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Las LipasasLas Lipasas : :
Aplicaciones en BiotecnologíaAplicaciones en Biotecnología
DefiniciónDefinición : :
Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se define como una carboxilesterasa capaz define como una carboxilesterasa capaz de catalizar de catalizar la hidrólisis y la la hidrólisis y la síntesissíntesis de acilgliceroles de cadena de acilgliceroles de cadena larga, teniendo como sustrato standard larga, teniendo como sustrato standard a la trioleina. a la trioleina.
Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasasAcilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas
Origen de las lipasasOrigen de las lipasas::
•Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en:encontradas en:Microorganismos Microorganismos PlantasPlantasAnimales Animales
•Comercialmente en su mayoría son de origen Comercialmente en su mayoría son de origen microbianomicrobianoHongosHongosBacteriasBacteriasLevadurasLevaduras
•Generalidades Generalidades Peso molecular 20-60 kDPeso molecular 20-60 kDContienen 2-15% de carbohidratosContienen 2-15% de carbohidratospH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianaspH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianasTopt = 30-60Topt = 30-60 o oCC
Lipasas disponibles Lipasas disponibles comercialmentecomercialmente
Origen de la lipasaOrigen de la lipasa % de % de proteínaproteína
Actividad Actividad vs vs
Trioleína Trioleína U/mgU/mg
Bandas Bandas SDS-PAGE SDS-PAGE
kDkD
bandas bandas SDS-PAGE SDS-PAGE
Número Número de de
bandas bandas esterasaesterasa
% de % de actividad actividad proteolíticproteolític
aa
Rhizomucor mieheiRhizomucor miehei 3.53.5 1616 2525 55 22 11
Rhizopus spec.Rhizopus spec. 4.84.8 3232 43, 6743, 67 1010 44 33
Humicola lanuginosaHumicola lanuginosa 2.92.9 1010 20,3020,30 44 22 2020
Candida rugosa ICandida rugosa I 4.24.2 1111 20,30,43,20,30,43,67,9067,90
1313 22 <1<1
Candida rugosa IICandida rugosa II 6.46.4 1414 43,6743,67 1111 22 <1<1
Geotrichum candidumGeotrichum candidum 4.34.3 88 6767 33 00 <1<1
Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens 1.21.2 3030 14,25,40,14,25,40,4343
66 33 <1<1
C.viscosum IC.viscosum I 1.11.1 4545 17,30,4017,30,40 33 11 00
C. viscosum IIC. viscosum II 9.59.5 154154 17,30,4017,30,40 33 11 1212
Pureza de lipasas disponibles comercialmentePureza de lipasas disponibles comercialmente
Origen de la lipasaOrigen de la lipasa ObservacionesObservaciones
Candida rugosa (CRL)Candida rugosa (CRL) Inicialmente clasificado como Inicialmente clasificado como Candida Candida cylindracea,cylindracea, clonación y purificación de la clonación y purificación de la proteína revela al menos cinco isoformas. proteína revela al menos cinco isoformas.
Geotrichum candidum (GCL)Geotrichum candidum (GCL) Contiene dos isoformas que se diferencían en la Contiene dos isoformas que se diferencían en la especificidad especificidad cis o transcis o trans en acidos grasos en acidos grasos insaturadosinsaturados
Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL)Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL) En la literatura se reportan diferentes En la literatura se reportan diferentes especificidades aunque la clonación reveló especificidades aunque la clonación reveló identidad casi total. identidad casi total.
Penicillium camembertii Penicillium camembertii (PeCL)(PeCL)
Clasificada como lipasa de Clasificada como lipasa de P. cyclopiumP. cyclopium hasta hasta 1990, recientemente se encontraron cuatro 1990, recientemente se encontraron cuatro isoformas que difieren principalmente en el isoformas que difieren principalmente en el patrón de glicosilaciónpatrón de glicosilación
Pseudomonas glumae (PGL)Pseudomonas glumae (PGL) Clonación y secuenciación reveló alta identidad Clonación y secuenciación reveló alta identidad con la lipasa de con la lipasa de Chromobacterium viscosumChromobacterium viscosum (CVL).(CVL).
Pseudomonas cepacia (PCL)Pseudomonas cepacia (PCL) Reclasificada en 1995 como Reclasificada en 1995 como Burkholderia Burkholderia cepaciacepacia. Clonación y secuenciación reveló . Clonación y secuenciación reveló identidad con la lipasa de identidad con la lipasa de Pseudomonas. sp.Pseudomonas. sp. ATCC21808 (PSL).ATCC21808 (PSL).
