacuteez estaacute localizado en el departamento del Cauca en las estribaciones de la cordillera central de los andes de Colombia en liacutemites con los departamentos de Huila y Tolima Posee una extensioacuten aproximada de 1852 Km2 forma parte del aacuterea territorial conocida histoacutericamente como Tierradentro Su cabecera Belalcaacutezar estaacute localizada a los 2deg40rsquo de latitud Norte y 75deg59acute de longitud al Oeste de Greenwich Las temperaturas medias en el municipio se han estimado para las zonas bajas en 24degC y para las maacutes altas en 18degC (7) 42 Material Vegetal Se realizaron entrevistas con cinco hombres Tewualas de la comunidad Nasa Durante el trabajo de campo con ellos se realizaron 10 salidas entre Diciembre de 2011 y Enero de 2012 en las que se colectaron e identificaron especiacutemenes botaacutenicos con base en la informacioacuten suministrada Para las entrevistas se formuloacute una lista de preguntas (Tabla No 1) que incluiacutean informacioacuten sobre nombres comunes usos etnomeacutedicos partes utilizadas forma de aplicacioacuten importancia y efectividad de cada especie La identificacioacuten taxonoacutemica de las muestras botaacutenicas se llevoacute a cabo en el Herbario de Historia Natural en la Universidad de los Andes Bogotaacute Colombia
NOMBRE COMUN
USO ETNOMEDICO
PARTE UTILIZADA
FORMA DE APLICACIOacuteN
GRADO EFECTIVIDAD
Tabla No 1 Informacioacuten recolectada de las salidas de campo
El material vegetal fue colectado con ellos y secado naturalmente seguacuten lo hacen los hombres Tewualas colocando las hojas sobre unas esteras tejidos por ellos y puestas al aire libre durante siete diacuteas aproximadamente
43 Preparacioacuten de extractos vegetales
El material vegetal fue pulverizado y extraiacutedo por maceracioacuten en friacuteo con Etanol 96 Se realizoacute un fraccionamiento con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
431 Extraccioacuten Alcohoacutelica Total El material vegetal pulverizado fue macerado en friacuteo en una licuadora en Etanol al 96 durante cinco minutos y dejado en agitacioacuten constante durante 48 horas filtrando y resuspendiendo la biomasa en Etanol al 96 al inicio del segundo ciclo Los extractos fueron sometidos a tres ciclos de filtracioacuten en sistema de vaciacuteo con papel filtro de calibres diferentes hasta utilizar el filtro Whatman Ndeg1 y la fase liquida fue almacenada a 4degC Se mezclaron bien los dos extractos obtenidos (48 y 72 horas) y la mitad del volumen fue concentrado con un rotaevaporador para obtener una extraccioacuten alcohoacutelica total (Anexo 2 y 6) 432 Extraccioacuten Alcohoacutelica Fraccionada La otra mitad obtenida de la extraccioacuten total fue sometida a un fraccionamiento por el meacutetodo particioacuten liquido-liquido discontinuo con los solventes eacuteter de petroacuteleo como solvente de baja polaridad para obtener la fraccioacuten de compuestos apolares grasas y aceites el diclorometano (CH2Cl2) tiene la misma funcioacuten pero es de mayor polaridad y por uacuteltimo acetato de etilo (AcOEt) de mayor polaridad que los dos solventes anteriores Se dejoacute cada uno en agitacioacuten constante durante 10 minutos para el contacto entre fases y 24 horas de decantacioacuten para la separacioacuten El procedimiento de fraccionamiento discontinuo liacutequido-liacutequido se realizoacute dos veces por cada solvente aplicado a la fraccioacuten hidroalcohoacutelica (fase acuosa) Las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a sequedad en rotaevaporador a presioacuten reducida tal y como fue descrito anteriormente (Anexo 3 y 7) 44 ORGANISMOS DE ESTUDIO
441 MICROORGANISMOS
Las pruebas bioloacutegicas se realizaron con la levadura Candida albicans y los
dermatofitos Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes obtenidos del cepario
del LAMFU de la Universidad de los Andes y del cepario de la Pontificia Universidad
Javeriana
