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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA
MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
“SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE
IMINOAZÚCARES DE POTENCIAL ACTIVIDAD
HIPOGLUCEMIANTE”
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO FARMACÉUTICO
PRESENTA:
SOTO ORTEGA MIGUEL ÁNGEL
DIRECTOR INTERNO: DR. BRITO ARIAS MARCO
MÉXICO, D.F. 29 DE MAYO DE 2009
EVALUADORES: DRA. PADILLA MARTÍNEZ ITZIA I.
MCD. DORANTES ÁLVAREZ SAMUEL
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página i
Índice PAG.
1. Resumen…………………………………………………………………………………… 1
2. Introducción………………………………………………………………………............. 2
2.1. Diabetes………………………………………………………………………………. 2
2.2. Insulina y glucosa……………………………………………………………………. 3
2.3. Tipos de diabetes…………………………………………………………………….. 4
2.3.1. Diabetes tipo I……………………………………………………….………... 4
2.3.2. Diabetes tipo II………………………………………………….…………….. 5
2.3.3. Diabetes gestacional……………………………………………….……….… 6
2.4. Causas que originan la diabetes ………………………………………….………. 7
2.5. Estadísticas sobre diabetes………………………………………………….…….. 8
2.6. Tratamiento farmacológico no insulínico………...……………………………..... 11
2.6.1. Fármacos…………………………………………………………………….. 11
2.7. Los inhibidores de la Glucosida……………………………………..……........ 13
2.8. Profármacos……………………………………………………………………….... 16
3. Justificación…………………………………………………………………………………. 17
4. Objetivos………………………………………………………………………………...….. 18
4.1.- Objetivo general……………………………………………………………………... 18
4.2. Objetivos específicos……………………………………………………………….… 18
5. Metodología………………………………………………………………………………… 19
6. Material……………………………………………………………………………………… 22
6. Desarrollo……………………………………………………………………………………. 24
7. Resultados y discusión…………………………………………………………………….. 28
8. Conclusiones……………………………………………………………………………….. 42
9. Recomendaciones para trabajo futuro…………………………………………….…….. 42
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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10.- Cronograma de actividades……………………………………………………………. 43
11.-Bibliografía………………………………………………………………………………... 43
12.- Anexo…………………………………………………………………………………….... 45
INDICE DE FIGURAS PAG.
1. Figura 1.- Producción de glucosa e insulina…………………………………………… 2
2. Figura 2.- Mecanismo por el cual la glucosa entra a la célula ……………………… 3
3. Figura 3.- Diabetes tipo 1……………………………………..…………………………. 4
4. Figura 4.- Diabetes tipo 2 …….…………………………………………………………. 5
5. Figura 5. Diabetes gestacional…………..……………………….…………………….. 6
6. Figura 6.- Diabetes en el mundo……………………………………………………….. 10
7. Figura 7.- Posibles frentes de acción de los antidiabeticos………………..……….. 12
8. Figura 8.- Inhibidores de la -glicosidasa …………………………..……………….. 13
9. Figura 9.- Inhibidores de la -glucosadasa en fase clínica…………………………. 13
10. Figura 10.- Mecanismo de inhibición de iminoazucares en el sitio
de acción de -glucosidasa………………………..……………..………. 14
11. Figura 11.- Sitios de acción de inhibidores de -glicosidasa en la
biosíntesis de glicoproteínas……………………………………………. . 14
12. Figura 12. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa…………… 15
13. Figura 13.-Razones por las que se diseña un profàrmaco………………………. .. 16
14. Figura 14.-Reacción para la obtención del intermediario 2…………...…………… 24
15. Figura 15. Reacción de obtención del intermediario 8….…………………………... 24
16. Figura 16.-Reacción de obtención del intermediario 3……………………...….…… 25
17. Figura 17.- Reacción de obtención del intermediario 9...……………………..…….. 25
18. Figura 18.- Reacción de obtención del intermediario 4…….……………..……….. . 26
19. Figura 19.- Reacción de obtención del intermediario 10…………………………….. 27
20. Figura 20.- Comparación entre los la mezcla de reacción inicial (1)
y la reacción de obtención del intermediario (2) si purificar………….. 29
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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PAG.