Controversias en las propiedades de lipasas Controversias en las propiedades de lipasas disponibles comercialmentedisponibles comercialmente
Clasificación reciente basada en los motivos Clasificación reciente basada en los motivos conservados de su secuencia y en sus conservados de su secuencia y en sus
propiedades biológicaspropiedades biológicas
Propiedades estructurales : Plegamiento común de Propiedades estructurales : Plegamiento común de las lipasaslas lipasas
•Patrón de plegamiento / compuesto por un “core” de hebras rodeado por helices tipico de numerosas hidrolasas
•El sitio activo esta compuesto de una triada catalítica formada por Ser-His-Asp/Glu
•A diferencia de muchas enzimas el sitio catalítico no esta expuesto en la superficie, se encuentra cubierto por residuos hidrofóbicos
Asp/GluAsp/Glu
HisHisSerSer
C
24
3 5 6 7 8
N
A B CD
F
En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasasEn blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de las lipasasLas hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta
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Mecanismo de activación interfacial en las Mecanismo de activación interfacial en las lipasaslipasas
•El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una “tapa” formada por un “loop”
•Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta
•Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal
•Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa
C) estructura cerradaC) estructura cerrada D)estructura abiertaD)estructura abierta
Mecanismo de activación interfacial en las Mecanismo de activación interfacial en las lipasaslipasas
•La presencia de la tapa cubriendo el sitio activo de las lipasas y el fenómeno de activación interfacial no adecuado para distinguir lipasas de esterasas.
•Varias enzimas tienen la tapa hidrofóbica pero no presentan activación interfacial
•p.e. Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa, C.antarctica B, y lipasa pancreática, lipasa
•Vista de arriba de la lipas de Vista de arriba de la lipas de Mucor miehei Mucor miehei
•En En rojorojo zonas polares y en zonas polares y en azulazul zonas zonas hidrofóbicashidrofóbicas
•En En amarilloamarillo sitio activo sitio activo
C) estructura cerradaC) estructura cerrada D)estructura abiertaD)estructura abierta
Acceso al sitio catalítico de las lipasasAcceso al sitio catalítico de las lipasas
Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el sitio activo : Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol
sn3
RO
OR
OR
sn1
sn2
La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos sitios determina la especificidad de cada lipasa
Especificidad por el tamaño de la cadena aciladaRegioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3
Sitio activo y especificidad en lipasasSitio activo y especificidad en lipasas
Asp
O
O
H
N
N
His
H
Ser
O
O
R
O
R2
Asp
O
O
N
N
H
His
Ser
O
R
O
R2
O
H
Asp
O
O
N
N
H
His
Ser
O
R
O
R1
O
H
+Intermediario acil-enzima
Asp
O
O
H
N
N
His
H
Ser
O
O
R
O
R1
Asp
O
O
N
N
H
His
Ser
O
H
O
O
R
H
donador de acilo
Asp
O
O
N
N
H
His
Ser
O
H
O
O
R
R2
PRODUCTO
+
R2
O
H
R1
O
H
Mecanismo catalíticoMecanismo catalítico
Reacciones catalizadas por las Reacciones catalizadas por las lipasaslipasas
OO
RR11 OROR22
++ HH22OOOO
RR11 OHOH++ RR22OHOH
HidrólisisHidrólisis
OO
RR11 OHOH++ RR22OO ++ HOHHOH
EsterificaciónEsterificaciónOO
RR OHOH++ RR22OHOH ++ HOHHOH
EsterificaciónEsterificación
OO
RR33 OHOH++
OO
RR11 OROR22
TransesterificaciónTransesterificación
OO
RR11 OHOH++
OO
RR33 OROR22
OO
RR11 OROR22
++ ++++ ++ RR22OHOH
OO
RR11 OROR33RR33OHOH
OO
RR11 OROR22
AcidólisisAcidólisis
AlcoholisisAlcoholisis
O
R3 OR4
+O
R1 OR2
InteresterificaciónInteresterificación
O
R1 OR4
+O
R3 OR2
O
R1
+O
R OR2
+ R3NH2 + R2OH
AminólisisAminólisis
O
R1 NHR3
O
R1 OH+ + HOH
O
R OH+ R2SH + HOH
TioesterificaciónTioesterificaciónO
R1 SR2
O
R1
+O
R OH+ R3NH2 + HOH
AmidaciónAmidación
O
R1 NHR3
(cont.)(cont.)