442 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los dermatofitos fueron cultivados durante cuatro semanas en agar avena-oat meal a
una temperatura de 23ordmC y Candida albicans fue cultivada en medio Sabouraud a una
temperatura de 37ordmC
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
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tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
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Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
45 MONTAJE DE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
a Medios de cultivo se preparoacute el medio de cultivo Mueller Hinton modificado con
2 Glucosa y 1mlL azul de metileno con el fin de aumentar el contraste del medio
para facilitar asiacute la observacioacuten de los halos de inhibicioacuten de crecimiento y dar una
mejor interpretacioacuten de los resultados obtenidos (Anexo 4)
b Inoacuteculo se preparoacute el inoacuteculo para dermatofitos a una concentracioacuten de 1x104 UFCmL y para levadura de 1x106 UFCmL utilizando la teacutecnica de recuento en caacutemara de Neubauer c Siembra se realizoacute siembra masiva de los inoacuteculos en el medio de cultivo colocando 100 microL de la suspensioacuten en la superficie del medio y con un rastrillo se distribuyoacute en toda la superficie
e Sensidiscos se utilizaron discos de 52 mm de papel Whatman Ndeg1 los cuales fueron pasados por tres ciclos de esterilizacioacuten y posteriormente activados impregnaacutendolos con 10μl de extracto por sensidisco Se utilizaron dos tipos de concentraciones por extracto 500 mgmL y 100 mgmL Los extractos fueron diluidos en DMSO Se almacenaron a 4degC (Anexo 8)
g Aplicacioacuten de los sensidiscos los sensidiscos se colocaron en la superficie y a cada lado del medio previamente inoculado Se utilizoacute las 2 concentraciones del extracto en cada caja de petri y se trabajoacute por cuadruplicado cada una de las pruebas Fueron almacenados durante 24 horas en la nevera con el fin de obtener una correcta difusioacuten del extracto
h Incubacioacuten los medios de cultivo fueron incubados a 37ordmC durante 24 horas para C albicans y a 25 ordmC durante 4 diacuteas para los dermatofitos
i Lecturas se realizaron lecturas a las 2448 72 y 96 horas teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento Se promediaron cuatro medidas para cada halo de inhibicioacuten j Control (positivo) Para la Inhibicioacuten de crecimiento por antifuacutengico comercial se
preparoacute Itraconazol a una concentracioacuten de 25 mgmL para Calbicans y Terbinafina a
una concentracioacuten de 25 mgmL para los dermatofitos
Control (negativo) Para el control por solventes se utilizoacute 20 microL para cada sensidisco
con los solventes Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano y Acetato de Etilo y para DMSO se
utilizoacute 10 microL
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
5 RESULTADOS Y DISCUSION
51 Obtencioacuten de Extractos Etanoacutelicos Totales y Fraccionados
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas Se manejoacute una concentracioacuten de 500 mgmL y una
concentracioacuten de 100 mgmL Los 10 extractos obtenidos quedaron diluidos en DMSO
y en los discos Wathman (52 mm) impregnados con 10 microL
Los fraccionamientos de los extractos crudos etanoacutelicos se realizaron de acuerdo con la metodologiacutea descrita en el diagrama de flujo de fraccionamiento liacutequido-liacutequido (ver Anexo 5) Las diferentes fracciones presentaron caracteriacutesticas diferentes de color y consistencia Se obtuvieron tres tipos de extractos fraccionados (Eacuteter de petroacuteleo CH2Cl2 y AcOEt) de cada una de las muestras para un total de 15 extractos Cada una de los extractos (crudo y fracciones) obtenidos presentoacute caracteriacutesticas diferentes las cuales se describen en la tabla 1 Tabla No1 Caracteriacutesticas de cada extracto seguacuten solvente utilizado
52 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de los Extractos Obtenidos
