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La La GOTAGOTA::Un modelo de Un modelo de
investigaciinvestigacióón n traslacionaltraslacional
Dr. Juan García Puig,Unidad Metabólico - VascularServicio de Medicina Interna (Prof. Francisco Arnalich),Hospital Universitario La Paz, Madrid.
Dra. Rosa Torres JiménezUnidad Metabólico - VascularServicio de BioquímicaHospital Universitario La Paz, Madrid.
El Dr. Juan García Puig ha sido consultado por AstraZeneca, BMS, GSK, Novartis, y Pfizer, y ha colaborado en investigaciones de las siguientes empresas farmacéuticas: AstraZeneca, BMS, Boeghringer, Chiesi, GSK, Menarini, MSD, Novartis, Recordati, Sanofi-Aventis, Sankyo, y Servier.
Investigación traslacional
IndiceIndice
1. ¿Qué es la investigación 1. ¿Qué es la investigación traslacionaltraslacional??
2. ¿Por qué la 2. ¿Por qué la GOTAGOTA / / MetabMetab. Purinas?. Purinas?
3. Perspectiva … de esta investigación.3. Perspectiva … de esta investigación.
1. ¿Qué es la investigación 1. ¿Qué es la investigación traslacionaltraslacional??
Investigación traslacional
Investigación traslacional
Investigación Investigación ClínicaClínica
Investigación Investigación BásicaBásica
Pensando … en el Pensando … en el Paciente.Paciente.
Investigación traslacional
IndiceIndice
1. ¿Qué es la investigación 1. ¿Qué es la investigación traslacionaltraslacional??
2. ¿Por qué la 2. ¿Por qué la GOTAGOTA / / MetabMetab. Purinas?. Purinas?
3. Perspectiva … de esta investigación.3. Perspectiva … de esta investigación.
2017
R5P + ATP
PRPPPRPPsPRPPs
IMP AMPGMP
Inosina AdenosinaGuanosina
Guanina Hipoxantina
Xantina
Acido Urico
XOXO
XOXO
HGPRTHGPRT
Adenina
APRTAPRT
Metabolismo de las PURINASMetabolismo de las PURINAS
1952 1970 1980 1990 2000 20081976
Investigación traslacional
20171952 1970 1980 1990 2000 20081976 1980 1990 2000 2008
2010
MetabolismoMetabolismo de de PurinasPurinas
1. 1. ContestarContestar preguntaspreguntas derivadasderivadas de de actosactos médicosmédicos..
2. En 2. En colaboracióncolaboración con con otrasotras especialidadesespecialidades..
Caricatura del s. XVIII. Caricatura del s. XVIII.
BBBB
Puig JG, et al. Arch Intern Med 1991;151:726-32.
GOTA en mujeres. GOTA en mujeres.
R5P + ATP
PRPPPRPPsPRPPs
IMP AMPGMP
Inosina AdenosinaGuanosina
Guanina Hipoxantina
Xantina
Acido Acido UricoUrico
XOXO
XOXO
HGPRTHGPRT
Adenina
APRTAPRT
Metabolismo de las PURINASMetabolismo de las PURINAS
AUAU
Relación Relación UricemiaUricemia / / UricuriaUricuriaen 10 controles.en 10 controles.
García Puig J, et al. Nephron 1983;35:183-6.
Relación Relación UricemiaUricemiauricuriauricuria en en 10 sujetos control.10 sujetos control.
García Puig J, et al. Nephron 1983;35:183-6.
100 enfemos con Gota. Uricemia / Uricuria.
Puig J, et al. Metabolism1986; 35:1147-53.
100%
12%
99.7 + 0.1
39.1 + 1.8
69.7 + 1.8
NormalesNormales
García Puig J, et al. Nephron 1983;35:183- 6.
100%
6%6%
99.6 + 0.3
24.1 24.1 ++ 1.41.4
79.1 + 1.2
GOTAGOTA
García Puig J, et al. Metabolism 1986;35:1147-53 .
100%
6%6%
GOTAGOTA
García Puig J, et al. Metabolism 1986;35:1147-53 .
Investigación traslacional
¿Por qué los enfermos con ¿Por qué los enfermos con GOTAGOTA excretan excretan menos ácido úricomenos ácido úrico??
