Post on 06-Jan-2017
transcript
Ingeniería en Biotecnología
1
PRACTICA DE LABORATORIO # 1
1. TEMA: Propiedades iónicas de los aminoácidos: curvas de titulación de la glicina e histidina
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Demostrar las propiedades ácido-base de los aminoácidos y obtener la curva de
titulación de los mismos experimentalmente.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Realizar la titulación de un aminoácidos neutro como la glicina y obtener la curva
experimental correspondiente (mitad del curso).
Realizar la titulación de un aminoácido básico como la histidina y obtener la curva
experimental correspondiente (mitad del curso).
Analizar los resultados obtenidos en la titulación y contrastar los resultados
experimentales con los teóricos para cada aminoácido.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los aminoácidos son moléculas cuya estructura incluye al menos un grupo ácido y básico
gracias a los cuales presentan propiedades anfotéricas y se los denomina por esta razón
anfolitos. Los anfolitos son moléculas capaces de aceptar y donar y donar protones (Universidad
Nacional de San Luis, 2011).
En este contexto, de manera general los aminoácidos presentan una forma completamente
protonada en condiciones de pH bajos con una carga neta positiva, cuando la solución se acerca
a la neutralidad los aminoácidos presentan una forma de ion dipolar (zwiterión) la misma que
posee una carga neta cero (carga positiva y negativa a la vez que se anulan mutuamente) y
cuando el pH se vuelve muy básico los aminoácidos presentan una forma completamente
desprotonada con una carga neta de menos uno.
Cuando tenemos una solución de aminoácidos, esta se encuentra en equilibrio entre las formas
completamente protonada, ion dipolar y completamente desprotonada (Universidad Nacional de
Asignatura: Bioquímica I Sigla: IBT411 Período: 2016-1
Paralelos: 1 y 2 Sesiones: 2 Profesora: Ing. Gabriela Granja MSc.
Ingeniería en Biotecnología
2
San Luis, 2011). En la Figura 1 se pueden apreciar la disociación del aminoácido glicina y en la
Figura 2 de la histidina.
Por otro lado, la curva de titulación de los aminoácidos es la representación gráfica de la
variación del pH de una solución por la adición de equivalente de ácido o de base que nos
permite conocer y/o deducir algunos datos tales como: a) valores de pK de los grupos ionizables,
b) regiones con capacidad tamponadora, c) punto isoeléctrico (pI), el mismo que visualmente
representa el intervalo de viraje, d) formas ionizables en cada rango de pH, e) carga eléctrica del
aminoácido en cada rango de pH, f) solubilidad del aminoácido en cada rango del pH.
En cuanto a la curva de titulación de la glicina (Véase Figura 1), se pueden realizar las siguientes
observaciones1:
1. La Glicina se encuentra como un ácido diprótico a pH ácido, ya que sus grupos tanto amino
como carboxilo se encuentran protonados, es decir, a pH = 1, el 100% de las moléculas de
aminoácido se encuentran en forma de catión o en forma completamente protonada.
2. Al ir añadiendo equivalentes de base, el grupo α-carboxilo (-COOH) se disocia, cediendo
protones al medio y transformándose en un grupo carboxilato; este equilibrio viene descrito
por el pK1. Cuando pH = pK1, la glicina se encuentra 50% catión o forma completamente
protonada + 50% zwiterión o ion dipolar. Por lo tanto, el par -COOH/-COO- puede servir
como un tampón amortiguador en la región de pH cerca del valor pK1.
3. En el pI, prácticamente el 100% del aminoácido se encuentra como ion dipolar o
zwitterion, de forma tal que el aminoácido presenta una carga neta nula (el aminoácido es
eléctricamente neutro).
4. Si se siguen añadiendo equivalentes de base, el grupo amino (-NH3 +) se disocia también,
obteniéndose la forma totalmente desprotonada de la glicina; este equilibrio está definido
por el pK2. Cuando pH = pK2, la glicina se encuentra como 50% zwiterión o ion dipolar +
50% anión o forma completamente desprotonada. Por lo tanto, el par -NH3 +/-NH2 puede
actuar como un sistema tampón ó disolución amortiguadora en la región de pH cerca del
pK2.
5. A pH muy elevados, el 100% de las moléculas de aminoácido se encuentran en forma de
anión o forma completamente desprotonada.
A su vez, en cuanto a la curva de titulación de la histidina2 (Véase Figura 2) todos los puntos
establecidos anteriormente se cumplen con el mismo principio. Pero al ser un aminoácido con
tres grupos ionizables su comportamiento varía de tal forma que al añadir equivalente de base a
la solución esto produce una liberación secuencial de protones al medio. Las constantes que
determinan los equilibrios de esta reacción están determinadas por tanto por el pK1 (grupo
carboxilo), pKr (grupo radical imidazol) y pK2 (grupo amino). Sus regiones tamponantes están
por tanto en un valor de pK ±1, y el valro de pI se calcula como el promedio de pK2+pKr.