Se analizaron las cajas sembradas con la suspensioacuten de conidios o ceacutelulas levaduriformes en el medio Mueller Hinton y con las diferentes concentraciones de los extractos obtenidos aplicando la prueba de susceptibilidad antifuacutengica con el meacutetodo de difusioacuten en disco
Especies Vegetales Etanol 96 Eacuteter de Petroacuteleo Diclorometano Acetato de etilo
P guajava Cafeacute oscuro seco
Cafeacute oscuro denso
Cafeacute oscuro seco
Cafeacute claro seco
G sepium Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde claro seco grumoso
Cafeacute claro seco liso homogeacuteneo
S occidentalis Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Verde oscuro denso
Cafeacute claro seco homogeacuteneo
L alba Verde oscuro denso
Verde oliva denso
Verde oscuro seco grumoso
Cafeacute muy claro seco homogeacuteneo
Aalbatomentosa Verde oscuro denso
Verde oscuro grumoso
Verde oscuro denso
Cafeacute amarillo seco homogeacuteneo
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
521 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans en los extractos de Etanol
96 y la fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo en las plantas de las especies L alba en ambas
concentraciones G sepium y A albatomentosa en la concentracioacuten 500mgmL (Tabla 2) Para
el resto de los extractos no se observoacute halo de inhibicioacuten
Tabla No 2 Inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
Tabla No 3 Medida promedio para halos de inhibicioacuten de crecimiento frente a C albicans
Extracto Vegetal Etanol 96
(cm)
Eacuteter de Petroacuteleo
(cm)
Lalba 11875 04913
Gsepium 11056 08463
Aalbatomentosa 08238 0
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
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new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
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7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
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concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
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10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
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11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Graacutefica No 1 Actividad inhibitoria frente a Calbicans para cada tratamiento
Se observaron diferencias significativas entre todos los tratamientos analizados
excepto para los extractos A albatomentosaEtanol 96 y G sepiumEacuteter de Petroacuteleo
(ver Anexo 10)
La graacutefica No1 muestra que el tratamiento que presentoacute una mayor actividad de
inhibicioacuten frente a C albicans fue el antifuacutengico comercial Itraconazol (25mgmL)
seguido del extracto crudo Etanol 96 de las especies L alba y G sepium Los valores
corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error corresponden a la desviacioacuten
estaacutendarPara los demaacutes extractos analizados es posible que el microorganismo no sea
susceptible o que la concentracioacuten utilizada haya sido muy baja y debido a esto se
obtuvo un resultado no inhibitorio
L alba ha sido reportada en la literatura como planta medicinal comuacutenmente utilizada
por comunidades indiacutegenas en el tratamiento de infecciones y de la cual se ha
obtenido aceite esencial Seguacuten Hennebelle y colaboradores (2008) los extractos de
etanol al 90 fueron efectivos contra C albicans a una CMI mayor a 1 mgmL (34) En
su estudio Holetz y colaboradores (2002) reportaron actividad anti-Candida debido al
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
aceite esencial de esta planta (35) Esto indica que L alba posee metabolitos que
inhiben crecimiento de C albicans y que pueden ser una buena fuente de estudio para
investigaciones futuras
Igualmente se observaron halos de inhibicioacuten de crecimiento para los extractos de las
plantas G sepium y A albatomentosa que pueden ser importantes plantas objeto de
investigacioacuten en la buacutesqueda de nuevos antifuacutengicos y de las cuales no se encontroacute
