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•Glicosilación, fosforilación y otras modificaciones covalentes de proteínas
La secuencia de aminoácidos de la proteína no siempre refleja la secuencia contínua de nucleótidos en el genoma
•splicing de pre-mRNA (eliminación de intrones)
•splicing alternativo (varios polipéptidos a partir de la misma secuencia de DNA)
•corrimiento del marco de lectura (translational frameshifting)
•edición del mRNA
•procesamiento proteolítico de polipéptidos (en algunos casos se obtienen productos alternativos en diferentes tipos celulares)
•splicing de proteínas (eliminación de inteínas)
los RNAs pueden procesarse de diferente manera eliminando parte del producto de transcripción
original
UGA C
UGA
RF2
Pausa
Frameshift(UGAC se lee como GAC y sigue +1)
GAC
RF2
Unión de RF2 terminación de la traducción
Corrimiento del marco de lecturaTranslational frameshifting
The group antigens form the viral core structure, RNA genome binding proteins, and are the major proteins comprising the nucleoprotein core particle. Reverse transcriptase is the essential enzyme that carries out the reverse transcription process that take the RNA genome to a double-stranded DNA preintegrate form
HIV
p55 proteasa
Proteasa p10Proteasa p10
Transcriptasa reversa p50Transcriptasa reversa p50RNAsa p10RNAsa p10
integrasaintegrasa
Modificación de proteínas
1. las proteínas sufren modificaciones post-traducionales (y co-traduccionales)
2. la actividad biológica puede depender de las modificaciones
3. la espectrometría de masas es uno de los mejores métodos para identificar las modificaciones
• Protein Post-translational Modifications
1. Folding and Processing of Proteins
-During translation proteins fold as they exit ribosome-Some proteins can assume native 3D structure spontaneously-Other proteins may require chaperones
• Protein Post-translational Modifications2. Amino-terminal and carboxyterminal modifications
-Cleavage of f-Met from bacterial proteins or Met fromeukaryotic proteins. Other amino acids may be trimmed as well.-Acetylation of Met or other N-terminal amino acids-Removal of signal peptide for secreted or membrane proteins-Removal of C-terminal amino acids.
• Protein Post-translational Modifications3. Modification of Individual Amino Acids
a. Phosphorylation-Enzymatic reaction by specific kinases- Usually on Ser, Thr, Tyr
• Protein Post-translational Modifications
3. Modification of Individual Amino Acids
b. CarboxylationAddition of extra carboxyl groups to Asp and Glu
c. MethylationAddition of methyl groups to Lys and Glu
• Protein Post-translational Modifications
3. Modification of Individual Amino Acids
d. Isoprenylation-Addition of an isoprenyl group to a protein at either theC-terminus or the N-terminus-Derived from pyrophosphate intermediate in cholesterolbiosynthesis
• Protein Post-translational Modifications
3. Modification of Individual Amino Acids
e. Addition of prosthetic groupsCovalently bound prosthetic group – required for activityExample: Cytochrome C -- Heme group
• Protein Post-translational Modifications
3. Modification of Individual Amino Acids
f. Proteolytic ProcessingSome types of proteins are synthesized as a larger, inactiveprecursor protein and must be cleaved for activity
g. Formation of disulfide bonds-Spontaneous cross-linking at Cys residues-Brought into proximity by folding-Helps to stabilize 3D structure
• Protein Post-translational Modifications
3. Modification of Individual Amino Acids
h. Glycosylation-Addition of oligosaccharides to proteins-Usually at Asn-Sugars are transferred from dolichol-P-Present in ER
• Protein Post-translational Modifications
4. Methods to Discover Modifications
a. Enzymatic methodsPhosphatases – remove phosphate groupsGlycosylases – remove carbohydrates
b. Physical methods1. Hydrolysis in 6N HCl – amino acid composition2. Digestion with specific protease or chemical agent3. Sequence of peptide by Edman Chemistry4. Mass Spectrometry (MALDI-TOF)
Alternative processing pathways of the prohormone pro-opiocortin. The initial cleavages are made by membrane-bound proteases that cut next to pairs of positively charged amino acid residues (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys, or Arg-Arg pairs), and trimming reactions then produce the final secreted products. Different cell types contain different processing enzymes, so that the same prohormone precursor can be used to produce different peptide hormones. In the anterior lobe of the pituitary gland, for example, only corticotropin (ACTH) and b-lipotropin are produced from pro-opiocortin, whereas in the intermediate lobe of the pituitary, mainly a-MSH, g-lipotropin, b-MSH, and b-endorphin are produced.