1 En base a la guía de laboratorio de Gonzales, 2013.
2 Ibídem.
Ingeniería en Biotecnología
3
Figura 1.- Reacción de ionización y curva de titulación de la Glicina (Tomado de: Lehninger,
2008).
Figura 2.- Reacción de ionización y curva de titulación teórica de la Histidina (Tomado de:
Lehninger, 2008).
Ingeniería en Biotecnología
4
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1. MATERIALES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Guantes de manejo TM (10 pares)
Guantes de manejo TL (5 pares)
Guantes de manejo TS (10 pares)
Pinza doble para bureta (6)
Agitadores Magnéticos (1)
Gafas de protección (25)
Pipeteador de Embolo de 5 - 10 ml (6)
Recipientes para pesaje blanco M (3)
Soporte universal (6)
Cucharillas metálicas (6)
Buretas con llave 25ml-0.5ml (6)
Vasos de precipitación 500 mL (6)
Balón aforado 250 mL (7)
Probetas 250ml (6)
Pipetas volumétricas 10 ml (13)
Balón aforado 100 mL (3)
Frascos ámbar para almacenamiento de soluciones (2)
5.2. REACTIVOS (para 6 grupos de 4 personas c/u)
100 mL HCL (1M) o
Ácido clorhídrico, HCl concentrado (8,29 mL)
Agua destilada 91,71 mL
250 mL NaOH (1M) o
Hidróxido de sodio, NaOH (9,999 g)
Agua destilada 250 mL
100 mL Glicina (1M) o
Glicina (7,506 g).
Agua destilada (100 mL)
Agua destilada (2L)
5.3. EQUIPOS (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Planchas agitación (1).
Ingeniería en Biotecnología
5
Potenciómetro calibrados (6).
Balanza analítica (1).
6. MÉTODOS
6.1. Preparación de soluciones para la práctica (profesora, no incluir en su informe)
6.1.1. HCl 1M
Añadir 8.29 mL de HCl concentrado a 80 mL de dH20 previamente colocados en un
balón aforado de 100 mL. Aforar a 100 mL con agua destilada.
6.1.2. Glicina 1M (pm=75.07 g/mol)
Pesar 7,507 gr de glicina, colocar en un balón aforado de 100 mL y aforar con agua
destilada.
6.1.3. Histidina 1M (pm=155.1 g/mol)
Pesar 15.51 gr de histidina, colocar en un balón aforado de 100 mL y aforar con agua
destilada.
6.1.4. NaOH 1M (39.997 g/mol)
Pesar 9,999 gr de NaOH, colocar en un balón aforado de 250 mL, agitar por 5 minutos y
aforar con agua destilada.
6.2. Preparación de solución de Glicina (0,05M) ácida (1-2)
6.2.1. Preparar la solución de glicina ácida en un balón aforado de 200 mL.
6.2.2. Usando una pipeta volumétrica medir exactamente 10 mL de solución de Glicina
(1M) y añadir al balón aforado.
6.2.3. Usando otra pipeta volumétrica medir exactamente 10 mL de HCl (1M) y añadir al
balón aforado.
6.2.4. Usando una probeta medir exactamente 180 mL de agua destilada y aforar la
solución.
6.2.5. Homogenizar por inversión teniendo cuidado de tapar bien para que no se
derrame ni una sola gota.
NOTA: La concentración final de la glicina será de 0,05M debido a la dilución que
sufre por la adición de agua y HCl.
Ingeniería en Biotecnología
6
6.3. Preparación de solución de Histidina (0,05M) ácida (1-2)
6.3.1. Preparar la solución de histidina ácida en un balón aforado de 250 mL.
6.3.2. Usando una pipeta volumétrica medir exactamente 10 mL de solución de hisitidina
(1M) y añadir al balón aforado.
6.3.3. Usando otra pipeta volumétrica medir exactamente 10 mL de HCl (1M) y añadir al
balón aforado.
6.3.4. Usando una probeta medir exactamente 180 mL de agua destilada.
6.3.5. Homogenizar por inversión teniendo cuidado de tapar bien para que no se
derrame ni una sola gota.
NOTA: La concentración final de la histidina será de 0,05M debido a la dilución
que sufre por la adición de agua y HCl.
6.4. Titulación de la glicina o histidina (1-2)
6.4.1. Colocar en un matraz de 500 mL la solución de glicina o histidina ácida a titularse.
6.4.2. Llenar la bureta con la solución de NaOH 1M ajustando la llave de la bureta,
dejando previamente caer un poco de la solución antes de cerrar la llave, con el fin
de eliminar posibles residuos de agua y armar el equipo de titulación como se
muestra en la Figura 3.
6.4.3. Colocar la bureta en la pinza de modo que el pico quede dentro del vaso.
6.4.4. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio del potenciómetro hasta que el
líquido cubra tanto el bulbo como el orificio de unión líquida del electrodo.
6.4.5. Agitar por un momento; dejar reposar el líquido y medir el pH inicial de la solución.
6.4.6. Dejar caer un volumen de la solución de titulación y agitar suavemente (los
volúmenes a agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y
proceder a la lectura del pH.