Control del equilibrio termodinámico del proceso
Control del grado de acilación de polioles
Monoésteres, Diésteres, Triésteres……..
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
n
-Emulsificantes para especialidades farmacéuticas-Vehículos para medicamentos-Bloques de construcción en síntesis orgánica
Actividad termodinámica: a = X = coeficiente de actividadX = fracción mol
El coeficiente de actividad termodinámica función del número del número y tipo de interacciones soluto-solvente
Control de la posición del equilibrio termodinámico
Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales
•Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de
sus coeficientes de actividad
•Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de
sus coeficientes de actividad
O
H
O
H
O
H
O
H
R
C
O
O
O
H
R
C
O
O
R
C
O
O
O
H
R
C
O
O
R
C
O
O
O
O
C
R
glycerol monoacylglycerol diacylglycerol triacylglycerol
RCOOH
H2O
fatty acid
RCOOH
H2O
fatty acid
RCOOH
H2O
fatty acid
•Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente,
baja concentración al equilibrio
•Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente,
alta concentración al equilibrio
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
monooleína
dioleína
dioleína
dioleína
dioleínadioleína
dioleína
trioleína
trioleína
trdioleína
trioleína
•Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M
•Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos
• Baja solubilidad del glicerol
Síntesis enzimática de monooleína : Glicerol + Ácido oléico en n-hexano
trioleina
dioleina
monooleina
•Rendimiento alto: 80%
•Baja selectividad por
monoésteres
•Trioleina 70%
•Dioleina 27%
•-Monooleina 3%
Síntesis selectiva de monoésteres de polioles
051015205075100
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10100 50 20 15 5 0
75
% de 2M2B en n-hexano
monooleina
dioleina
trioleina
45
35
25
15
5
Modelo de predicción de la síntesis selectiva de monoésteres de polioles
•Cálculo teórico de los
coeficientes de actividad por
UNIFAC
•Calculo de las actividades
termodinámicas de los productos
al equilibrio
•Buena correlación del modelo
con resultados teóricos
0
10
20
30
40
50
60
70
Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis
•Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre 0.5-1 M•Proceso que se puede realizar en reactor contínuo
Síntesis selectiva de ésteres de xilitol
OH
OHOH
OH
OHCH3 CH3
OOH
O
O
OO
CH3
CH3
CH3CH3
OCO- R
O
O
OO
CH3
CH3
CH3CH3
OCO- R
O
O
OHOH
CH3CH3
OCO- R
OHOH
OH
OH
+
ethanol 95 oC/H+
ethanol 95 oC/H+
ethanol 95 oC/H+
2
RCO-Cl/trietilamina
LipasaRCOOH/45 oC
73
27
55
45
37
63
31
69
6
94
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2M2P/DMSO 80:20(44,9)
2M2P (43,8)
2M2B (41,5)
2M2B/hex 50:50(39,7)
n-hexane (30,9)
monoéster de xylitoldi- and triésteres de xylitol
SolventeParametro de polaridad ET(30)
Síntesis selectiva de ésteres de xilitol
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
-
A
c
y
l
O
H
O
H
O
H
O
H
O
-
A
c
y
l
O
-
A
c
y
l
O
H
A
c
y
l
-
O
O
H
O
-
A
c
y
l
O
-
A
c
y
l
O
H
O
H
O
H
Xylito
+ Acyl
Hydrophobic solvent mixtures
1-O-mono-acylxylitol
1,5-O-di-acylxylitol 1,3,5-O-tri-acylxylitol
Polar solvent mixtures
+
•Predicción de la abundancia de los prooductos en función de la polaridad del medio de reacción
•Evaluado para un gran número de mezclas de solventes (acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..)
Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30
R1
R2
NH2
R1
R2
OH
R1
R2
NH
R3
OR1
R2
O R3
O
R1
R2
NH
R3
OR1
R2
O R3
O
R1 = - OCH3
R2 = - OH
Vainillilamina
Vainillilalcohol
+ R3- COOH Lipase
+
+
Amida 95%
Amida 54% Ester 95%
Ester 52%
2M2B
n-hexane
Baja actividad termodinámica de ésteres en n-hexano
Baja actividad termodinámica de amidas en 2M2B
Control de la quimioselectividad del proceso
Resolución de mezclas racémicas quimioselectivamente
OH NH2
OHn
O NH2
OHn
RCO OH NH
OHn
OCR
O NH2
OHn
RCO OH NH
OHn
OCR
+ Lipasa
+
(S)R-COOH
(R)
+
(S) (R)
(rac)
70% 30%
n-hexano
2M2B
17% 83%
R1
R2
NH2
OH
OH
O
R2
R3
NH
O
R2
R3R1
R2
OH
R1 = HR2 = - OH
+
R3 = - OMe
ácido ferúlico
Lipasa2M2B
Síntesis preferencial de amidas en 2M2B
Reacción enantioselectiva
Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en células cancerosas
3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide
• Market Share Forecast
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Chiral Technology Market
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
Chiral Technology Market Share Forecast Breakdown 2002-2009
Traditional
Asymmetric
Biological
Growth of Biological
Decline of Traditional
The Chiral Market
50% : (2R,4R)
25% : (2R,4S)
25% : (2S,4S)
•Enantioselectividad
Poderosos Bloques de construcción en química orgánica
Enzimas mas utilizadas: •Lipasas•Esterasas•Amidasas
Resolución cinética con lipasasResolución cinética con lipasas
Evitar reversibilidad de la Evitar reversibilidad de la resoluciónresolución
•Generación de centros quirales por acilación
•Bloques de construcción en síntesis orgánica
•Construcción de librerias
•Resolución de centros quirales (en polioles)
•Modelos moleculares para RMN
OH OH
OHn
COOH OH OOPhe
OHn +
Lipasa+ H2O
carbono aquiral (R) ó (S)
Solvente orgánico
“Easy-On, Easy-Off Technology”
Sintesis-hidrólisis de amidas
“Imposible” la hidrólisis de amidas con lipasas
Proceso altamente enantioselectivo
N
H
2
C
H
3
R1
R2
N
H
C
H
3
R1
R2
O
C
R
3
N
H
2
C
H
3
R1
R2
N
H
C
H
3
R1
R2
O
C
R
3
N
H
2
C
H
3
R1
R2
R3COO+Lipasa
(R) ó (S)
+H2O
R3COO+2M2B
Lipasa
(R)
R1 = -0CH3 R2 = -0H R3 = cadena hidrocarbonada
+ H2O+
(S)
(R)
EASY-ON
EASY-OFF
SOLVENT SYSTEMS AND SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSESPROCESSES
1. Aqueous Reaction Media : 1. Aqueous Reaction Media : HidrolysisHidrolysis
2. Water: Water-Miscible Systems : 2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Hydrolysis or SynthesisSynthesis
3. Water: Water-Immiscible Systems 3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or : Hydrolysis or SynthesisSynthesis
4. Nonaqueous Reaction Media : 4. Nonaqueous Reaction Media : SynthesisSynthesis
5. Anhydrous Reaction Media : 5. Anhydrous Reaction Media : SynthesisSynthesis
6. Supercritical Fluids : 6. Supercritical Fluids : SynthesisSynthesis
7. Reverse Micellar Systems : 7. Reverse Micellar Systems : SynthesisSynthesis SistemasSistemascon bajocon bajo
8. Solvent-Free Systems : 8. Solvent-Free Systems : SynthesisSynthesis contenidocontenidode aguade agua
9. Gas-Phase Catalysis : 9. Gas-Phase Catalysis : SynthesisSynthesis
10. Ionic Liquids : 10. Ionic Liquids : SynthesisSynthesis
Sistemas de reacción para las lipasasSistemas de reacción para las lipasas
A.A. Immobilization Immobilization
• Adsorption onto solid supports such as silica gelAdsorption onto solid supports such as silica gel• Covalent attachment to solid supportsCovalent attachment to solid supports• Entrapment in organic polymers or microemulsions. Entrapment in organic polymers or microemulsions.
B. Chemical ModificationB. Chemical Modification
1.1. Cross-Linking : Cross-Linking :
• Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC) linked enzyme crystal (CLEC)
• P. cepaciaP. cepacia and and C. antarcticaC. antarctica lipases for CLEC- lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)Biotech)
PREPARATION OF MODIFIED LIPASESPREPARATION OF MODIFIED LIPASES
2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and 2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and SurfactantsSurfactants
• Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG.cyanuric acid chloride activated PEG.
