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Elena López AcedoCáceres 7 de Septiembre 2012
Uso de Bacteriófagos como Antimicrobianos en la Producción Quesera
AISLADAS DE PRODUCTOS LÁCTEOS:
•>40 estirpes (serie RT) INTAEX
BACTERIAS: E. coli FAGOS:
LABORATORIO:
•K12•B•W•C•B/r
COLECCIÓN ESPAÑOLA DE CULTIVOS TIPO
Nuestra propia colección. UEX. GENÉTICA
LABORATORIO:
•8 estirpes. NATIONAL BIORESOURCE PROJET: E. coli, JAPAN
•6 estirpes. Laboratorio de MIGUEL VICENTE
•Nuestra propia colección. UEX. GENÉTICA
AISLADAS DE PRODUCTOS LÁCTEOS:
•>40 estirpes obtenidas en nuestro laboratorio.
Mutantes claros y virulentos de fagos atemperados.
λ+ λvir λcI857 λc60 λi434cIh P1 T4D T6 Phi80 Phi80cI Phi80cIΔ4
MG1655 + + + + + + + + + + +K12 (W3110) + + + + + - - - + - -B - - + - - + + + - + +B/r - - + - - + + - - + +Bi - - - - - - - - - - -C + + + + + + - + + + +W - - - - - - - - - - -WP2 - - + - - + + + - + +Serie RT - - - - - - - - - - -
ADSORCIÓN
INYECCIÓN DEL DNA
+ simboliza la existencia de lisis
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
EMB-mal: Eosin Methylene Blue + maltosa (como fuente de C).
CONTROLES: MG1655 – ROJA (control +) mal+BW6164 – BLANCA (control -) mal-
mal+
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)
T0 T5 T10 T15 T20 T30
Time (min)
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)
MG1655
Sobrenadante RT
no diluido
Cepa E. coli muestra
láctea (RT)
Sobrenadante RT
ND
50%
10%
1%
Mg++
Ca++
Mg++
Ca++
Mg++
Ca++
Mg++
Ca++
Mg++
Ca++
-5
-6
-5
-5
-5
-6
-6
-6
-6
-5
-6
-5
-5
-5
-6
-6
-6
-5
-6
FAGO
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
ND 50% 10% 1% TAMPÓN
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
*
* = 3H-TdR
**
*
*
*
*
*
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
*
Fagos(sobrenadante)
Bacterias(pellet)
T4/λ
ADSORCIÓN:∗Fermentación de azúcares∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002)∗Efecto dilución (sustancia difusible)∗Correlación con factores del ciclo
DESTINO DEL DNA-fágico:∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952)∗Fagos con DNA modificado
Bacteria m+/r+
Bacteria m+/r-
metiltransferasas
restrictasas
Bacteriofago Fagos con DNA modificado
OBTENCIÓN DE FAGOS CAPACES DE LISAR A LAS E.COLI AISLADAS DE QUESERIAS:•Co-evolución•Obtención de derivados virulentos de los fagos aislados de E.coli de queserias.
CONTINUAR EL TRABAJO CON FAGOS CUYA DIANA SEAN OTRAS BACTERIAS ALTERANTES DEL QUESO
Técnicas previstas para la identificación, cuantificación y caracterización de bacterias y bacteriofagos presentes en muestras de
leche y queso:
•PCR-múltiple , q-PCR y Rep-PCR•PFGE
•Microscopía Óptica•TEM•RFLP
•Medida de la cantidad de DNA sintetizado• Medida de cfu relacionada con la D.O
• Clonación y Secuenciación de fragmentos de DNA fágico
M 1 2 3 4 M
Corte con EcoRI: 1: P1 (1ul), 2: aRT1 (10ul);3: 6RT144 (1ul); 4: 6RT144 (10ul)
Líneas 2-4: RT-colis (3, 12, 59); 5: Klebsiella oxytoca (30); 6: Enterobacter intermedious (38);7: Hafnia alvey (7)
M 1 2 3 4 5 6 7