6.4.7. Continuar agregando la solución de titulación según lo indicado en la tabla de
valores, agitando después de cada agregado y dejando de agitar, para luego
realizar la lectura de pH.
6.4.8. Proseguir la titulación hasta pH extremo (alrededor de pH 10-12) con NaOH.
NOTA: Al llegar al pH extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la
solución por más de 2 ó 3 minutos (especialmente en medio alcalino), dado que el
vidrio con el que está fabricado el electrodo es atacado y pierde sensibilidad.
Inmediatamente, sacar el electrodo y lavarlo con abundante agua bidestilada. Esta
precaución es esencial y se considerará falta grave no tratar el electrodo con estos
cuidados.
6.4.9. Al finalizar el trabajo práctico, lavar la bureta con agua destilada, para evitar de
esta forma que se pegue la llave y quede inutilizado.
Ingeniería en Biotecnología
7
Figura 3.- Esquema de montaje de los instrumentos para la titulación.
7. RESULTADOS (Indicaciones)
7.1. Presentar la siguiente tabla completada con los valores obtenidos en la práctica.
Para obtener el valor de pH experimental seguir los pasos explicados de la práctica
y reportar los resultados, para obtener el pH teórico se debe realizar el cálculo
correspondiente en cada punto (presentar estos cálculos en anexos).
NaOH 1M (volumen total) pH experimental pH teórico calculado
0
0.3
0.6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10.3
10.6
11
11.3
11.6
12
pinzas
Ingeniería en Biotecnología
8
13
14
15
16
17
18
19
20
7.2. Trazar una gráfica de la curva de titulación experimental con pH en las ordenadas y
miliequivalentes de reactivo agregado en las abscisas.
7.3. Inferir y/o calcular de acuerdo a lo obtenido experimentalmente los respectivos pK,
regiones con capacidad tamponante, punto isoeléctrico tanto experimentales como
teóricos y señalar cada uno de estos puntos en la gráfica anterior. Realizar una tabla
con cada uno de estos datos como se muestra a continuación.
Parámetro Tipo Valor Rango región tamponante
pK1 Experimental
Calculado
pK2 Experimental
Calculado
pKr Experimental
Calculado
pI Experimental
Calculado
8. DISCUSIÓN (Indicaciones)
Realizar la discusión con argumentación bibliográfica en base al contraste los valores
obtenidos experimentalmente versus los valores de pK y pI calculados, así como a otra
comparación los valores bibliográficos respectivamente.
9. BIBLIOGRAFÍA
1. Universidad Nacional de San Luis. (2011). Química orgánica II: Aminoácidos y proteínas. Argentina. Obtenido en línea en: www.bd.unsl.edu.ar/download.php?id=2176
2. Gonzales V. (2013). Curvas de titulación de aminoácidos. Universidad de
Salamanca. España. Obtenido en línea en: http://ocw.usal.es/ciencias-biosanitarias/bioquimica-ph-equilibrios-acido-2013-base/contenidos/4.%20Curvas%20de%20titulacion%20de%20aminoacidos.pdf
Ingeniería en Biotecnología
9
PRACTICA DE LABORATORIO # 2
1. TEMA: Herramientas bioinformáticas en el análisis estructural y de homología de proteínas
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Comprender el uso de las principales herramientas bioinformáticas para el análisis de
estructura y homología de proteínas.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Identificar la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de proteínas
mediante el uso de herramientas bioinformáticas como: bases de datos y modeladores.
Reconocer las diferentes funciones y aplicaciones de las herramientas bioinformáticas
empleadas.
Desarrollar análisis de homología de secuencias proteicas entre especies e interpreta
adecuadamente los resultados obtenidos.
Compilar la información arrojada por las herramientas bioinformáticas empleadas en el
análisis de proteínas.
4. MATERIALES Y EQUIPOS
Computadora con conexión a internet
Guía de laboratorio.
5. MÉTODOS
La práctica se desarrollará en tres etapas. En la primera etapa se emplearán bases de datos que
permitan la recopilación de la estructura primaria de proteínas (secuencia aminoacídica) así
como su análisis de homología, y en la segunda etapa se empleará un programa que permita
realizar el análisis estructural de proteínas (estructura secundaria, terciaria y cuaternaria) así
como la visualización de la molécula modelada en 3D. Finalmente, en la tercera etapa, el
alumno, como tarea deberá realizar nuevamente las etapas 1 y 2 para un proteína escogida por
el grupo de trabajo.
Asignatura: Bioquímica I Sigla: IBT411 Período: 2015-2
Paralelo: 1 Sesiones: 1 Profesora: Ing. Gabriela Granja MSc.
Ingeniería en Biotecnología
10
PRIMERA ETAPA
5.1. Herramientas bioinformáticas para el conocimiento de la estructura primaria
(NCBI y PDB) de una proteína.
5.1.1. Ingresar a la página del National Center for Biotechnology Information (NCBI)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
5.1.2. Buscar el polipéptido “INSULIN” (Insulina) en la barra buscadora, seleccionando en
la pestaña general “proteins”. Hacer la búsqueda de la secuencia para 4 especies
distintas y descargar la secuencia en formato FASTA. Las especies a ser
descargadas son:
a. Homo sapiens (Ser humano).
b. Mus musculus (Ratón).
c. Oryctolagus cuniculus (Conejo).
d. Saimiri Sciureus (Mono ardilla).