21. Figura 21.- Comparación entre el intermediario 2 y el 8 purificados………………. 30
22. Figura 22.- Espectro de 1H RMN del intermediario 2…………………………….…… 31
23. Figura 23.- Espectro de 13C RMN del intermediario 2……………………… …..….. 32
24. Figura 24.- Espectro de 1H RMN del intermediario 8……………………………..... 33
25. Figura 25.- Espectro de 13C RMN del intermediario 8……………………………..... 34
26. Figura 26.- Configuración estructural de la sacarosa protegía (Intermediario 8)…. 35
27. Figura 27.- Comparación entre los intermediarios 2 y 3……………………………... 36
28. Figura 28.- Espectro de 1H RMN del intermediario 3………………………………... 37
29. Figura 29.- Espectro de 13C RMN del intermediario 3………………………………. 38
30. Figura 30.- Espectro de 1H RMN del intermediario 9………………………………… 39
31. Figura 31.- Espectro de 1H RMN del intermediario 4………………………………… 40
32. Figura 32.- Espectro de 13C RMN del intermediario 4………………………………… 41
Índice de Tablas
1. Tabla 1.-Morbilidad por egreso hospitalario año
2006…………………………………………………………………………………… 8
2. Tabla 2.- Cronograma de actividades…………………………………………….. 43
Índice de esquemas
1. Esquema 1.- Metodología de síntesis para la obtención de
Iminoazúcares (1)…………………………………………………… 20
2. Esquema 2.- Metodología de síntesis para la obtención de
Iminoazúcares (2)…………………………………………………… 20
3. Esquema 3.- Secuencia de reacciones realizadas para
la obtención del iminoazúcar………………………………………. 28
Anexos
Anexo 1.- Estudio de cristalografía del intermediario 8…………………………………… 45
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 1
RESUMEN
La diabetes mellitus es una de las enfermedades que hoy en día, es un problema de salud
mundial, y en la población mexicana es causante de diversos padecimientos, lo que
impide a las personas que la padecen llevar una vida normal, ya que la diabetes es una
enfermedad crónica que no tiene cura. Teniendo como únicos tratamientos en la diabetes
tipo 2, la intervención en los estilos de vida con lo cual se llega a lograr un control
metabólico aceptable a largo plazo, y la utilización de fármacos que comienza cuando no
es posible alcanzar los objetivos de un control metabólico tras un periodo razonable de
intervención en los hábitos de vida.
El tratamiento farmacológico no insulínico tiene sustancias pertenecientes a la familia de
las sulfonilureas, meglitinidas, derivados del ácido carbamoilmetilbenzóico, biguanidinas
y más recientemente inhibidores de las alfa-glucosidasas, y pesar de la posibilidad de
contar con una aceptable variedad de fármacos hipoglucemiantes los efectos
secundarios indeseables son significativos. Por esta razón se propone la obtención de
iminoazúcares derivados de sacarosa dirigidos hacia la inhibición de la alfa glucosidasa.
En el presente trabajo se reporta la síntesis, de los intermediarios 2,3,4,8,9 precursores
de un iminoazúcar, empleando sacarosa como material de partida, obtenidos a través de
una estrategia química que propone una secuencia que involucra el uso adecuado de
grupos protectores y la introducción de buenos grupos salientes como el tosilo, mesilo,
triflato, susceptible a ser intercambiado mediante sustitución nucleofílica por un precursor
de amino como grupo azida y final conversión al grupo amino mediante reducción
catalítica para generar el aminodisacárido correspondientes que contengan el grupo
amino en la posición 6 de la glucosa.
Los intermediarios sintetizados fueron purificados y caracterizados mediante 1H RMN y
13C RMN. El intermediario 8 fue caracterizado mediante difracción de rayos X, con lo cual
se obtuvo su estructura tridimensional, que no ha sido reportada previamente por lo que
se preparó el manuscrito para su publicación.
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Soto Ortega Miguel Página 2
2.-INTRODUCION
2.1.-Diabetes
La diabetes mellitus es un desorden metabólico caracterizado por un aumento de los
niveles de glucosa en sangre (hiperglicemia) asociado a una disminución en los niveles de
insulina como resultado de una disfunción parcial o total del las células beta del
páncreas.
Figura 1.- Producción de glucosa e insulina.