literatura reportada
522 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes en
ninguno de los extractos de las plantas analizadas (Tabla 4 y 4) sin embargo en el
estudio realizado por Caacuteceres y colaboradores (1991) demostraron actividad
antimicoacutetica de la infusioacuten de las hojas de S occidentalis frente a los dermatofitos E
floccosum M gypseum y T mentagrophytes (40)
Tabla No 4 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
Adamu y colaboradores (2006) demostraron actividad antifuacutengica de este
microorganismo en extractos metanoacutelicos (41)
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Tabla No 5 Inhibicioacuten de crecimiento para T mentagrophytes
523 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
No se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para M canis en ninguno de los extractos evaluados (Tabla 6 y 7) sin embargo en el estudio de Fontelle y colaboradores (2007) encontraron que extractos acuosos de L alba presentaron actividad antifuacutengica contra M canis (41)
Tabla No 6 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
En el estudio Caacuteceres y colaboradores (1991) comprobaron actividad antimicoacutetica de extractos hidroalcohoacutelicos frente a este microorganismo (40)
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Tabla No 7 Inhibicioacuten de crecimiento para M canis
53 Evaluacioacuten de la Actividad Antifuacutengica de Medicamentos Comerciales frente a los Microorganismos en Estudio Se observoacute inhibicioacuten de crecimiento para todos los microorganismos del estudio Se observoacute un halo significativo con Terbinafina para los dermatofitos y con Itraconazol para la levadura Estas pruebas muestran efectividad antifuacutengica (Tabla 8 Graacutefica 2) Tabla No 8 Fotos de las pruebas de sensibilidad con antifuacutengico comercial
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Graacutefica No 2 Actividad inhibitoria para tratamientos con antifuacutengico comercial
En el presente estudio se observoacute diferencia significativa entre los tratamientos
analizados con antifuacutengicos comerciales En la graacutefica No 2 se observoacute que el
tratamiento que presentoacute mayor efectividad frente a C albicans fue Itraconazol
(25mgmL) seguido de Terbinafina (25mgmL) frente a T mentagrophytes Los
valores corresponden al promedio de cuatro reacuteplicas y las barras de error
corresponden a la desviacioacuten estaacutendar
El Itraconazol es un derivado imidazoacutelico de uacuteltima generacioacuten usado ampliamente por
sus propiedades antifuacutengicas para el tratamiento de micosis superficiales
(onicomicosis) y sisteacutemicas (37) Quiacutemicamente es un derivado triazoacutelico de foacutermula
C35H38Cl2N8O4 con tres aacutetomos de nitroacutegeno en su anillo azoacutelico que se comporta
como una base deacutebil (36) El tratamiento para la candidiasis ha sido insatisfactorio
debido al limitado nuacutemero de drogas antifuacutengicas En este estudio se comproboacute la
susceptibilidad de C albicans por el meacutetodo difusioacuten por disco para Itraconazol y se
demostroacute al igual que en el estudio de Maldonado y colaboradores (2000) que esta
droga comercial inhibe efectivamente su crecimiento
La Terbinafina es un derivado sinteacutetico de la alilamina con actividad antimicoacutetica de
amplio espectro En este estudioacute inhibioacute significativamente el crecimiento de los
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
microorganismos T mentagrophytes y M canis demostrando que posee actividad
fungicida o fungistaacutetica ocasionando la muerte celular en el hongo al inhibir la siacutentesis
del ergosterol componente fundamental de la membrana del hongo y la acumulacioacuten
de su precursor el escualeno el cual funciona bloqueando la siacutentesis de ergosterol
mediante la inhibicioacuten de la enzima escualeno-epoxidasa (33) Seguacuten Rodriacuteguez y