5.1.3. Entrar a la página web del Protein Data Bank (PDB)
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
5.1.4. Buscar nuevamente la proteína “INSULIN” en cada una de las especies
especificadas anteriormente, anotar el número de las mismas en formato PDB y
descargar desde esa fuente nuevamente en formato FASTA.
5.2. Herramienta bioinformática para el análisis de homología (NCBI)
5.2.1. Ingresar a la página del National Center for Biotechnology Information (NCBI)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
5.2.2. Acceder a la herramienta “BLAST” (Basic Local Aligment Search Tool).
5.2.3. Hacer clic sobre el link “BLASTp” para hacer análisis de homología de proteínas.
5.2.4. Ingresar la secuencia de la proteína a ser estudiada (Insulina de conejo) en
formato FASTA, o con el número de acceso o código gi en el espacio designado
como “Enter query sequence”.
5.2.5. Establecer la base de datos deseada para el análisis (se escogerá nr para esta
práctica) y realizar el análisis.
5.2.6. Analizar los resultados obtenidos y comprender el significado de los valores que
arroja el programa mediante la interpretación lógica de los resultados obtenidos.
5.2.7. Repetir los pasos 4 y 5 pero esta vez realizar el análisis escogiendo las otras 3
especies de organismos contra los cuales se realizará el análisis de homología.
5.2.8. Analizar los resultados y reportar el significado de los mismos.
Ingeniería en Biotecnología
11
SEGUNDA ETAPA
5.3. Herramienta bioinformática para el conocimiento de la estructura secundaria,
terciaria y cuaternaria de una proteína (PDB).
5.3.1. Ingresar a la página web del Protein Data Bank (PDB)
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
5.3.2. Buscar el polipéptido de la Insulina humana y explorar todas las pestañas que
posee la herramienta en las cuales se podrá tener acceso a toda la estructura,
bibliografía, autores, etc. y definir la estructura primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria.
TERCERA ETAPA
5.4. Aplicación de los conocimientos adquiridos
5.4.1. Escoger una proteína a su gusto (diferente a la insulina) y realizar mediante el uso
de esta herramienta el análisis estructural (estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria) de la misma. Además realizar el análisis de homología
comparando su proteína con tres especies distintas.
5.4.2. Reportar los resultados de cada nivel de organización y de homología.
5.4.3. Realizar el informe de laboratorio en base exclusivamente a esta proteína.
Ingeniería en Biotecnología
12
PRACTICA DE LABORATORIO # 3
1. TEMA: Extracción de proteínas a partir de muestras de origen animal.
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Aplicar los conocimientos adquiridos en clase acerca de los procesos generales de
extracción y fraccionamiento de proteínas.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Obtener un extracto crudo de proteínas a partir de distintos órganos de gallina
(Gallus gallus).
Realizar un fraccionamiento de proteínas a partir de la precipitación con soluciones
de sulfato de amonio a partir del extracto crudo.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los protocolos y métodos de extracción de proteínas son muy variados y dependen
básicamente de la aplicación que se vaya a dar y de las consideraciones que la investigación
que llevamos a cabo requiera.
De manera general, un proceso de extracción y purificación de proteínas siempre contará
con tres pasos 1) lisis celular, en donde ocurrirá la liberación de los componentes celulares
del citosol incluyendo a las proteínas en el denominado extracto crudo, 2) fraccionamiento,
en donde se podrá mediante propiedades químicas y físicas de las proteínas estudiadas
separar aquellas de nuestro interés y 3) purificación, en donde, mediante una gran cantidad
de opciones de métodos y en dependencia de las características físico-químicas de las
moléculas se obtendrá la proteína de interés en estado puro lista para su aplicación.
Adicionalmente a estos pasos, el investigador podrá caracterizar las proteínas obtenidas en
cualquier momento del proceso de extracción-purificación mediante análisis de electroforesis
Asignatura: Bioquímica I Sigla: IBT411 Período: 2016-1
Paralelos: 1 y 2 Sesiones: 1 Profesora: Ing. Gabriela Granja MSc.
Ingeniería en Biotecnología
13
en una o dos dimensiones, así como mediante la obtención de la secuencia aminoacídica de
la misma gracias a las técnicas automatizadas disponibles (1-6).
En esta práctica, realizaremos una extracción de proteínas a partir de órganos de origen
animal, usando un protocolo general y sencillo, así como la cuantificación de los extractos
obtenidos con el fin de aplicar los conocimientos adquiridos en clase respecto a este tema.