Diabetes mellitus, enfermedad producida por una alteración del metabolismo de los
carbohidratos en la que aparece una cantidad excesiva de azúcar en la sangre y a veces
en la orina. Afecta a unos 150 millones de personas en todo el mundo. Es una
enfermedad multiorgánica ya que puede lesionar casi todos los órganos y en especial los
ojos, los riñones, el corazón y las extremidades. También puede producir alteraciones en
el embarazo. El tratamiento adecuado permite disminuir el número de complicaciones.
La diabetes es una enfermedad crónica que no tiene cura.
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2.2.-Insulina y glucosa
Insulina
La insulina es producida por células especiales en el páncreas, un órgano grande
localizado detrás del estómago. La insulina ayuda al cuerpo a usar y a almacenar glucosa
(azúcar), la cual se produce durante la digestión de los alimentos. La insulina se secreta
hacia la sangre en cada comida, y permite al cuerpo usar la glucosa como energía para
las funciones diarias básicas, como moverse y respirar.
Glucosa
La Glucosa es un azúcar que es utilizado por los tejidos como forma de energía al
combinarlo con el oxígeno de la respiración. Cuando comemos el azúcar en la sangre se
eleva, lo que se consume desaparece de la sangre, para ello hay una hormona reguladora
que es la insulina producida por el páncreas (islotes pancreáticos). Esta hormona hace
que la glucosa de la sangre entre en los tejidos y sea utilizada en forma de glucógeno,
aminoácidos, y ácidos grasos. Cuando la glucosa en sangre está muy baja, en
condiciones normales por el ayuno, se secreta otra hormona llamada glucagón que hace
lo contrario y mantiene los niveles de glucosa en sangre.
Figura 2.- Mecanismo por el cual la glucosa entra a la célula.
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2.3.-Tipos de diabetes
Se distinguen dos formas de diabetes mellitus.
La tipo 1, o diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID), denominada también diabetes
juvenil. La diabetes tipo 1 se desarrolla cuando el sistema inmunológico del cuerpo
destruye las células beta del páncreas, las únicas células del cuerpo que producen la
hormona insulina que regula la concentración de glucosa en la sangre. Para sobrevivir, las
personas con diabetes tipo 1 deben administrarse insulina, ya sea mediante inyecciones o
con una bomba de insulina. Por lo general, ese tipo de diabetes ataca a los niños y a los
adultos jóvenes, aunque la aparición de la enfermedad puede producirse a cualquier
edad. La diabetes tipo 1 representa entre el 5% y el 10% de todos los casos
diagnosticados de diabetes. Los factores de riesgo para la diabetes tipo 1 pueden ser
factores autoinmunes, genéticos o ambientales. Hasta el momento, se desconoce cómo
prevenir la diabetes tipo 1. En la actualidad, existen varios ensayos clínicos de métodos
para la prevención de la diabetes tipo 1 en curso o en etapa de planificación.16
Figura 3.- Diabetes tipo 1.
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La diabetes tipo 2, o diabetes mellitus no-insulino-dependiente (DMNID), o diabetes del
adulto, suele aparecer en personas mayores de 40 años y es de evolución lenta,
representa entre el 90% y el 95% de todos los casos diagnosticados de diabetes. Muchas
veces no produce síntomas y el diagnóstico se realiza por la elevación de los niveles de
glucosa en un análisis de sangre u orina. Generalmente comienza con resistencia a la
insulina, un trastorno en el cual las células no utilizan la insulina de manera adecuada. A
medida que aumenta la necesidad de insulina, el páncreas pierde gradualmente su
capacidad de producir insulina. La diabetes tipo 2 está asociada con la vejez, la obesidad,
antecedentes familiares de diabetes, antecedentes de diabetes gestacional, trastornos en
el metabolismo de la glucosa, inactividad física, y raza/ origen étnico. Esta diabetes es
causada generalmente por una deficiencia en los receptores de insulina de las células. Es
muy probable, que la sobreproducción de insulina resultante de la sobrealimentación
característica de la obesidad suprima la síntesis del receptor de la insulina, una
glucoproteína generalmente de la membrana plasmática. En función de esta premisa se
ha establecido la posibilidad de controlar la enfermedad por medio de la observación de
una dieta adecuada, lo cual ha dado buenos resultados a muchos diabéticos.
Figura 4.- Diabetes tipo 2.
