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LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Dra Susana Elgueta Miranda
RESPUESTA INMUNE El sistema inmunológico está
programado para: Diferenciar entre lo propio y lo extraño Defensa contra agentes externos
Las Moléculas responsables de estos eventos, pertenecen al MHC
LEUCOCITOS PASAJEROS
ALORECONOCIMIENTO RESPUESTA MUY VIGOROSA. 1-10%
DE LT RESPONDEN A ALOANTIGENO CLONES RESTRINGIDOS POR MHC
PRESENTAN ALOREACTIVIDAD PORCION TCR INVOLUCRADO EN
RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC RECONOCE ALOANTIGENO
RESPUESTA A ALOANTIGENOS
GRAN EXPRESION MOLECULAS CMH, RECONOCIMIENTO DIRECTO POR REACCION CRUZADA, ESTIMULA CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD
RESPUESTA POLICLONAL Y POLIESPECIFICA
FUNCIONES LABORATORIO ISP
Laboratorio Nacional y de Referencia: *Estudio de histocompatibilidad a
Receptores (potenciales) y Donantes *Asignación de riñón de donante cadáver
*Tipificación HLA en enfermedades: B27, DR
Lleva la Lista Nacional de Receptores de Organos (en espera y trasplantados)
Otros: PEEC B27, Capacitación etc
BARRERAS ANTIGENICAS EN TRASPLANTE DE ORGANOS
Grupo sanguíneo ABO
Antígenos del CMH (HLA)
Antígenos de Complejos Menores de Histocompatibilidad
Requerimientos variables según órgano o tejido
OTROS ALOANTIGENOS
LEWIS
ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR
MICA / MICB (MICC, MICD, MICE son pseudogenes
)
VIMENTINA
REQUERIMIENTOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
HIGADO
CORAZON
RIÑON
MEDULA OSEA
ANTIGENOS
ANTICUERPOS
LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Estudios
RECEPTOR Tipificación HLA Existencia de anticuerpos anti-HLA (panel de
anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante Detección de la aparición de anticuerpos
anti-HLA post-transplante DONANTE
Tipificación de HLA RECEPTOR/DONANTE
Prueba cruzada (crossmatch XM)
EFECTO HLA EN TRASPLANTE RENAL
SOBREVIDA INJERTO FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS GRADO INMUNOSUPRESION DISMINUYE RIESGO DE
SENSIBILIZACION (IMPACTO ECONOMICO)
Donante vivo/ donante cadavérico
HERENCIA CMH
a b c d
ac, ad , bc, bd
A1B5DR8
A2B8DR3
A9B12DR2
A3B16DR4
HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2 A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4 A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2 A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4
25% idénticos25% 0 match50% semiidenticos
Tipificación de HLA
Métodos serológicos: CDC: citotoxicidad dependiente de
complemento
Métodos moleculares: PCR-SSP (iniciadores secuencia-
específicos) PCR-SSO (sondas secuencia-
específicas)
• Identificacion AntigenosPlacas con antisueros especificos(a-HLA A2, A3, B5, B7 etc)Celulas con antigenos a identificar
• Pesquisa de AnticuerposSuero para determinar existencia
anticuerposCélulas con Antigenos conocidos
Métodos serológicos
2 x 106/ml lymphocytes
Dispense 1 l of T or B lymphocytes
Dispense 10 l of Stain-Fix™
or5 l of Fluoroquench™
Evaluation and
Reporting
1 hour incubation
30 minutesincubation
Dispense 5 l of Class I or II rabbit complement
RabbitComplement
Tipificación:Métodos serológicos
“1” Reaction“1” Reaction
0–10% Dead Cells0–10% Dead Cells
“2” Reaction“2” Reaction
11–20% Dead Cells11–20% Dead Cells
“4” Reaction“4” Reaction
21–50% Dead Cells21–50% Dead Cells
“6” Reaction“6” Reaction
51–80% Dead Cells51–80% Dead Cells
“8” Reaction“8” Reaction
81–100% Dead Cells81–100% Dead Cells
Tipificación:Métodos serológicos
TECNICAS MOLECULARES
BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA SEROLOGIA
kits CTS Biotest One Lambda
RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR GRUPOS DE ALELOS
ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS Y SUS VARIANTES
Micro SSPTM ProcedimientoMicro SSPTM Procedimiento 2. Agregar 10 ul de la
solucion que contiene el DNA/mezcla-D a cada uno de los pozos de la micro-placa del SSP, con excepción del pocillos que es el control negativo.
1. Agregar Amplitaq de Perkin-Elmer y la muestra de DNA en el tubo de D-Mix
3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)
4. Transferir el producto de la reacción de PCR en un gel.
Micro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento ProcedimientoMicro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento Procedimiento