En cuanto a la técnica de lisis celular a emplearse, se realizará una homogenización
mecánica con mortero y pistilo en el tampón PBS, esta técnica es ampliamente empleada
para muestras de origen animal ya que permite la disgregación adecuada de los tejidos y la
eliminación del tejido conectivo que los recubre, tras lo cual se recuperará el extracto crudo
de proteínas y se procederá a fraccionar la misma. Durante el fraccionamiento será
empleada la técnica de precipitación con sulfato de amonio, la cual permitirá el aumento de
la fuerza iónica en la solución de tal forma que ocurra una disminución de las interacciones
proteína - agua aumentando a su vez las interacciones proteína-proteína lo cual facilitará la
precipitación. Para este paso se procederá a evaluar diferentes concentraciones de solución
de sulfato de amonio lo cual nos arrojará distintas fracciones las mismas que será evaluadas
en cuanto a su concentración proteica total.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1. MATERIALES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Vísceras de pollo (1 funda por curso)
Cajas isotérmicas con hielo (6)
Morteros con pistilo (6)
Bisturíes de disección con cuchillas (6)
Micropipetas 1mL (6)
Micropipetas 200 µL (6)
Micropipetas 0.5-10 µL (6)
Cajas de puntas de micropipetas 1mL (6 cajas de 96)
Cajas de puntas de micropipetas 200 µL (6 cajas de 96)
Cajas de puntas de micropipetas 0.5-10 µL (6 cajas de 96)
Microtubos de 2mL (150)
Gradillas para microtubos (6)
Canoas de pesaje (1)
Cucharillas de metal (1)
Agitador magnético (1)
Vaso de precipitación de 250 mL (1)
5.2. REACTIVOS Y/O SOLUCIONES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Ingeniería en Biotecnología
14
25 mL de solución de PBS 1X
Sulfato de amonio (NH4)2 SO4 (67,5 g)
Agua destilada 200mL
5.3. EQUIPOS (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Microcentrífuga para tubos de 2mL (Velocidad de hasta 14000 rpm, de ser posible
refrigerada) (1).
Vórtex (1)
Balanza analítica (1)
Agitador magnético (1)
6. MÉTODOS
6.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES (profesora, no incluir en el informe)
Las soluciones se prepararan por la profesora con anticipación con el fin de optimizar el
tiempo de prácticas disponible.
6.1.1. SO4 (NH4)2 saturado (8):
6.1.1.1. Diluir 67,5 gr de sulfato de amonio en 72 mL de agua destilada.
6.1.1.2. Homogenizar la solución con un agitador magnético hasta que la sal se
disuelva completamente.
6.2. LISIS CELULAR Y OBTENCIÓN DE EXTRACTO CRUDO
6.2.1. Preparar una caja isotérmica con hielo en la cual se realizarán todos los procesos
con el fin de evitar la degradación de proteínas.
6.2.2. Colocar un mortero sobre el hielo y añadir un trozo del tejido seleccionado cortado
con el escalpelo en trozos más pequeños.
6.2.3. Agregar 4000 µL de la solución PBS y homogenizar el tejido.
6.2.4. Recuperar el homogenato celular y transferirlo a los 2 microtubos de 2mL
dispuestos también en hielo.
6.2.5. Centrifugar a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC.
6.2.6. Recuperar el sobrenadante (extracto crudo) trasvasando el volumen a un nuevo
microtubo en frío teniendo cuidado de no alterar el pellet.
6.3. FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS Y PRECIPITACIÓN
6.3.1. Preparar las diluciones a partir de la solución de SO4 (NH4)2 saturada de acuerdo
a los volúmenes indicados a continuación.
Ingeniería en Biotecnología
15
REACTIVO
Saturación de SO4 (NH4)2
0% 12,5% 25% 50% 75% 100%
Agua (µL) 500 437.5 375 250 125 -
SO4 (NH4)2 al 100% (µL) - 62.5 125 250 375 500
6.3.2. Colocar de 200 a 400 µL de extracto crudo en 6 microtubos y añadir a cada uno
de 200 a 400 µL de cada dilución de sulfato de amonio preparada (partes iguales
dependiendo de lo que se obtuvo de extracto crudo).
6.3.3. Agitar por vórtex unos segundos e incubar a 4º C durante 1 hora.
6.3.4. Centrifugar 10 minutos a 14000 rpm y 4º C.
6.3.5. Descartar el pellet, recuperar los sobrenadantes y trasvasarlos a un nuevo
microtubo limpio.
6.3.6. Rotular cada tubo obtenido como: extracto 1, extracto 2, extracto 3, extracto 4,
extracto 5 y extracto 6 dependiendo de si fueron precipitados con 0, 12.5, 25, 50,
75 y 100% de sulfato de amonio.
6.3.7. Conservar los extractos a -20ºC hasta su cuantificación en la siguiente práctica de
laboratorio.
7. BIBLIOGRAFÍA
(1). Farina H., Ripoll G. & Gasparri J. (2008). TP2: Extracción y cuantificación de proteínas.
Universidad Nacional de Quilmes. Obtenido en línea en:
http://ibcmunq.wordpress.com/2012/03/19/guias-de-trabajos-practicos/
(2). Huerta S. (2010). Rompimiento celular. Universidad Autónoma de México (UAM). Obtenido
en línea en: http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Ruptura_celular.pdf
(3). Nelson D., Cox M. (2006). Lehninger Principles of biochemistry. 4th Edition.Freeman W & H
Company Publishers.