Investigación Investigación ClínicaClínica
Investigación Investigación BásicaBásica
100%
6%6%
GOTAGOTA
García Puig J, et al. Metabolism 1986;35:1147-53 .
Transporte Celular de Urato
Membrana apicalMembrana Basolateral
Reabsorción
SecreciSecrecióónn
Célula del epitelio del tubulo proximal
Los niveles de úrico parecen tener un componente Los niveles de úrico parecen tener un componente genéticogenético
Análisis de segregación en 523 familias
La contribución de la herencia a los niveles de ácido úrico en suero es aproximadamente de un 40%
25-40% pacientes con gota: Historia familiar
Análisis Molecular del gen URAT1(SLC22A12) en pacientes con gota e
infraexcrección de urato
FIS 08/0009 (2009-2011)
Nature (2002)
URAT1 o SLC22A12 fue el primer URAT1 o SLC22A12 fue el primer trasportador de urato identificado trasportador de urato identificado
en humanos en humanos
El urato se encuentra fundamentalmente en forma de un ácido débil a pH fisiológico: Estructura similar a los miembros de la Familia de Transportadores de Aniones(OAT).Busqueda Draf Human genome Database: Secuencia semejante a OAT4 EN 11q13. Gen SLC22A12Aislamiento (3’ RACE) cDNA URAT1 de 2642 pb en riñón humano.
Riñon, Tubulo proximal Intercambia urato con aniones orgánicos
URAT1 es regulado por
•Drogas uricosuricas
•Drogas Antiuricosuricas
•Hormonas
Gen URAT1, Cromosoma 11 región 11q13.1
Mutaciones en el gen URAT1 ocasionan Hipouricemia Renal idiopática (MIM 220150)
Mutación en 16/69 (23%)
URAT1 regula los niveles de ácido úrico en sangre
Polimorfismos de un solo nucleótido en intron 4 del gen URAT1 o SLC22A12326 sujetosNiveles de úrico: GG > GT > TTG>T en posición rs893006 está asociado con niveles de úrico menores
Polimorfismos en la región N-terminal de URAT1 se asocian con una menor excreción renal de urato.Análisis en 652 individuos con EFU Normal o Descendida (6.5%)
POLIMORFISMOS DE UN UNICO NUCLEOTIDOPOLIMORFISMOS DE UN UNICO NUCLEOTIDO
Lisina
Lisina
Sinónimo MissenseSerina
Alanina
Transporte Celular de Urato
Membrana apicalMembrana Basolateral
Reabsorción
SecreciSecrecióónn
Célula del epitelio del tubulo proximal
Transporte Celular de Urato. Otros candidatos: SLC2A9 o GLUT9
L75R en homozigosis: hipouricemia renal congénita
GTT 253 ATTValina Isoleucina
Mayor excreción, menores niveles de úrico, menor riesgo de gota
0
20
40
60
80
100
CONTROL GOTA
AAGAGG
Transporte Celular de Urato
Membrana apicalMembrana Basolateral
Reabsorción
SecreciSecrecióónn
Célula del epitelio del tubulo proximal
Transporte Celular de Urato. Otros candidatos: ABCG2
Glutamina 141 LisinaCAG AAG
53% reducción transporte
Transporte Celular de Urato. Otros candidatos: ABCG2
0
20
40
60
80
100
Controles
(%)
CC CA AAGotaGota
CC CA AA
96,3%
3,7%0%
77,5%
19,0%
3,5%
Controles
22,5%22,5%
100%
6%6%
GOTAGOTA
García Puig J, et al. Metabolism 1986;35:1147-53 .
Resumen: Resumen: ABCG2ABCG2
22,5%22,5% enfermos con GOTAGOTA
100%
6%6%
99.6 + 0.3
24.1 24.1 ++ 1.41.4
79.1 + 1.2
GOTAGOTA
García Puig J, et al. Metabolism 1986;35:1147-53 .
Investigación traslacional
Investigación Investigación ClínicaClínica
Investigación Investigación BásicaBásica
¿Por qué los enfermos con ¿Por qué los enfermos con GOTAGOTA excretan excretan menos ácido úricomenos ácido úrico??