Rutas de procesamiento alternativas de la prohormone pro-opiocortina
Protein Splicing
http://soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/inteins.gifT. littoralis is the source of vent DNA polymerase, used extensively in PCR. When scientists at New England Biolabs cloned the gene for the enzyme, they were surprised to find that it contains an extra sequence of non-DNA-polymerase. They assumed it was an intron, but found that the mRNA isn't spliced and the extra sequence is translated into a novel domain in the enzyme. This polypeptide domain is a peptidyltransferase that specifically splices itself out of the DNA polymerase, rejoining the 2 parts of the DNA polymerase as it leaves. This protein-splicing reaction is remarkably analogous to RNA-splicing by introns, and so it's called an 'intein' (intervening protein). Once the intein has removed itself from the DNA polymerase, it has another activity - it is a transposase. This enzyme cleaves DNA specifically at the ends of the intein-encoding sequence and directs a DNA repair process that results in the insertion of the intein DNA into other protein-encoding genes - in other words, the intein DNA is also a transposon.
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS EN EUCARIOTES:
SEÑALES DE LAS PROTEÍNAS QUEDETERMINAN SU DIRECCIONAMIENTO CELULAR.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1999
"for the discovery that proteins
have intrinsic signals that
govern their transport and
localization in the cell"
Günter Blobel
USA
Rockefeller University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute
Signal hypothesis
1971: “Las proteínas secretadas al espacio extracelular contienen una señal intrínseca que las dirige hacia y a través de las membranas”
Signal hypothesisSignal hypothesis
• La traducción de poly(A) mRNA de células de mieloma (principalmente mRNA de IgG) en un sistema
libre de células carente de vesículas microsomales genera una proteína 2-3kDa mayor.
• El mapa peptídico indica que la extensión se encuentra en el amino terminal
Milstein, C. et al., Nature New Biology 239: 117-120, 1972
Experimentos utilizando microsomas
Las proteínas del lumen de los microsomas no son atacadas
por proteasas
Descubriendo cómo trabaja la secuencia señal…
La secuencia señal es hidrolizada en el lumen del ER
La secuencia señal dirige la proteína al microsoma. Este proceso es una translocación co-traduccional
Signal hypothesisSignal hypothesis
• “La señal consiste en una secuencia de aminoácidos que forma parte integral de la proteína”
• “La proteína atraviesa la membrana mediante un canal”
1975:
Ruta secretoria
Las proteínas destinadas para la secreción o incorporación al ER, Golgi, lisozoma o membrana plasmática son sintetizadas en ribosomas asociados a membrana y transferidas al RER durante su síntesis
¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria?
• Una señal en la proteína
• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta
• Una maquinaria de translocación, un canal
• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína
¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria?
• Una señal en la proteína
• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta
• Una maquinaria de translocación (un canal)
• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína
Se requieren múltiples secuencias topogénicas para las proteínas de transmembrana de pasaje múltiple
Las proteínas destinadas al citosol o a ser incorporadas en el núcleo, mitocondria, cloroplasto o peroxisoma son sintetizadas a partir de ribosomas libres
POST TRADUCCIONALES!!
¿Qué elementos son requeridos para el direccionamiento mitocondrial?
• Una o más señales en la proteína
• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta
• Una maquinaria de translocación, un canal
• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína
• Chaperonas para desplegar la proteína ya sintetizada
•ATP en el citosol, • fuerza protón motriz a través de la membrana interna
• ATP en la matriz
emplea
ENERGIA CHAPERONAS
•citosólicas y •Matriz mitocondrial
Se requieren múltiples rutas y señales para dirigir las proteínas a los distintos compartimientos Se requieren múltiples rutas y señales para dirigir las proteínas a los distintos compartimientos submitocondrialessubmitocondriales
Se requieren múltiples Se requieren múltiples
rutas y señales para rutas y señales para
dirigir las proteínas a dirigir las proteínas a
los distintos los distintos
compartimientos compartimientos
submitocondrialessubmitocondriales
¿Qué elementos son requeridos para entrar al cloroplasto?
• Una o más señales en la proteína
• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta
• Una maquinaria de translocación, un canal
• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína
• Chaperonas para desplegar la proteína ya sintetizada
Secuencias C- o N-terminal dirigen la entrada de proteínas proteínas plegadasplegadas a la matriz del peroxisoma
Peroxisoma
Las proteinas con la señal de localización nuclear (NLS) son reconocidas por receptores y transportadas al núcleo
Antígeno T de SV40
¿Qué elementos son requeridos para la entrada al núcleo?
• Una REGION SEÑAL en la proteína (no es clivada!!)
• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína
• Una maquinaria de translocación, un canal
• Energía para translocar la proteína
Post-translational modifications and quality control in the rough ER
• Newly synthesized polypeptides in the membrane and lumen of the ER undergo five principal modifications– Formation of disulfide bonds– Proper folding– Addition and processing of carbohydrates– Specific proteolytic cleavages– Assembly into multimeric proteins
The immediate precursors in the synthesis of oligosaccharides are nucleoside diphosphate
or monophosphate sugars