(4) Stryer L., Berg J., Tymoczko J. (2003). Bioquímica. España: Editorial Reverté.
(5) Bretón A., Hernández R. (2004). Secuenciación de proteínas por espectrometría de masas.
Instituto de Biotecnología- Universidad Autónoma de México (UNAM). Obtenido en línea en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_proteinas.pdf
(6) Ugalde R. (2009). Generalidades sobre la purificación de proteínas. Universidad Nacional de
San Martín (UNSAM). Obtenido en línea en:
http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2009/BioProt/PurifProts.pdf
(7) Laboratorio de genómica viral y humana. (2008). Preparación de Phosphate Buffered Saline
(PBS). UASLP. Obtenido en línea en:
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Cell_Buffer_PBS.pdf
Ingeniería en Biotecnología
16
(8) Angola M. (2010). Fraccionamiento de inmunoglobulinas mediante precipitación en sal.
Universidad de los Andes (ULA). Obtenido en línea en:
http://www.ciencias.ula.ve/biologia/if_practica_4_fraccionamiento_inmunoglobulinas_b2010.pdf
Ingeniería en Biotecnología
17
PRACTICA DE LABORATORIO # 4
1. TEMA: Cuantificación de proteínas a partir de extractos proteicos de origen animal.
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Aplicar los conocimientos adquiridos en clase acerca del proceso general de
cuantificación de proteínas.
3.2. OBJETIVO ESPECÍFICO:
Cuantificar las proteínas resultantes de cada fracción obtenidas en la práctica 3
mediante el empleo de espectrofotometría.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Las técnicas de cuantificación de proteínas empleadas en laboratorio se basan en la
capacidad que poseen estas moléculas de formar complejos colorimétricos cuya formación,
proporcional a la cantidad de proteínas presentes en la solución, puede ser medida gracias
al empleo del espectrofotómetro a una longitud de onda específica. Tal es el caso del
método de Biuret en el cual la reacción entre el cobre (presente en el sulfato cúprico) con los
enlaces peptídicos de las proteínas genera el complejo que posee una coloración violeta-
púrpura que presenta un máximo de absorción a 545nm. Las principales características de
esta reacción son que el rango de determinación de esta reacción es de hasta 6mg/mL y que
no depende de la composición de aminoácidos como la cuantificación basada en
espectrofotometría a 280nm, la cual solamente detecta la presencia de los aminoácidos
tirosina y triptófano en las muestras sin reacción colorimétrica siendo por tanto algo
inespecífica. (1-3).
En esta práctica, realizaremos la cuantificación del extracto proteico total de cada fracción
obtenida mediante la reacción de Biuret leyendo la absorbancia obtenida en cada caso a
545nm.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
Asignatura: Bioquímica I Sigla: IBT411 Período: 2016-1
Paralelos: 1 y 2 Sesiones: 1 Profesora: Ing. Gabriela Granja MSc.
Ingeniería en Biotecnología
18
5.1. MATERIALES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Cajas isotérmicas con hielo
Micropipetas 1mL (6)
Micropipetas 200 µL (6)
Micropipetas 0.5-10 µL (6)
Cajas de puntas de micropipetas 1mL (6)
Cajas de puntas de micropipetas 200 µL (6)
Cajas de puntas de micropipetas 0.5-10 µL (6)
Microtubos de 2mL (80)
Cubetas de espectrofotometría (80)
Gradillas para microtubos (6).
5.2. REACTIVOS Y/O SOLUCIONES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
10 mL de solución de PBS 1X
100 mL de Reactivo de Biuret
2 mL de solución de BSA (Albúmina de Suero Bovino) 10 mg/mL
Muestras de extractos proteicos crudos precipitados.
5.3. EQUIPOS (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Vórtex (1)
Espectrofotómetro (1)
6. MÉTODOS
6.1. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA REACCIÓN COLORIMÉTRICA DE
BIURET.
6.1.1. Añadir los volúmenes de estándar de albúmina de suero bovino (BSA),
muestras, Buffer de extracción (PBS 1X) y reactivo de Biuret para construir las
distintas concentraciones de la recta patrón y analizar las muestras de acuerdo a
lo descrito en las siguientes tablas.
TUBO NOMBRE BSA Buffer PBS Reactivo Concentración
Ingeniería en Biotecnología
19
(µL) 1X (µL) de Biuret
(µL)
1 Blanco 0 100 900 0 mg/mL
(BLANCO)
2 Estándar 1 3,125 96,875 900 0.3125 mg/mL
3 Estándar 2 6,25 93,75 900 0.625 mg/mL
4 Estándar 3 12,5 87,5 900 1.25 mg/mL
5 Estándar 4 25 75 900 2.5 mg/mL
6 Estándar 5 50 50 900 5 mg/mL
7 Estándar 6 100 0 900 10 mg/mL
TUBO NOMBRE Muestra
(µL)
Buffer PBS 1X
(µL)
Reactivo de
Biuret (µL)
8 Muestra 1 100 0 900
9 Muestra 2 100 0 900
10 Muestra 3 100 0 900
11 Muestra 4 100 0 900
12 Muestra 5 100 0 900
13 Muestra 6 100 0 900
6.1.2. Colocar de 1mL de volumen de cada tubo preparado en la cubeta del
espectrofotómetro empezando por el blanco y continuando con los demás tal
como se explica en la siguiente tabla. Leer a 545 nm. en el espectrofotómetro.