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La diabetes gestacional es una forma de intolerancia a la glucosa que se diagnostica a
algunas mujeres durante el embarazo. Durante el embarazo, la diabetes gestacional
requiere de un tratamiento para normalizar los niveles de glucosa en la sangre de la
madre, con el fin de evitar complicaciones en el bebé. Luego del embarazo, entre el 5% y
el 10% de las mujeres que tuvieron diabetes gestacional desarrollan diabetes tipo 2. Las
mujeres que han tenido diabetes gestacional tienen una probabilidad de entre un 20% y
un 50% de desarrollar diabetes en los 5-10 años siguientes. El 70% de las mujeres que
tuvieron diabetes gestacional desarrollarán diabetes tipo 2 en algún momento de su vida.
Figura 5.- Diabetes gestacional.
En las diferentes formas de diabetes, la presencia de niveles de azúcar elevados en la
sangre durante muchos años es responsable de lesiones en el riñón, alteraciones de la
vista producidas por la ruptura de pequeños vasos en el interior de los ojos, alteraciones
circulatorias en las extremidades que pueden producir pérdida de sensibilidad y, en
ocasiones, necrosis (que puede precisar amputación de la extremidad), y alteraciones
sensitivas por lesiones del sistema nervioso. Los diabéticos tienen mayor riesgo de sufrir
enfermedades cardiacas y accidentes vasculares cerebrales. Las pacientes diabéticas
embarazadas con mal control de su enfermedad tienen mayor riesgo de abortos y
anomalías congénitas en el feto. La esperanza de vida de los diabéticos mal tratados es
un tercio más corta que la población general.
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2.4.-Causas que originan la diabetes
Las causas que originan este padecimiento son un alto consumo en la ingesta de
carbohidratos, el exceso de peso, la falta de ejercicio, así como una predisposición de tipo
genético. Una vez declarada la enfermedad se observan anormalidades asociadas a
daños en los vasos sanguíneos, nervios periféricos, retinopatías, neuropatías y en
complicaciones agudas el coma diabético.
Hay dos factores que son especialmente importantes en el desarrollo de la diabetes:
Herencia:
Si uno de sus padres, abuelos, hermano, hermana o inclusive un primo/a tienen diabetes,
se tiene mayores posibilidades de desarrollarla. Hay un 5% de riesgo de desarrollar
diabetes tipo 2, si su padre, madre o hermano/a tienen diabetes. Hay un riesgo todavía
mucho mayor (hasta de 50%) de desarrollar diabetes si sus padres o hermanos tienen
diabetes y usted esta excedido de peso.
Obesidad:
El ochenta por ciento de las personas con diabetes tipo 2 están excedidas de peso
cuando son diagnosticadas. Los síntomas desaparecen en muchos de estos pacientes.
Otros factores pueden causar o provocar la diabetes, incluyendo:
Edad: Las células beta, productoras de insulina, disminuyen la cantidad en el cuerpo con
la edad.
Virus: Ciertos virus pueden destruir células beta en personas susceptibles.
Sistema inmunológico defectuoso: Los científicos ahora creen que no hay una sola causa
de diabetes, sino que múltiples factores contribuyen a provocar al sistema inmune a
destruir células beta.
Traumatismo: Accidentes u otras lesiones pueden destruir el páncreas, que es donde es
producida la insulina.
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Drogas: Medicamentos recetados para otro problema pueden poner en evidencia la
diabetes.
Estrés: Durante períodos de estrés, ciertas hormonas producidas en esos momentos
pueden impedir el efecto de la insulina.
Embarazo: Las hormonas producidas durante el embarazo pueden llegar a impedir el
efecto de la insulina.17
2.5.- Estadísticas sobre diabetes
Tabla 1.-Morbilidad por egreso hospitalario año 2006
Causa Defunciones Generales
Total 49,894
Enfermedades del corazón 9,917
Enfermedades isquémicas del corazón 7,041
Resto de enfermedades del corazón 2,876
Diabetes mellitus 8,435
Tumores malignos 6,867
Enfermedades cerebrovasculares 2,783
Enfermedades del hígado 2,506
Enfermedad alcohólica del hígado 1,025
La diabetes mellitus es una de las principales causas de muerte en la población
mexicana, en el cuadro 1 se presenta los decesos del año 2006 y la causa de éstos, se
observa que la diabetes mellitus es la segunda causa de muerte con 8,435 defunciones
generales.