colaboradores (2009) en su estudio por el meacutetodo de microdilucioacuten en caldo
determinaron inhibicioacuten antifuacutengica con terbinafina la cual inhibioacute los dermatofitos
T rubrum M canis y T mentagrophytes (42)
54 Control de Inhibicioacuten de Crecimiento por Solventes y DMSO
No hubo inhibicioacuten de crecimiento por parte de los solventes utilizados durante el
crecimiento de los microorganismos lo cual era de esperarse Esta prueba fue utilizada
como control negativo como se observa en tabla 9
Tabla No 9 Fotos de las pruebas control de crecimiento con solventes
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
6 CONCLUSIONES
Se obtuvieron dos concentraciones de extractos etanoacutelicos crudos para cada una de las
especies vegetales utilizadas para un total de 20 extractos diferentes en los cuales se
observaron consistencias y colores diferentes seguacuten el tipo de planta En estos
extractos analizados se encontraron halos de inhibicioacuten de crecimiento para C albicans
en las plantas Lalba Gsepium y Aalbatomentosa en el extracto de Etanol 96 y
fraccioacuten de Eacuteter de Petroacuteleo
El extracto que presentoacute una mayor actividad antifuacutengica frente a C albicans fue el
extracto crudo Etanol 96 de L alba seguido de G sepium Estos extractos
presentaron mayor efectividad que sus fracciones Eacuteter de Petroacuteleo
Para los demaacutes extractos C albicans no mostroacute suceptibilidad Lo mismo ocurrioacute frente
a los dermatofitos M canis y T mentagrophytes ya sea porque el microorganismo no
presenta suceptibilidad o por que la concentracioacuten utilizada fue muy baja para generar
inhibicioacuten
Para los controles negativos de los solventes utilizados no se observaron halos de inhibicioacuten y para las pruebas de susceptibilidad frente a los antifuacutengicos comerciales Itraconazol y Terbinafina se observaron halos se inhibicioacuten significativos para todas las pruebas mostrando resultados inhibitorios y efectividad antifuacutengica positiva Con esto comprobando la eficacia de estas drogas frente al crecimiento de estos microorganismos Se sugiere seguir realizando investigaciones que permitan identificar cuaacuteles son los componentes responsables de causar el efecto inhibitorio
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Bibliografiacutea
1 Alvarez ME Isaza G Acosta SM Yepes AG 2005 Actividad antimicoacutetica de Phenax rugosus (lam) pers y Baccharis trinervis (sw) wedd Biosalud 14 38-45
2 Isasa G Fuentes J Marulanda T 2000 Fundamentos de Farmacologiacutea en
Terapeacuteutica 4ordf ed Postergraph Pereira 43 545-554
3 Rubio MC Rezusta A Gil J Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica de los
dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 1616-22
4 Levinson W 2004 Medical Microbiology and Immunology Examination and
Board Review Eight Edition New York McGraw-Hill
5 Zacchino S Yunes R Filho V Enriz DKouznetsov V Ribas J 2003 The need for
new antifungal drugs Screening for antifungal compounds with a selective
mode of actions with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall Olant-
Derived Antimycotics Current Trends and Future Prospects New York Haworth
Press 12 1-34
6 Rodina VD Palacios P Vaccaro MC Rosana F Coussio JD 1985 Metodologiacutea para la preparacioacuten y fraccionamiento sistemaacutetico de extractos vegetales con miras a su ensayo farmacoloacutegico y eventual estudio quiacutemico Acta Farmaceacuteutica Bonaerense 43-14
7 Sitio Oficial de Paeacutez Cauca Colombia Tomado el diacutea 2 de Junio de 2012 de httpwwwpaez-caucagovconuestromunicipioshtmlapc=mmxx-1921641ampm=f
8 Cruz B N P Ceroacuten N 1996 Las plantas y el territorio clasificacioacuten usos y
concepciones en los andes colombianos Ediciones Abya-Yala
9 Gupta M 1995 Doscientas Setenta Plantas Medicinales Iberoamericanas
Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologiacutea para el Desarrollo Bogotaacute
10 Catie C Cohdefor M 1991 El Madreado (Gliricidia sepum) Uso y manejo en