6.1.3. Reportar los valores de absorbancia arrojados por el equipo para cada muestra.
6.1.4. Realizar la recta patrón con los valores obtenidos y calcular la concentración de
los 6 extractos proteicos precipitados a partir de la ecuación obtenida a partir de
la recta patrón.
7. RESULTADOS INFORME 3 Y 4
7.1. Reportar la curva estándar en una tabla en donde se evidencien los valores de
concentración y absorbancia.
7.2. Realizar la curva estándar y reportar la ecuación de la recta y el R2.
Ingeniería en Biotecnología
20
7.3. Realizar una tabla en donde se reporten los resultados de concentración de los 6
extractos en base a la ecuación obtenida.
7.4. Realizar la curva de salting “in” y salting “out” de las muestras obtenidas.
8. BIBLIOGRAFÍA
(1). Farina H., Ripoll G. & Gasparri J. (2008). TP2: Extracción y cuantificación de proteínas.
Universidad Nacional de Quilmes. Obtenido en línea en:
http://ibcmunq.wordpress.com/2012/03/19/guias-de-trabajos-practicos/.
(2) García H., Vásquez R. (1998). Cuantificación de proteínas: una revisión. BioTecnología. (3):
77-88.
(3) Gonzales L & Sánchez S. (2009). Métodos espectroscópicos y curva patrón. Obtenido línea
en: http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/metodos-espectroscopicos-y-curva-
patron.pdf
PRACTICA DE LABORATORIO # 5
Ingeniería en Biotecnología
21
1. TEMA: Detección de carbohidratos por el método de Molisch y determinación de azúcares
reductores por el método de Benedict.
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Conocer y aplicar el método general de Molisch para la detección de carbohidratos, así
como el método de Benedict para la identificación de azúcares reductores.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
La detección de la presencia de carbohidratos se fundamenta en que estas biomoléculas al
ser derivados aldehídicos o cetónicos, poseen la misma capacidad de reaccionar con
moléculas específicas. Es por esto que en el laboratorio de bioquímica, empleamos algunas
de estas reacciones como estrategias cualitativas en la determinación de la presencia de
este tipo de biomoléculas en muestras (Barboza, Ortiz & Salcedo, 2013).
Una de las pruebas a emplearse en la presente práctica es la de Molisch, la misma que
permite identificar de manera general cualquier tipo de azúcar. Se fundamenta en la
deshidratación que sufre el azúcar en medio ácido tras lo cual ocurrirá una reacción
colorimétrica que permitirá su detección. Las pentosas o hexosas en presencia de ácido
clorhídrico se deshidratan, formando en los monosacáridos resultantes furfurales e
hidroximetil furfurales, respectivamente (Véase Figura 1). Estos furfurales a su vez
reaccionarán con el α-naftol condensándose, dando un producto de color violeta-rojizo
(Ashok, 2014; Barboza, Ortiz & Salcedo, 2013).
Adicionalmente, en base a que algunos azúcares tienen la capacidad de oxidarse en
presencia de agentes oxidantes como el ión Fe3+ o el Cu2+ gracias a que poseen un grupo
carbonilo libre el cual es oxidado a carboxilo, se puede determinar mediante ensayos de
laboratorio si una muestra de azúcares tiene o no poder reductor. Los azúcares reductores
por tanto, se definen como aquellos que poseen un grupo carbonilo libre, mientras que los
azúcares no reductores no lo poseen, ya que este se encuentra participando de algún enlace
glucosídico (Ashok, 2014; Cano, Méndez & Cruz, 2013; Geneseo, 2013).
Asignatura: Bioquímica I Sigla: IBT411 Período: 2016-1
Paralelos: 1 y 2 Sesiones: 1 Profesora: Ing. Gabriela Granja MSc.
Ingeniería en Biotecnología
22
En este contexto, la prueba de Benedict para la detección de azúcares reductores se
fundamenta en la reacción del azúcar o no con el ion Cu2+ (Véase Figura 2). Este reactivo,
posee soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre y citrato de sodio (Ashok, 2014;
Cano, Méndez & Cruz, 2013; Geneseo, 2013).
“El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la reacción pueda
llevarse a cabo. "El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solución ya tiene la
propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales
pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una
solución de azúcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en
solución alcalina a elevadas temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol,
rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus
electrones expuestos, reaccionarán con el Cu2+. Se obtiene entonces un azúcar oxidado
y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH-
presentes en la solución para formar el hidróxido de cobre. La aparición de un
precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azúcar
reductor.” (Cano, Méndez & Cruz, 2013).