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En estudios realizados durante la década pasada se previó que la prevalencia se
encontraba entre 8 y 9% en la población mexicana y se calcula que podrá llegar a 12.3%
en el año 2025.
Actualmente, la población en México de personas con diabetes fluctúa entre los 6.5 y los
10 millones (prevalencia nacional de 10.7% en personas entre 20 y 69 años). De este
gran total, 2 millones de personas no han sido diagnosticadas. Además, es necesario
considerar que dos de cada tres mexicanos tienen sobrepeso u obesidad (prevalencia
nacional de obesidad del 24.4%), que fungen como factores de riesgo para desarrollar la
enfermedad.
En México, desde 1940 la diabetes ya se encontraba dentro de las primeras 20 causas
de mortalidad, con una tasa de 4.2 por 100 000 habitantes. En 1970, la diabetes ocupó el
15º lugar como causa de muerte. Diez años después ocupó el noveno lugar y para 1990
alcanzó el cuarto lugar como causa de mortalidad general. A partir de 2000, la diabetes es
la primera causa de muerte en mujeres y la segunda en hombres (después de la
cardiopatía isquémica, enfermedad relacionada con la diabetes). Contrario a lo observado
con otras enfermedades, la tasa de mortalidad por DM aumentó desde el año 2000 al
2003. Por ejemplo, en las mujeres, la tasa se incrementó 17.1% (de 51.2 a 61.8 por 100
000 habitantes) y en los hombres el ascenso fue de 22.2% (de 42.2 a 51.6 por 100 000
habitantes). En 2003, la diabetes representó 12.6% de todas las muertes ocurridas en el
país y la edad promedio al morir fue de 66 años.
Se ha reportado que la frecuencia de diabetes es mayor en la población con menor índice
de escolaridad y en la de menor ingreso. La población con obesidad, según su índice de
masa corporal y circunferencia de la cintura, presenta una prevalencia mucho mayor que
aquélla sin obesidad. Existe una mayor prevalencia de diabetes en pacientes con
hipertensión arterial, hipercolesterolemia, microalbuminuria y enfermedad renal.
Desde un punto de vista epidemiológico, la diabetes mellitus se ha transformado en una
pandemia que no tiene distingos de raza, nacionalidad o estrato social. Se han realizado
estudios conducentes al establecimiento de proyecciones de los cuales se ha concluido
que: “La incidencia de diabetes para todos los grupos etarios (distintas edades) fue
estimada en 2,8% en el año 2000 con una proyección del 4,4% para el 2030. Se ha
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proyectado un crecimiento del número total de diabéticos de 171 millones para el año
2000 hasta 366 millones para el 2030. Se estima que la población urbana en los países
en vías de desarrollo se duplicará entre el 2000 y el 2030. El cambio demográfico más
importante en la incidencia de la diabetes se observa como un aumento en la proporción
de la población mayor de 65 años.” En América Latina se estimó un total para el año 2000
de 33.016.000 de afectados con una proyección para el 2030 de 66.812.000 personas
diabéticas. En la figura 6 podemos apreciar los datos en su conjunto.
Figura 6. Diabetes en el mundo. Estimación del crecimiento de la enfermedad del año 2000 con proyección al
2030.
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2.6.-Tratamiento farmacológico no insulinico.
La diabetes mellitus (DM) afecta a 1 de cada 10 personas, siendo el 90 % diabéticos tipo
II, cuyo control, salvo escasas excepciones, corresponde a atención primaria.
El tratamiento de la hiperglucemia en la DM tipo II implica corregir tres defectos.
1.- Resistencia a la acción de la insulina.
2.- Lesión de las células beta del páncreas, con déficit en la producción de la insulina.
3.- Aumento en la producción hepática de glucosa (fundamentalmente en la hiperglucemia
durante el ayuno).
Para actuar sobre estos defectos se cuenta con dos alternativas.
La intervención en los estilos de vida
La utilización de fármacos
La intervención en los estilos de vida es el “antibiabetico” de elección al inicio del
tratamiento de DM tipo II. Se ha demostrado su eficacia en el control de la resistencia
insulìnica. Pero solo un 10 % de los pacientes logran un control metabólico aceptable a
largo plazo.
2.6.1.-Fármacos
En la utilización de fármacos se debe comenzar cuando no es posible alcanzar los objetivos
de un control tras un periodo razonable de intervención en los hábitos de vida.