• Posibilidad de corregir el defecto: terapia génica (?)uricosúricos (?)
• Saber si sus familiares presentan (rán) esta patología
Investigación traslacional
20171952 1970 1980 1990 2000 20081976 1980 1990 2000 2008
2010
MetabolismoMetabolismo de de PurinasPurinas
1. 1. ContestarContestar preguntaspreguntas derivadasderivadas de de actosactos médicosmédicos..
2. En 2. En colaboracióncolaboración con con otrasotras especialidadesespecialidades..
Primer pacientePrimer paciente HPRTHPRT-- , , DxDx en España.en España.
García Puig J, et al. Med Clin (Barc) 1985; 85:300-1.
HPRT DeficiencySpanish patients 1984-2010; n=40
LP
M
V
B
A
R
PP
And
H
Z2
C2
A3
Z
S3
M2F
GSA
S2
S
A4
A5C
PartialPartial, n=1, n=144..S. LeschS. Lesch--Nyhan, n=Nyhan, n=2626
C2
GC
B1B2
V2
V1M3
BL
E
M4
C
V3
30 Mayo 30 Mayo 20082008: Asociaci: Asociacióón de enfermos con Leschn de enfermos con Lesch--NyhanNyhan
Figura 107-3. Paciente con deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT): Lesiones de automutilación en labios
Video ECUADOR. Rosa
FamilaFamila ViñesViñes. Almodóvar del Campo. 1996 . Almodóvar del Campo. 1996
Clasificación Clínica de HPRT Clasificación Clínica de HPRT __: : 4 tipos4 tipos
Tipo 1 Tipo 2
Tipo 3
Tipo 4
Investigación traslacional
Investigación Investigación ClínicaClínica
Investigación Investigación BásicaBásica
Estudio GENETICO• Estudio genético paciente
• PORTADORAS
• Genotipo - fenotipo
• Afectación Neurológica
Estudios Familiares
¿ Heredado o mutación de novo (nueva) ?
Mujeres portadoras asintomáticasActividad HPRT en hemolisado normal.
Diagnóstico molecular
1 2 3 4 5 6 7 98
Torres RJ, Mateos FA, Molano J, Gathoff BS, O'Neill JP, Gundel RM,Trombley L, Puig JG: Molecular basis ofhypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency in thirteen Spanish families. Hum Mutat 2000, 15:383.
Secuencia normalGAT ATA ATT GACAsp Ile Ile Asp
Secuencia mutada
GAT AAAT AAT TGAAsp Asn Asn Stop138
PACIENTEINSERCIÓN AA en posición 405, EXON 6EXON 6
DOBLE SECUENCIA DOBLE SECUENCIA
MadreHeterozigota INSERCIÓN A
VELLOSIDAD CORIALHeterozigota INSERCIÓN AA A
HPRT HPRT
1 2 3 4 5 6 7 98normalnormal
Uricemia, 17.117.1 mg/dL.
.
PCR a PCR a tiempotiempo Real.Real.Nueva Nueva metodologmetodologííaa de de diagndiagnóósticostico
mRNAmRNA
0
100
200
300
400
500
600
700
HPRT/Actin Ratio
CLN1P4P3P2P1
Defecto de expresión Defecto de expresión de un gen normalde un gen normal
Torres RJ, et al. Mol Genet Metab 2008;94:167-72
Investigaciones en marcha: Correlación GenotipoCorrelación Genotipo--FenotipoFenotipo.
1 2 3 4 5 6 7 98
Fenotipos variantes suelen presentar mutaciones puntuales que no cambian el tamaño de la proteína
Correlación Genotipo-Fenotipo
Exon 5 Mutación en INTRON
AG > GG
Exon 6
Exon 5
Exón 4 Exón 6
Ocasiona la falta de un exon
El paciente tenía mensajero bien procesado (con exon 5)
394pb653pb1000pb
EXÓN 4 EXÓN 5EXÓN 4 EXÓN 5
394pb653pb1000pb
EXÓN 6EXÓN 4 EXÓN 6EXÓN 4
Control
Patient A
Pero no en cantidad suficiente para explicar el fenotipo
R5P + ATP
PRPP
IMP
Hipoxantina
Xantina
Acido Urico
HPRTHPRT Inosina
¿Porqué la ¿Porqué la deficienciadeficiencia HPRT HPRT --
??
ocasiona manifestaciones NEUROLOGICAS?ocasiona manifestaciones NEUROLOGICAS?