6. Analizar los patrones de bandeo y asignar los alelos correspondientes.
5. Correr la electroforesis.
11223344
55667788
99101011111212
7. Interpretación
TIPIFICACION HLA-A,B,DR
Tipificación SerológícaAntígeno A28 B40 DR5Subtipos A68 B61 DR11
Tipificación MolecularBaja resolución A*68 B*40 DRB1*11
Intermedia A*6801/6804 B*4001/4006 DRB1*1101/1104/1106
Alta resolución A*6801 B*4006 DRB1*1104
MATCH O COMPATIBILIDADANTIGENOS PRESENTES EN EL RECEPTOR Y EN EL DONANTE
MISMATCH O INCOMPATIBILIDAD
ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE Y AUSENTES EN EL RECEPTOR
EJEMPLO HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADRE
HLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5 HERMANO
EJEMPLO R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6
MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5 HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8 HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8 HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6
COMPATIBILIDAD (MATCH) E INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH)
RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ;
DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3DONANTE 1 MATCH : 1A 1B 2DR MM : 1A 0B 0DRDONANTE 2 MATCH : 1A 1B 1DR MM : 1A 0B 0DR
UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (1)
CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 04, -HERM. A 23, 24 49, 62 04, -HERM. B 23, 24 49, 62 04, -MADRE 23, 32 49, 60 04, -PADRE 24, - 62,- 04, -
UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (2)
CLASE II POR SSP ALTA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 0405, 0407HERM. A 23, 24 49, 62 0404, 0407HERM. B 23, 24 49, 62 0405, 0407MADRE 23, 32 49, 60 0404, 0405PADRE 24, - 62,- 0404, 0407
Antigenos y alelos
Antigenos y alelos
HLA-DR HLA-DR
COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR
MEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA
EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL MATCH HLA ES BENEFICIOSO
INMUNOGENICIDAD HLA MM PERMITIDOS MM PROHIBIDOS B7 en RECEPTOR A1 FENOTIPO RECEPTOR DR6: a-A10, A11, A19, B35 OTROS : Cw, DQ, DP
SENSIBILIZACION
PRESENCIA DE
ANTICUERPOS ALOREACTIVOS
CONSECUENCIAS DE LA SENSIBILIZACION
Menor posibilidad de trasplante (XM positivo)
Mayor tiempo en lista de espera
Sobrevida menor del injerto renal
HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)
ANTICUERPOS ANTI-HLA
RECHAZO HIPERAGUDO DEL INJERTO
RECHAZO AGUDO HUMORAL
DAÑO CRONICO DEL INJERTO
CADA MOLECULA HLA PUEDE TENER MUCHOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DIFERENTES
ANTICUERPOS ANTI-HLA ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS T DEPENDIENTES RESPUESTA PRIMARIA IgM RESPUESTA SECUNDARIA IgG PRODUCCION DE CELULAS DE
MEMORIA
VIAS DE SENSIBILIZACION
EMBARAZOS
TRANSFUSIONES
TRASPLANTES (ANTICUERPOS NATURALES)
Detección de anticuerpos anti-HLA y especificidad
Metodología CDC ELISA Citometria de flujo Detección por luminex
(LABSCREEN®)
Detección de anticuerpos anti-HLA por CDC
Panel de células (congeladas) PRA ( panel reactive antibody)
Paneles diseñados para asegurar una cobertura máxima de antígenos
Porcentaje de anticuerpos a-HLA 0% 100%
Anfígenos son purificadas de líneas de células transformado por EBV.
Detección de IgG o IgM – depende en el anticuerpo secundario que usan.
Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación
de especificidad de los anticuerpos.
Detección de anticuerpos anti-HLA por ELISA
Detección de anticuerpos anti-HLA por FlowPRA™
Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo.
Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e
identificación de especificidad de los anticuerpos.
CDC
ELISA
FlowPRA
Menor sensibilidad
Mayor sensibilidad
Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-HLA
CROSSMATCH (PRUEBA DE REACCION CRUZADA XM)
Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el suero del receptor, contra los antígenos del donante
DISTINTOS METODOS:CDC: distintas células, tiempos de
incubación, lavados, etc.CITOMETRIA FLUJO: mayor
sensibilidad
IMPORTANCIA DE XM POSITIVO
DEFINIR ESPECIFICIDAD
DE LOS ANTICUERPOS
SENSIBILIZACION Y TRASPLANTE RENAL
ANTICUERPOS anti-HLA
ANTICUERPOS anti-NO HLA
• ANTIGENOS MENORES DE HISTOCOMPATIBILIDAD
• AUTOANTICUERPOS
XM (+) CONTRAINDICACION Tx
XM (- ) BAJO RIESGO
CAMBIO DE CONCEPTO
ANTIGUO ESCENARIO
ANTICUERPOS Y CROSSMATCH
ANTICUERPOS (–) XM (–)
ANTICUERPOS (–) XM (+)
ANTICUERPOS (+) XM (+)
ANTICUERPOS (+) XM (–)
TOMA DE DECISION
DEFINIR RIESGO
EXITO FRACASO
Risk assessment for antibody-mediated rejection
Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies
Contra High risk Intermediate Low risk indicated
Current positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Historical positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Current and historical negative
Cytotoxicity
Flow cytometry Transplantation 2004, 78(2): 186
TIPOS DE DONANTES
DONANTE VIVO
DONANTE CADAVERICO
ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTE
HISTOCOMPATI-BILIDAD. I.S.P. Estudio DC Selección R
CORPORACION TXPesquisa, procuramientoCoordinación
CENTROS CENTROSTRASPLANTES PROCURA
LAB. VALDIVIARegional
MINSALFONASA
LISTA ESPERA D.CADAVER ABO ABO HLA-A,B,DR HLA-A,B,DR
PRA ESPECIFICIDAD XM LT-LB
HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTES
RELACION INJERTO/RECEPTOR
HUESPED RECHAZA INJERTO
INJERTO RECHAZA HUESPED
TOLERANCIA
INMUNOSUPRESION
¡ G R A C I A S !