cercas vivas Coleccioacuten materiales de extensioacuten Proyecto Madelentildea-3 Rocap-
Renarm no 596
11 Figueroa LP 1991 Accioacuten Antibacteriana de Extractos de Leguminosas Usadas en el tratamiento de Diarrea Guatemala Facultad de CCQQ y Framacia USAC 67p
12 Caacuteceres A Loacutepez BR Giroacuten MA 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of Dermatophytic Infections Screening for antimycotic activity of 44 plants extracts J Ethnopharmacol 31(3) 263-276
13 Ji XD PuQL Garrafo HM Pannell Lk 1991 The essential oil of the leaves
of Psidium guajava J Essent Oil Res 3(3) 187-189
14 Goacutemez M Rodriacuteguez T LLanes R Sierra P 1991 Utilizacioacuten de plantas
medicinales en el aacuterea de salud ldquoBelkis Sotomayorrdquo del municipio Ciego de
Avila I Jornada
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
15 Caacuteceres AL Jauregui E Herrera D LogemannH 1991b Plants used in
Guatemala for the treatment of dematomucosal infections Screening of 38
plant extracts for anticandidal activity J Ethnopharmacol 33277-283
16 Grainje M AhmedsS 1988 Handbook of plants with pest control properties
New York John Wiley Sonsp 226
17 Garciacutea H 1974 Plantas Medicinales de Colombia Volumen I Instituto de Ciencias
Naturales Universidad Nacional Bogotaacute Colombia p 500
18 Caacuteceres A Giron L 1987 Actividad antimicrobiana de plantas usadas en el
tratamiento de afecciones de la piel y mucosas Resuacutemenes III Seminario
Nacional Medicina Tradicional y I Seminario Mesoamericano de
Etnofarmacologigravea Ciudad Guatemala p 104-109
19 Caacuteceres A Samayoa B Fletes L 1990 Actividad Antibacteriana de Plantas Usadas
en Guatemala para el tratamiento de infecciones Cuadernos de investigacioacuten No 4-
90 Guatemala DIGIUSAC p 72-73
20 Caacuteceres A Loacutepez B Juarez X Del aacuteguila J Garciacutea S 1993 Plants used in
Guatemala for the treatment of dermatophytic infections Evaluation of
antigungal activity of seven American plants J Ethnopharmacol 40(3)207-213
21 Ding B G Shi Y Xu J Hu and Q Xu 2007 Physiological responses of
Alternanthera philoxeroides (Mart) Griseb leaves to cadmium stress
Environmental Pollution 147(3) 800-803
22 Rubio MC Rezusta A Tomaacutes JG Ruesca RB 1999 Perspectiva micoloacutegica
de los dermatofitos en el ser humano Rev Iberoam Micol 16 16-22
23 Blank FM Mann J Reales A 1974 Distribution of dermatophytosis
according to age Journal Clinical Epidemiology 46(5) 432-429
24 Macura A 1993 Dermatophyte Infections International Journey of
Dermatology 32(5) 313-323
25 Restrepo Jorge Restrepo Angela 1991 Fundamentos de medicina
Enfermedades Infecciosas Cib ed 4ta Medellin Colombia
26 Cabezas AL Colorado AJ 1997 Comparacioacuten de dos teacutecnicas para medir la
susceptibilidad de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes frente
a tres antimicoacuteticos Centro dermatoloacutegico Federico Lleras Trabajo de grado
(Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias
27 Rebell G Taplin D 1970 Dermatophytes Their Recognition and Identification
University of Miami Press Florida
28 Cadena AP Pentildearete L 1995 Evaluacioacuten de 3 pruebas de laboaratorio
empleadas en la diferenciacioacuten de Trichophyton mentagrophytes y
Trichophyton rubrum en el Centro Dermatoloacutegico Federico Lleras Acosta
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea)Universidad de los Andes Facultad de
Ciencias
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
29 Trejos EJ 2009 Evaluacioacuten de paraacutemetros para pruebas de susceptibilidad
antifuacutengica en hongos filamentosos mediante la teacutecnica de difusioacuten en agar
Trabajo de grado (Bacteriologiacutea) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
30 Chavez J 2006 Susceptibilidad in vitro de hongos miceliales aislados de pacientes con caacutencer Instituto Nacional de Cancerologiacutea ESE Santafeacute de Bogotaacute Trabajo de grado (Bacterioacuteloga) Universidad Javeriana Facultad de Ciencias