Figura 1.- Reacción de Molisch a partir de hexosas y pentosas (Ashok, 2014).
Ingeniería en Biotecnología
23
Figura 2.- Reacción de Benedict (Cano, Méndez & Cruz, 2013).
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1. MATERIALES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Gradillas de tubos de ensayo (6)
Tubos de ensayo (120).
Pipetas pasteur de plástico (120).
Vaso de precipitación 1 L (4).
Vasos de precipitación 500 mL (3).
Vasos de precipitación 250 mL (10).
Probetas de 100 mL (8).
Frasco para almacenamiento de soluciones 500 mL (1)
Frasco para almacenamiento de soluciones 100 mL (1)
Vasos de precipitación 100 mL (3).
Pipetas de vidrio 5 mL (20).
Peras o pipeteadores (6).
Canoas de pesaje (7).
Espátulas de pesaje (7).
Agitadores magnéticos (7).
5.2. REACTIVOS Y/O SOLUCIONES (para 6 grupos de 4 personas c/u)
10 mL de reactivo de Molisch o sus componentes:
10 g de naftol.
100 ml de etanol al 95%.
100 mL de ácido sulfúrico concentrado
130 mL de reactivo de Benedict.
Solución de glucosa al 5% (25 mL).
Solución de almidón de papa al 5% (25 mL).
Solución de fructosa al 5% (25 mL).
Solución de sacarosa al 5% (25 mL).
Solución de lactosa al 5% (25 mL).
Solución de stevia al 5% (25 mL)
Solución de edulcorante comercial al 5% (25 mL)
Agua destilada.
5.3. EQUIPOS (para 6 grupos de 4 personas c/u)
Plancha de calentamiento (3).
Ingeniería en Biotecnología
24
6. MÉTODOS
Antes de empezar elabore una tabla para cada prueba en donde registrará en la primera
columna el número de la solución de carbohidratos evaluada, en la segunda y tercera
columna colocará el nombre de la prueba ejecutada y en cada caso anotará el resultado.
6.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
6.1.1. REACTIVO DE MOLISCH (Barboza, Ortiz & Salcedo, 2013)
6.1.1.1. Disolver 10 g de naftol en 100 ml de etanol al 95% y homogenizar.
6.1.2. SOLUCIONES DE CARBOHIDRATOS AL 5%.
6.1.2.1. Preparar 25 mL de cada una de las soluciones de carbohidratos, para lo
cual se deberán pesar 1,25 gr de cada una y aforar con la cantidad de agua
necesaria. NOTA: La solución de almidón se disolverá en agua caliente.
6.2. PRUEBA DE MOLISCH (Modificado de Barboza, Ortiz & Salcedo, 2013)
6.2.1. Preparar 8 tubos de ensayo en una gradilla, rotularlos y a cada uno añadir 2 mL de
las soluciones de carbohidratos a prueba y agua destilada como control negativo.
6.2.2. Añadir a cada tubo 5 gotas del reactivo de Molisch y agitar.
6.2.3. Inclinar cada tubo y depositar cuidadosamente por las paredes del tubo 2 mL de
ácido sulfúrico concentrado.
6.2.4. Registrar los resultados en su tabla. Recuerde que la presencia de un anillo
violeta- rojizo será un resultado positivo para esta prueba, indicando la presencia
de carbohidratos en la solución.
6.3. DETECCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DE BENEDCIT
(Modificado de Cano, Méndez & Cruz, 2013).
6.3.1. Preparar 8 tubos de ensayo en una gradilla, rotularlos y a cada uno añadir 2,5 mL
de reactivo de Benedict.
6.3.2. Añadir a cada tubo 6 gotas de las soluciones de carbohidratos y agua destilada
como control negativo.
6.3.3. Colocar los tubos en baño maría hirviendo por 5 minutos.
6.3.4. Observar los cambios de color y colocar los tubos en una gradilla. Después de un
momento observar si se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo,
anaranjado o verdoso. Registrar los resultados en su tabla.
Ingeniería en Biotecnología
25
7. BIBLIOGRAFÍA
(1) Barboza E., Ortiz G. & Salcedo R. (2009). Manual de prácticas de bioquímica. Universidad de
Guanajuato. México. Obtenido en línea en:
http://www.diciva.ugto.mx/directorio/josebar/documentos/Practicas%20de%20Bioqu%C3%ADmic
a%202009.pdf
(2) Cano H., Méndez S. & Cruz J. (2013). Manual de práctica de Laboratorio de Bioquímica:
Carbohidratos. Obtenido en línea en:
http://tux.uis.edu.co/quimica/sites/default/files/paginas/archivos/V00Man10Bioqca_MFOQ-
BQ.01_08072013.pdf
(3) Ashok R. (2014). Coloured reaction of carbohydrates. Obtenido en línea en:
http://www.authorstream.com/Presentation/raniashok-1429879-coloured-reactions-of-
carbohydrates/
(4) Geneseo, S. (2013). Lab review 1. Obtenido en línea en:
https://biochemistryisagoodthing.wordpress.com/2013/02/17/lab-review-1/
Ingeniería en Biotecnología
26