Relación entre Relación entre deficiencia HPRT deficiencia HPRT --y disfunción y disfunción dopaminérgicadopaminérgica..
R5P + ATP
PRPP
IMP
Hipoxantina
Xantina
Acido Urico
InosinaHPRTHPRT
AMP
AADDEENNOOSSIINNAA
AA
AdenosinaAdenosina
DopaminaDDNTAA
Torres RJ y García Puig J. Proyectos financiados, CAM, FIS, REDEMETH.
La deficiencia de HPRT ocasiona HIPOXANTINA
R5P + ATP
PRPPPRPPsPRPPs
IMP AMPGMP
Inosina AdenosinaGuanosina
Guanina Hipoxantina
Xantina
Acido Acido UricoUrico
XOXO
XOXO
HGPRTHGPRT
Adenina
APRTAPRT
Hipoxantina
Fisiopatologia de las manifestaciones neurológicas
• En el sistema nervioso la AdenosinaAdenosinaactua como un neurotransmisor
• Se une a receptores específicos y cuando finaliza su acción estransportada al interior de la célula.
• La DopaminaDopamina también se une receptores específicos.• Los receptores de AdenosinaAdenosina yy DopaminaDopamina están “acoplados”.
LaLa AdenosinaAdenosina modulamodula la la neurotransmisineurotransmisióónnDopaminDopaminéérgicargica..
¿Deficiencia de HPRT – afecta el transporte de AdenosinaAdenosina?
5
6
7
8
9
10
11
0 1 5 25 50
LNControl
Hypoxanthine (µM)[2-3 H
] Ade
nosi
neT
rans
port
(pm
ol/1
06 cel
ls/m
in)
* *
* *
El exceso de HIPOXANTINA disminuye el transporte de AdenosinaAdenosina.
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 120
2
18
0 2 4 6 8 10 12
Adenosina (µM)
Tran
spor
te d
e (2
-3 H)A
deno
sina
(pm
ol/m
illce
l/min
)
ControlControlS. LeschS. Lesch--NyhanNyhan ControlControl
SLNSLN
**
**
*P<0.01
Torres RJ, et al. Biochem J. 2004;377:733-9.
El exceso de HIPOXANTINA reduce el transporte de AdenosinaAdenosina.
A
AAAH
HH H
AMPcAMPc
A
ReceptorAdenosina
500
600
700
800
900
1000
1100
0 5 25
cAM
P(f
mol
/mill
cells
)
* #
500
600
700
800
900
1000
1100
0 5 25
cAM
P(f
mol
/mill
cells
)
* #
500
600
700
800
900
1000
1100
0 5 25
cAM
P(f
mol
/mill
cells
)
* #
500
600
700
800
900
1000
1100
0 5 25
cAM
P(f
mol
/mill
cells
)
* #
RcptrDopam
D
**
67%; p<0,001
**
Control SLN
,5
1,5
2,5
3,5
,5
1,5
2,5
3,5
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5Recept AdenosinaAdenosina
Control SLN
Recept DopaminaDopamina**
0
5
10
15
20
Al disminuir el transporte de AdenosinaAdenosina se altera la neurotransmisión de Dopamina.Dopamina.
Investigación traslacional
IndiceIndice
1. ¿Qué es la investigación 1. ¿Qué es la investigación traslacionaltraslacional??
2. ¿Por qué la GOTA / Purinas?2. ¿Por qué la GOTA / Purinas?
3. Perspectiva … de esta investigación.3. Perspectiva … de esta investigación.
Investigación traslacional
InvestigInvestig. . Básica
•• Recursos limitadosRecursos limitados•• Grupos competitivosGrupos competitivos•• “Masa crítica”“Masa crítica”
InvestigInvestig. . Clínica BásicaClínica
Pensando … en el Pensando … en el Paciente.Paciente.
¿Cuántos enfermos pueden beneficiarse ¿Cuántos enfermos pueden beneficiarse de la de la investigación investigación traslacionaltraslacional??