Post on 30-Aug-2014
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INSTRUMENTACIÓN - II
ColorimetríaEspectrofotómetro
OBJETIVOS
•Conocer los fundamentos e importancia de la instrumentación (equipos ) en Bioquímica
•Conocer el funcionamiento y uso de la Centrífuga y el espectrofotómetro como equipos útiles en Bioquímica.
•Elaborar curvas o gráficos de calibración
Espectrofotometría
• Se basa en la medida de la luz absorbida por una solución mediante un espectrofotómetro.
• La luz utilizada es monocromática, seleccionada de acuerdo al soluto en estudio
• Reporta resultados como A o T Io = luz incidente c = concentración
I1 = luz transmitida l = distancia
A= Absorbancia (D.O.) =coeficiente de extinción C= concentración molar l= longitud de celda (cm)
En función de la naturaleza y de la concentración de la muestra
A= clLey de Lambert- Beer
Log Io/It = e.l.c log Io/It = A A = 2 – log%T
Principal limitación de ley: Concentración de soluto mayor de 0.01M
Absorbancia
• T se expresa en valores de 0 a 100%.• A o Densidad Optica se expresa en valores
semilogarítmicos de 0 a 2.• Aplicando la ley de Lambert – Beer, considerando que A y C
tienen relación lineal:
Fc = factor de calibraciónC = concentración solución conocida (patrón)A = Absorbancia de la solución conocida (pat.)
Fc = C/A
La absorbancia es reciproca de la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)
Concentración
Absorbancia
Concentración
% Transmitancia
Curva de calibración
Absorbancia
Concentración
A
Azul de metileno
Absorbancia
Longitud de onda (nm)
A
Max
660 nm
¿ABSORBANCIA?Muestra Problema
Conc. Prob = (A Prob)(Conc. Patrón)/A Patrón
Problema Patrón
A Problema = 0.458 A Patrón = 0.765 Conc. Patrón= 145mg% Conc. Problema= ?
Conc. Problema = (0.458)(145mg%) /0.765
Conc. Problema= 86.8 mg%
Ejemplo :
Conc. Prob = (A Prob)Fc
CURVA PATRÓN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
AB
S
0
R
B
A
N
C
I
A
Interpolación
Absorbancia del problema
PARTE EXPERIMENTAL
Contenido Tubo Nº1 2 3 4 5
ml Azul metileno al (5 mg/ml) 2 4 6 8 10ml Agua destilada 8 6 4 2 0
Llevar a lectura en el espectrofotómetroLa longitud de onda de lectura será 540 nm
Preparar la siguiente batería de tubos
Concentración (mg/mL)
% T= Antilog(2-A) A FC= C/A
Factor calibración promedio
RESULTADOS
Estimar el factor de calibración promedio
Construir las graficas Concentración Vs Absorbancia y Concentración Vs transmitancia
Entregar el valor de las concentraciones desconocidas determinadas usando el factor de calibración y el método grafico
Conc. Con Fc Conc. De graficaDesconocido 1Desconocido 2
CUESTIONARIO
1. ¿Cual es la importancia de los instrumentos de laboratorio en análisis clínico?
2. ¿Para que es útil el factor de calibración y las curvas de calibración?3. ¿De que características de las soluciones hace uso el espectrofotómetro para
ayudar en la cuantificación de concentraciones de muestras desconocidas?