• Alternative to PEG is to use the Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35)polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent as a covalent modifiermodifier
• Hydrophobic polymers such as Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethylpolystyrene and polymethylmethacrylatemethacrylate or amphiphilic polymers such as or amphiphilic polymers such as poly N-poly N-
vinylpyrrolidonevinylpyrrolidone
• Nonionic synthetic Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)monostearate (Span 60)
Aplicaciones industriales de las lipasasAplicaciones industriales de las lipasas
•Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridostriglicéridos
• Disponibilidad de materia prima, Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons 60 millones de tons de aceites y grasas por año.de aceites y grasas por año.
•Cinco millones de toneladas para uso no alimentarioCinco millones de toneladas para uso no alimentario
•La principal aplicación es la obtención de jabones, La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químicoproceso químico
•El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproducto subproducto
•Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con mundo que usa esta tecnología con Candida rugosaCandida rugosa lipase. lipase.
•Proceso en lote a 40 Proceso en lote a 40 ooC, durante 48 horasC, durante 48 horas
•An alternative source of energy for public transport is the An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production.so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production.
•METHYL ESTERS OF FATTY ACIDSMETHYL ESTERS OF FATTY ACIDS
•Produced chemically using oil from various plants (e.g. Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed).rapeseed).
•Alcohoysis catalyzed by KOH Alcohoysis catalyzed by KOH
•Can be catalysed in a single transesterification reaction Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents. using lipases in organic solvents.
•At an industrial scale failed so far because of the high cost At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst. of the appropriate biocatalyst.
•Two strategies were recently presented : Two strategies were recently presented :
•Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated use stability even upon repeated use
•Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalystair drying resulted in a whole-cell biocatalyst
•Síntesis de metil- o etil- ésteres de Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : ácidos grasos por alcoholisis :
BiodieselBiodiesel
Mejoramiento de la untabilidad de los aceitesMejoramiento de la untabilidad de los aceites
Se puede modular el punto de fusión de una grasa por Se puede modular el punto de fusión de una grasa por hidrogenación de dobles enlaceshidrogenación de dobles enlaces
Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos saturados al aceite por interestificación grasos saturados al aceite por interestificación enzimáticaenzimática
sn3
RO
OR
OR
sn1
sn2
sn3
XO
OX
OX
sn1
sn2+
sn3
RO
OX
OX
sn1
sn2
sn3
XO
OR
OX
sn1
sn2+Lipase
Síntesis de sustitutos de grasa de cacaoSíntesis de sustitutos de grasa de cacao
•En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y Malasiaexportadas por Kenia y Malasia
•Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 ooC)C)
sn3
XO
OR
OY
sn1
sn2Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmíticoPara X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico
Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmenteprimordialmente
•Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS). de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS).
•Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpioUso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio
•Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.Rhizopus.
Grasas de alta digestibilidadGrasas de alta digestibilidad
•Mejoramiento en la absorción de triglicéridosMejoramiento en la absorción de triglicéridos
•Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorciónabsorción
sn3
XO
OR
OY
sn1
sn2Para X = palmíticoPara X = palmítico
Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche maternaGrasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna
•Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléicointerestirificación de tripalmitina y ácido oléico
•Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada)L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada)
•““Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis químicamediante síntesis química
Síntesis de emulsificantesSíntesis de emulsificantes
•Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentosindustria de alimentos
•150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir 150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridosde triglicéridos
•Los métodos enzimáticos incluyen : Los métodos enzimáticos incluyen : Esterificación y glicerólisisEsterificación y glicerólisis
•Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorableBajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable
•Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacionalaumentar su estabilidad operacional
Aplicaciones diversas (Hidrólisis)Aplicaciones diversas (Hidrólisis)
•DetergentesDetergentes: Remoción de productos lipídicos: Remoción de productos lipídicos
•Productos comerciales : Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.
•Industria papeleraIndustria papelera : Eliminación de triglicéridos de : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co.,lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co.,
•Industria de lacteosIndustria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteosaditivos a partir de productos lacteos
Promiscuidad Catalítica:
Nuevas reaccionesViejas enzimas
Single-enzyme multi-step conversions
O O
O O
OHHOO
HOOH
OH+
Ser-Hydrolase
"Natural reaction"
OHHOO
HOOH
O O
OO
OHHOO
HOOH
O O
OO
Ser-Hydrolase
"Unatural reaction"
NŸ
NŸ+
NŸ = Nucl?ophile
Nü
Nü
Nü =Nucléophile
47
“Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of enzyme active sites to catalyze more than one chemical
transformation”
•Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre:
•Diferentes grupos funcionales
•Diferentes tipos de enlace
•Diferente mecanismo de reacción
Angew. Chem. Int Ed. 2004, 43, 6032-6040
48
Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por lipasas
• Formación de enlaces C-CNucleófilo
enlaceC-CAtaque nucleofílico
Nucleófilos
Electrófios
49a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun. 2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F. J. of Biotech., 2006.
