Post on 12-Apr-2017
transcript
Farmacoproteómica del
condroitín sulfato I
m/z
Valentina Calamia & Cristina Ruiz-Romero
Unidad de Proteómica-ProteoRed/ISCIII
Grupo de Investigación en Reumatología
INIBIC-Hospital Universitario A Coruña Jornada Cátedra Bioibérica
A Coruña, 18 Noviembre 2015
Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos
Comprensión de los mecanismos patofisiológicos
SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL
CARTÍLAGO CONDROCITOS
PROTEÓMICA Y ARTROSIS (OA)
Introducción
Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial
farmacológico (Drug profiling)
Monitorización de ensayos clínicos
Personalización y optimización del tratamiento
FARMACOPROTEÓMICA
CONDROITÍN SULFATO
Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos
Comprensión de los mecanismos patofisiológicos
SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL
CARTÍLAGO CONDROCITOS
Introducción
Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial
farmacológico (Drug profiling)
Monitorización de ensayos clínicos
Personalización y optimización del tratamiento
FARMACO-PROTEÓMICA
CONDROITÍN SULFATO (CS)
PROTEÓMICA Y ARTROSIS
TRATAMIENTOS: ESCALERA TERAPÉUTICA
• Terapia física
• Calzado apropiado / ayudas para
andar
• Hidroterapia
• Rehabilitación
• Lavado articular
• Transplante de condrocitos
• Artroscopia
• Artroplastia
• Medicina regenerativa
• Dieta
• Terapia farmacológica
sistémica, tópica y/o
• Intra-articular
• Ejercicio moderado
colaboración y educación
paciente
protección articular
ejercicio
tratamiento farmacológico
tratamiento quirúrgico
Introducción
Efecto rápido y potente No modifican la evolución
de la enfermedad Escasa seguridad
Posibles interacciones
SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN RÁPIDA:
• PARACETAMOL • AINEs • GLUCOCORTICOIDES • COXIB
SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN LENTA (SYSADOA):
• CONDROITÍN SULFATO • SULFATO DE GLUCOSAMINA • ÁC. HIALURÓNICO • DIACEREÍNA
Efecto lento y prolongado Modifican el curso de la enfermedad
Elevada seguridad Baja relación coste/efectividad
TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE OA
Introducción
DMOAD (DISEASE MODIFYING OSTEOARTHRITIS DRUG)
1. Análisis del efecto del CS y GS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).
ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).
3. Análisis del efecto del 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos.
4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ.
1. Análisis del efecto del CS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).
Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b
ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b
A
B
2-DE
650 spots detectados 48 spots alterados 35 spots identificados
EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N
EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N
Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b
GS CS
PDIA1 PDIA3#
HSP7C GELS
ANXA1 ANXA2#
TPIS AK1C2 KPYM1
GS+CS
ANXA5 GDIR
GRP78 ACTB SODM
ENOA*
PRDX1 HSPB1*
CO6A1
HSPB1*
DPYL2 PGAM1 TAGL2
GANAB SEPT2
GSTP1 ENOA*
EF1G TCPG UGDH PGK1 ATPA G3P
ALDOA CO6A1
Grp78: UPR, propiedades antiinflamatorias SOD2: enzima relacionada con estrés oxidativo
CS Y FUNCIÓN MITOCONDRIAL
CS y mitocondria
CTL IL1β IL1 β +CS
SOD2
TUB
Calamia V et al., ART 2010
*
*
&
Incrementa producción ATP
*
&
Disminuye ROS Disminuye actividad SOD
Mitocondria, posible diana de la condroprotección mediada por CS
ESTRUCTURA DEL CARTÍLAGO ARTICULAR
COMPONENTE CELULAR Condrocitos (1,5% del volumen total) MATRIZ EXTRACELULAR (98% del volumen total) Peso total
• Agua (70-80%) • Proteínas (20-30%)
Peso seco • Colágeno tipo II (50%) • Proteoglicanos (30-35%) • Otras proteínas de matriz (15-20%)
Adaptada J. Martel-Pelletier et al. OA&C (2010)
keratan sulfato
condroitín sulfato
MATRIZ EXTRACELULAR
2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).
Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA
ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
A
B
Cultivo de condrocitos en medios pesado y ligero
Tratamiento con CS e IL Extracción de proteínas Separación por LC Análisis por MS
EFECTO DEL CS EN EL SECRETOMA DEL CONDROCITO
HPLC
Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA
Arg 0/Lis 0 “light”
Arg 10/Lis 6 “heavy”
ΔDa
SILAC
EFECTO DEL CS EN SECRETOMA DE CONDROCITOS
Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA
Ratio CS/BASAL
pValue
Collagen alpha-1(I) chain 2,63 0,0027
Collagen alpha-1(VI) chain 1,97 0,0062
Collagen alpha-2(I) chain 2,61 0,0001
Lumican 1,38 0,0003
Decorin 2,70 0,0071
Chitinase-3-like protein 1 (YKL-40) 1,52 0,0699
Insulin-like growth factor-binding protein 3
2,99 0,0099
Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 2,04 0,0668
Fibronectin 1,81 0,0001
Vimentin 2,01 0,0005
20%
10%
10%
60%
componentes MEC factores de crecimiento
remodelación MEC estructurales
AN
AB
ÓLI
CO
Ratio IL/BASA
L
Ratio IL+CS/IL
Interstitial collagenase (MMP1) +++ 0,69
72 kDa type IV collagenase (MMP2) 3,45 0,74
Stromelysin-1 (MMP3) +++ 0,8
Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,4 0,8
Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)
0,4 1,5
Glia derived nexin (SERPINE2) 17,6 1,41
Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein (TNFAIP6)
+++ 2,99
Decorin 0,66 1,27
Tenascin 1,9 0,7
Fibromodulin - 1,27
Cartilage oligomeric matrix protein (COMP)
1,61 0,74
Interleukin-6 +++ 0,61
Interleukin-8 +++ 0,57
Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (TGFBI)
2,87 0,73
AN
TI-
CA
TAB
ÓLI
CO
A
NTI
-IN
FLA
MA
TOR
IO
Condrocitos OA
Condrocitos N+IL1b
3. Análisis del efecto de 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos.
ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA
Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA
EFECTO DIFERENCIAL DE 3 CS EN EL CONDROCITO OA
CS1 CS2 CS3
SPECIES
PURITY 90.4 % 96.2 % 99.9 %
Proteoma (2D-DIGE)
Secretoma (SILAC)
Modulated proteins CS1 CS2 CS3
Actin, cytoplasmic 2 0,82 0,54 1,22
Annexin A2 0,66
Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) 1,29
Cathepsin D 0,72
Chitinase-3-like protein 2 3,01
Collagen alpha-1(I) chain 1,37
Collagen alpha-1(III) chain 1,60
Collagen alpha-1(XII) chain 0,79 0,84
Collagen alpha-1(XV) chain 0,51 0,62 1,30
Collagen alpha-3(VI) chain 0,44
Connective tissue growth factor 1,59
Fibronectin 1,27
Fibulin-1 1,54
Follistatin-related protein 1 1,20
Glia-derived nexin 1,54
Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 0,65
Insulin-like growth factor-binding protein 2 1,28 1,27
Insulin-like growth factor-binding protein 3 1,19
Insulin-like growth factor-binding protein 7 1,64 1,43 1,53Interstitial collagenase (MMP1) 28,71Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,37
Nucleobindin-1 1,20
Pentraxin-related protein 2,41
Periostin 0,58
Plasminogen activator inhibitor 1 1,33
Prolargin (PRELP) 1,93
Serpin H1 0,61
Stromelysin-1 (MMP3) 13,44
Tenascin 1,22 0,74
Thrombospondin-1 1,83 1,24
Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 0,78 0,60
Vimentin 1,46
Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA
• El CS porcino induce rutas inflamatorias y catabólicas
• El CS bovino (99%) induce anabolismo
• Utilidad del análisis proteómico para el screening de fármacos anti-OA
4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ.
ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA
EFECTO DE CS Y GH SOBRE EL SECRETOMA
Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA
GO_id Term Nº of protein p-value
GO:0030198 extracellular matrix organization 41 2.71E-38
GO:0030199 collagen fibril organization 15 5.89E-19
GO:0001501 skeletal system development 33 6.4E-17
GO:0007155 cell adhesion 41 1.41E-13
GO:0046903 secretion 33 1.43E-13
GO:0061448 connective tissue development 17 1.65E-10
GO:0001503 ossification 18 4.2E-10
GO:0051216 cartilage development 15 5.71E-10
GO:0016192 vesicle-mediated transport 35 8.41E-9
GO:0001525 angiogenesis 19 9.22E-9
GO:0032963 collagen metabolic process 8 2.98E-8
GO:0001502 cartilage condensation 6 2.12E-7
GO:0030334 regulation of cell migration 21 2.52E-7
GO:2000145 regulation of cell motility 21 6.18E-7
GO:0006950 response to stress 68 6.76E-7
GO:0036293 response to decreased oxygen
levels 16 7.52E-7
GO:0042127 regulation of cell proliferation 39 8.03E-7
GO:0006916 anti-apoptosis 16 8.5E-7
260 PROTEÍNAS
DISMINUIDAS POR EFECTO DEL CS
Degradación MEC Cathepsin D 75%
Cathepsin L1 69%
Chaperonas Calreticulin 49%
Heat shock protein HSP 90-beta 57%
INCREMENTADAS POR EFECTO DEL CS
Componentes MEC Aggrecan core protein 56%
Hyaluronan and proteoglycan link prot 1 73%
Adhesión celular Tenascin 71%
Thrombospondin-1 90%
Vascular cell adhesion protein 1 43%
Coiled-coil domain-containing protein 80 77%
Thrombospondin-1 (TSP1): Inhibidor de angiogénesis
INCREMENTO DE TSP1 POR CS
Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA
1,00
0,07
0,22*
0,01
0,1
1
10
BASAL IL1β IL1β+CS
1,00
2,09
0
0,5
1
1,5
2
2,5
BASAL CS
OA N
CTL CS CTL IL1β IL1β+CS
1,00
0,45
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
N OA
N OA
mRNA TSP1
WB
CTL GH CS C+G
TSP1
TUB
CTL IL1β IL+CS
TSP1 (secretoma)
TSP1 (proteoma)
TUB
WB Los niveles de TSP1 están
disminuidos en condrocitos OA vs N y en condrocitos N
estimulados con IL1β.
mR
NA
TSP
1/m
RN
A h
ou
seke
epin
g ge
ne
CS aumenta los niveles de TSP1 (mRNA y proteína) en
ambos casos.
La inhibición de angiogénesis, posible mecanismo de acción del CS
CONCLUSIONES
Conclusiones
Los estudios de farmacoproteómica del CS han permitido:
• Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción del CS en las células del cartílago articular.
• Poner de manifiesto el papel del CS sobre la función mitocondrial y la inhibición de la angiogénesis, entre otros.
• Evaluar el efecto de diferentes composiciones de CS en las células del cartílago articular.
MÁS FÁRMACOPROTEÓMICA…
Estudio proteómico MOVES
Identificación de proteínas marcadoras de respuesta terapéutica a CS+GS (Droglican) o Celecoxib (Celebrex)
Estudio proteómico en suero de pacientes del Multicentre Osteoarthritis interVEntion trial with Sysadoa (MOVES)
Identificación mediante iTRAQ y LC-MS/MS de proteínas cuantitativamente alteradas en respondedores a los fármacos
…Continuará!
Proteomics Group ProteoRed-PRB2/ISCIII
Cristina Ruiz-Romero Dr. Francisco J.
Blanco
Rheumatology Division INIBIC-Hospital Universitario de A
Coruña
Valentina Calamia
Jesús Mateos
Patricia Fernández-Puente
Beatriz Rocha
Lucía Lourido
María Camacho
Nancy M. Parra
Lucía González
MJ López-Armada
(CS y mitocondria)
Colaboradores