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MÉTODOS DE ANÁLISIS INMUNOLÓGICOS.
Bienvenidos.
Los antígenos (Ag) reaccionan tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos
(Ac)
específicos
El sitio activo para el antígeno denominado epítrope reacciona con el sitio activo
del anticuerpo llamado paratopos (Ag-Ac).
El número de epitópos presentes en los antígenos determina la valencia del ag.
en el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tiene sólo dos
paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs tienen 10 y 4 paratópos respectivamente,
debido a la multivalencia del Ag con las respectivas valencias del Ac, cuando se
da la reacción Ag – Ac se forman agregados moleculares.
Generalidades
Clasificación de interacciones Ag-Ac.
El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos son débiles,
no covalentes y entre ellas están: puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles, de Van der
Waals e hidrofobicas, por lo tanto son reversibles y fácilmente se disocian el complejo ya
formado y de acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenómenos que se pueden presentar como
consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en :
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.
REACCIONES DE FLOCULACIÓN.
REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN.
REACCIONES DE OPSONIZACIÓN.
REACCIONES DE CITÓLIISIS.
REACCIONES DE FIJACION DE COMPLEMENTO.
REACCIONES CON REACTIVOS MARCADOS.
Creite (1869) y Landois (1875), Krauss en 1887
estableciendo el fenómeno de Precipitación
(anticuerpos y antígenos solubles
Stillmark experimenta aglutinaciones entre eritrocitos y extractos de Ricinos communis
Dos años después Charrin y Roger al mezclar bacterias con suero previamente sensibilizados observa
grumos o aglutinados (anticuerpo soluble y antígeno fijo en membrana),
Landstainer descubre el sistema ABO empleando técnicas de hemaglutinación
antigenicidad de los eritrocitos
por Bordet (1898)
1908 Ottenberg realiza al primer prueba Transfusional
1930`s Marrack propone una explicación de la reacción
antígeno-anticuerpos, considerando que
el anticuerpo se une en forma de unión bivalente
y el antígeno en multivalentela formación de un retículo
o enrejado
el de aglutinación de eritrocitos con anticuerpos por
Ehrlich y Morgenroth (1900),
HISTORIA SOBRE LOS MÉTODOS DE ANALISIS INMUNOLOGICOS.
REACCION DE PRECIPITACIÓN
Se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, etc.., al
estar en presencia de sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac posteriormente se
insolubilizan , dando como resultado una reacción de PRECIPITACIÓN.
MECANISMO:
Primera fase o de sensibilización: identificación y fijación del anticuerpo , esta
primera etapa casi no se ve influenciada por factores tales como, temperatura, pH,
fuerza iónica y la concentración de los reactantes.
Segunda fase o de estabilización de la reacción: formación de una estructura
molecular en forma progresiva da un enrejado. Esta 2ª etapa es mas tardada y es
dependiente de lo siguientes factores.
FACTORES QUE INFLUYEN
Temperatura
Relación Ag / Ac
Exposición del antígeno
pH (6.5 – 7.5)
Tiempo
Fuerza iónica del medio
Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas, la
fase 2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes.
TEMPERATURA: Acelera la reacción debido aun incremento de la difusión y el
movimiento de las moléculas. Esto es válido hasta los 56 °C, la mayoría de las
reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, algunas técnicas se
usan a 37 °C , otras a 45 °C y otras a temperaturas frías (4-6 °C).
COMO AFECTAN ESTOS FACTORES LA REACCIÓN
pH: de este factor depende el estado iónico de grupos importantes que
participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH₃) y carboxilo
(-COO), aun así el pH óptimo esta entre 6.8 a 8.6.
FUERZA IÓNICA (μ): Corresponde a la concentración de iones presentes en
el medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir
las cargas de repulsión que impiden que se formen los agregados, el intervalo
óptimo es 0.01- 0.1 para el enlace del Ag y Ac, a altas μ los grupos iónicos son
neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.
CONCENGTRACIÓN DE Ag Y Ac. La concentración de Ag y Ac deben ser
equivalentes para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso
de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, si hay
exceso de Ag o de Ac solo se forman complejos primarios, no hay
precipitación.
CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA.
Ag
Ac
PREZONA POSTZONA
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN.
Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas y
cuantitativas y se pueden realizar en medio liquido y semisólido.
Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:
La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar.
La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interface o Ascoli)
La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)
La doble difusión unidimensional en agar
La difusión radial simple de agar (RID)
La doble difusión radial en gel de agar (DDR)
Las técnicas de difusión se combinan con procedimientos electroforéticos como:
La inmunoelectroforesis (IEF)
La electroinmunodifusión
La electroforesis bidimensional
AGLUTINACIÓN.