R1
NHR2
CNCN
NR2
R1
NH NH NH
+CALB
Amines
Addition d'amines secondaires
N
HN
R1
R2
O
O
R3O
O
R3NN
R2
R1
+Hydrolase
50û C solvant org.
addition d'imidazoles
Addition 1,4 d'amines sur des systèmes , insaturés
(5) (6) (7)
(8) (9) (10)
50°CSolvant organique
50
Mecanismo Clásico
H
H
HN
H
N
N
H(His)OO
(Asp)
Oxyanionhole
O
H
CH3
O
O
H
(Thr40)
CH3O
H(Gln 106)
O
O-
O
(Ser)
51
Mecanismo propuesto para Ser-Hidrolasas
Desplazamiento catalítico
Acido de Lewis
Transferencia de protónAcido-Base
52
But : Preparación de intermediarios de la síntesis de -aminoácidos con estereo quuimica específica
R OH
NH2 O
53
H
O
OCH3 Me
O
OCH3 Ph
O
OCH3
H
O
OCH3
Me
H
O
OCH3
Ph
(12a) (12b) (12c)
(12d) (12e)
methyl acrylate methyl crotonate methyl cinnamate
methyl methacrylate methyl 2-phenylacrylate
Esters insaturés
Amines primaires
NH2 NH2
CH3
NH3
Amoníaco Bencilamina-feniletilamina
(R) y (S)(R) and (S)
phenylethylamineAmmonium Benzylamine
54
Figure 1. Hypothetical catalytic addition of benzylamine to methyl crotonate in the active site of CaL-B. The carbonyl oxygen of the ,-unsaturated is bound to the oxyanion hole and the nucleophile is activated by His.
MeO
O
H CH3
H
H
HN
HNH
N
N
HHisOO
Asp
Oxyanionhole
O
H
CH3
O
O
H
(Thr40)
CH3O
H(Gln 106)
H
H
HN
H
N
N
H(His)OO
(Asp)
Oxyanionhole
O
H
CH3
O
O
H
(Thr40)
CH3O
H(Gln 106)
O
O-
O
(Ser)
55
Me
O
OCH3NH2+ CaL-B
72 h, 65oCSolvent
Me OMe
ONH
Ph
Ph
Me NH
O
Ph
+
(1) (2)
(3)
(4)
Me NH
ONHPh
+
(5)Ph
Adición 1,4
Adición 1,2
Doble Adición 1,4
Posibles reacciones
Se ha reportado la formación preferencial de amidas :
•Solventes no polares•Bajas concentraciones de sustrato (Metil acrilato)•Temperaturas ≈ 45 ºC
56
Entry Solvent ET(30) NMR Ratio
% (3) % (4)
1 n-Hexane 30.9 95 52 Toluene 33.9 76
243 DisoPropyl ether 34 64
364 THF 37.4 60 405 n-Hex:2M2B, 1:1 39.2 46
546 n-Hex:2M2B, 1:3 40.1 48
527 2M2B 41.0 20
80
Table 1. Influence of organic media on the reaction of 0.5 M of Benzylamine (1) and 0.75 M of Methyl crotonate (2) using 20 mg/mmol of CaL-B/(1), at 65 °C for 72 h.
57
Changes in polarity of reaction media describing the profile of (A) Michael adduct (3) and (B) aminolysis product (4) as a function of empirical polarity parameters ET(30).
58
Entry[a] [1] (M) % 3 % 4 (%)Conv [b] Final Conc. (M)
(3) (4)
1 0.50 >95 <5 85 0.40 0.022 0.25 63 37 49 0.08 0.043 0.10 62 38 53 0.03 0.024 0.05 37 63 66 0.01 0.02
[a] Substrate initial concentration ratio 1:1.5 (1) with respect to (2). [b] Determined by HPLC and referred to initial concentration of (1).
Table 2. Influence of the initial concentration of (1) in n-hexane on the ratio of (3) and (4) determined by HPLC, after 72 h of reaction.
Aplicacion en química orgánicaAplicacion en química orgánica
Las LipasasLas Lipasas : :
Aplicaciones en BiotecnologíaAplicaciones en Biotecnología