31 Mesa LM Arcaya N Cantildeas O Machado Y 2004 Evaluacioacuten de los caracteres fenotiacutepicos para diferenciar Candida albicans de Candida dubliniensis Rev Iberoam Micol 21135-138
32 Suaacuterez VL Lancha MR 2004 Identificacioacuten de levaduras de exudados vaginales caracteriacutesticas cliacutenicas asociadas a la candidiasis Rev Cubana med trop 56(1)21-5
33 Nintildeo F 2010 Evaluacion de metabolitos secundarios del hongo Ganoderma lucidum con actividad antifungica frente a Fusarium spp de intereacutes cliacutenico Trabajo de grado Universidad Javeriana
34 Hennebelle T Sahpaz S Joseph H Bailleul F 2008 Ethnopharmacology of
Lippia alba Journal of Ethnopharmacology 116211ndash222 France
35 Holetz FB Pessini GL Sanches NR Cortez DAG Nakamura CV Filho
BPD 2002 Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for
the treatment of infectious diseases Memorias do Instituto acuteOswaldo Cruz 97
1027ndash1031
36 Alvarado D Diacuteaz MC Silva V 2002 Identificacioacuten y susceptibilidad
antifuacutengica de Candida spp aisladas de micosis invasora Influencia
del porcentaje de inhibicioacuten del crecimiento para la determinacioacuten de CIM
Rev meacuted Chile 130(4) 65-69
37 MaldonadoB ReviaacutekinaV PanizoM Dolande M 2000 Susceptibilidad in
vitro de candida albicans a itraconazol y fluconazol estudio comparativo por
tres meacutetodos Susceptibility in vitro of candida albicans to itraconazole and
fluconazole comparative study by three methods Antibiot infecc 8(3)111-115
38 Torres NA Aacutelvarez C Rondoacuten MA 2009 Evaluacioacuten mediante tres teacutecnicas de susceptibilidad a fluconazol en especies de Candida aisladas en pacientes con infecciones invasoras Rev Chil Infect 26 (2) 135-143
39 Lacasa E Mazuelos EM Ingroff A 2007 Meacutetodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifuacutengicos (documentos M27-A3 M38-A y M44-A) Revista Iberoamericana de Micologiacutea - ISBN 978-84-611-8776-8
40 Caacuteceres A Lopez BR Giron M 1991 Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 1 Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts J Ethnopharmacol 31 (3) 263-76
41 Adamu H AbayeOJ Kafu SE 2006 Antifungal activity of extracts of some Cassia detarium against dermatophytes Natural product radiance 5 (5) 357-360
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 1
FOTOS DE PLANTAS DE ESTUDIO
Gliricidia sepium Senna occidentalis
Lippia alba Alteranthera albotomentosa
Psidium guajava
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 2
FOTOS DE CADA ESPECIE DE PLANTA EN EXTRACCIOacuteN ALCOHOLICA FRACCIONADA
Tipo de extraccioacuten seguacuten solvente (de izquierda a derecha) Eacuteter de Petroacuteleo
Diclorometano y Acetato de Etilo
Psidium guajava
Alteranthera albatomentosa
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
Gliricidia sepium
Senna occidentalis
Lippia alba
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 3
MEDIO AGAR MUELLER HINTON MODIFICADO
Mueller Hinton 38 gL
Glucosa 2
Azul de metileno 1 mlL
En 1 litro de agua destilada se agrega el polvo Mueller Hinton la glucosa y el azul de
metileno Se mezcla muy bien y se calienta lentamente hasta que se disuelva y
homogenice Se esteriliza a 120ordmC durante 40 min
Para el azul de metileno se mezcla 1 g de Azul de Metileno en polvo en 200 ml de agua
destilada y se pone en agitacioacuten hasta homogenizar la muestra
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 4
MICROORGANISMOS CULTIVADOS
Tmentagrophytes en agar Oatmeal
Mcanis en agar Oatmeal
Calbicans en agar Sabouraud
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 5
DIAGRAMA DE FLUJO EXTRACCION CON ETANOL
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 6
DIAGRAMA DE FLUJO FRACCIONAMIENTO LIacuteQUIDO ndash LIacuteQUIDO
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado
ANEXO 7
FOTOS MONTAJE PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Dos concentraciones utilizadas por extracto de izquierda a derecha (1 mgmL y 5
mgmL)
Reacuteplicas de 4 cajas por extracto analizado