Técnicas como la aglutinación y la hemólisis son los métodos cualitativos más empleados en el
Laboratorio del Banco de Sangre:
Para determinar:
Grupo sanguíneo ABO y Rh,
Rastreo de anticuerpos
Coombs directo
Pruebas cruzadas
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico y este se encuentra
en
estado particulado o forme (p.ej. Bacterias, eritrocitos, levaduras, células) reaccionan
formando
grumos o aglutinados y los principios que regulan esta reacción son los mismos de la
reacción de
Precipitación.
REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN.
La primera fase es conocida como sensibilización: proceso mediante el cual el
anticuerpo se une al antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede haber
activación del complemento, donde se observa lisis.
La segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de
anticuerpo, formando grumos o aglutinados que puedes ser vistos a simple vista o en
microscopio.Factores que afectan la reacción de aglutinación:
Temperatura
Relación Ag / Ac
Exposición del antígeno
pH (6.5 – 7.5)
Tiempo
Fuerza iónica del medio
Reacciones de aglutinación factores que influyen: Tipo de inmunoglobulina
Reacciones de Aglutinación Factores que influyen: Integridad de la membrana de eritrocito
Reacciones de Aglutinación Factores que influyen: Densidad del antígeno
Potencial zeta
Las reacciones de aglutinación pueden ser:
La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la distancia entre
partículas, en un medio salino.
Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albúmina o la utilización de enzimas proteolíticas como
la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de reacción.
Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una antigamaglobulina humana denominada
suero de coombs, este se une a la IgG unida al Ag formando puentes y formar aglutinados.
Estas reacciones se llevan a cabo con gran facilidad y su alta sensibilidad, pero no puede cuantificarse y solo
pueden darse resultados en función de realizar diluciones.
AGLUTINACIÓN DIRECTA O ACTIVA, donde los antígenos que intervienen son componentes naturales de la
partícula.
AGLUTINACIÓN INDIRECTA O PASIVA, en donde los antígenos solubles se absorben en forma artificial a
partículas que funcionan como soporte ( de tipo natural o artificial ).
las reacciones de aglutinación se pueden realizar en, placa, tubo y placa de microtitulación.
REACCIONES DE CITÓLISIS.
Los anticuerpos producidos en la respuesta humoral, activan el sistema complemento.
El complemento es un conjunto de glicoproteínas que inactivas se conocen como
(zimógenos) y requieren de ser activados.
La activación del complemento se lleva a cabo en forma de cascada y derivado de su
activación se generan actividades como: quimiotaxis, opsonización, degranulación
de basófilos y células cebadas y la lisis celular.
La activación del complemento se lleva a cabo por dos vías (la clásica y la alterna), y
la vía de la lectina
Cuando se activa el complemento por cualquier vía se lleva a cabo sobre una
superficie celular y en la última etapa forma el complejo de ataque a la membrana
(MAC), que causa la lisis de la célula.
Para que este sistema no cause daño a las propias células, existen otros factores de
regulación.
Reacción de citólisis.
En las reacciones de citólisis , en donde se emplea el complemento como
reactivo (titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de
complemento) se utiliza el suero de algún animal como fuente de
complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el complemento en el
suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que alguno de los
componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su actividad, por
lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en
refrigeración o en su caso de usar productos comerciales liofilizados.
Hemólisis.
Las hemolisinas (amboceptores hemolíticos)son anticuerpos producidos
frente a los antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos.
los amboceptores en presencia del antígeno que estimuló su formación y del
complemento, desencadenan una reacción que causa la lisis de eritrocitos.
Para medir la actividad del amboceptor se realizan diluciones y a veces se
mide sólo el 50% de la hemólisis.
Técnicas con Anticuerpos o Antígenos marcados
Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de estos reactantes. La especificidad de esta reacción le da a estas reacciones in vitro una elevada confiabilidad.
Aumenta la sensibilidad de estas pruebas al utilizar marcas en cualquiera de los dos (Ag o en el Ac), permitiendo demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeñas de los reactantes.
Las principales sustancias utilizadas como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos.
Los isótopos se empazarón a usar en 1966 por la Dr. Yallow, cuando realizó su primer radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de unensayo competitivo en donde se permitía la competencia entre moléculas de Ag no marcadas y marcadas con radiosótopos por los sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificación y la cuantificación del analito en la fracción libre y unida a la reacción.
ANTIGENOS ERITROCITARIOS
SABO/ ANTIGENOS SITIOS ANTIGENICOS x 103
A1 ADULTO A1 NEONATO A2 ADULTO
A2 NEONATO A1B ADULTO A2B ADULTO
B ADULTO B NEONATO
800 – 1170 250 – 370
240 140
460 – 850 140 750
200 – 320
La cantidad de sitios antigénicos, muestran diferencias substanciales para cada sistema eritrocitario así como su expresión en función de la edad