Se dispone de dos grupos fundamentales de fármacos:
1.- Fármacos que Actúan descendiendo las cantidades de glucosa
Sulfonilureas
El mecanismo de acción de estas drogas comprende efectos pancreáticos y
extrapancreáticos. Los primeros incluyen un aumento de la estimulación a las células b del
páncreas para la liberación de insulina, este efecto se produce por un bloqueo de la bomba K-
ATPasa lo que se traduce en una despolarización prolongada de la membrana celular, con el
consiguiente ingreso del Ca++ extracelular provocando la liberación de la insulina de los
gránulos secretorios hacia el torrente sanguíneo.
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Meglitinidas
El mecanismo de acción fundamental es la estimulación de las células beta del páncreas
para que liberen insulina1 por medio de la regulación de la salida de potasio a través de los
canales de ese ion dependientes de ATP. La salida de potasio de la célula estimula un
aumento del calcio intracelular, y ello conlleva a un aumento en la fusión de los gránulos
transportadores de insulina con la membrana celular y ultimadamente, a un aumento en la
secreción de la insulina
2.- Fármacos que Impiden el asenso de las cantidades de glucosa
Biguadinas
El mecanismo de acción fundamental es la inhibición de la gluconeogénesis hepática y el
incremento de la glucólisis anaeróbica, con la consiguiente elevación de alanina, glicerol y
ácido láctico. Otro mecanismo implicado es la disminución de la absorción intestinal de
glucosa.
Inhibidores de la -glucosidasa intestinales
El mecanismo de acción fundamental es la inhibición reversible y competitiva de las -
glucosidasas en el borde en cepillo de la mucosa intestinal, produciendo el retraso en la
absorción de los hidratos de carbono complejos, con la consiguiente reducción del pico
máximo de glucemia postprandial. 19
Figura 7. Existen básicamente 2 posibles frentes de acción de los antidiabéticos orales: la célula beta (sulfonilureas y meglitinidas), el borde en cepillo de la mucosa intestinal (inhibidores de alfa glicosidasa).
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2.7.-Los inhibidores -glicosidasa
Los inhibidores de -glicosidasa son compuestos de naturaleza glicosídica que contienen
en su estructura nitrógeno intra o extracíclico. Estos derivados han cobrado una gran
importancia en la terapéutica debido a que al inhibir -glicosidasa producen un efecto
hipoglucemiante y por consiguiente son de gran utilidad en el control de glucosa
sanguínea en pacientes con diabetes mellitus. Actualmente el pseudotetrasacárido
Acarbosa y el iminoazucar Miglitol (Figura 8), el cual es un derivado de 1-
desoxynojirimicina, son 2 inhibidores de -glicosidasa aprobados para su uso en
pacientes con diabetes tipo II. Otros candidatos que se encuentran en fase clínica
avanzada son castanopermina, swainsonina, kifunensina, y desoximannonojirimicina entre
otros representados en la figura 9.
OHHO
HO
OH
NH
O
OH
OHHO
O O
OH
OHHO
O O
OH
OHHO
OHAcarbosa
N
OH
OH
HO
OH
OH
Miglitol
Figura 8.- Inhibidores de -glicosidasa.
N
OH
HOHO
HO
castanospermina
NH
OH
HOHO
HO
desoximannonojirimicina
NHO
N
HO
HO
OH
swainsonina
NH
OO
OHOH
HO
kifunensina
Figura 9.- Estructura de inhibidores de -glicosidasa usados en el tratamiento de diabetes mellitus tipo II.
Las glicosidasas son enzimas que desempeñan un papel importante en el procesamiento
de varias glicoproteínas y glicolípidos, y se ha postulado que el mecanismo de inhibición
procede a través de un estado de transición de media silla cargado positivamente que
interactúa con los residuos de ión carboxilato y GDP en el sitio activo de la enzima como
se observa en la figura 10.
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Figura 10.- Mecanismo de inhibición de iminoazucares en el sitio de acción de -glucosidasa.
Asimismo, como se observa en la figura 11 se han determinado las posiciones dentro de
la secuencia glicosídica sobre los cuales los inhibidores de -glucosidasa ejercen su
actividad inhibitoria.
Figura 11.- Sitios de acción de inhibidores de glicosidasa en la biosíntesis de glicoproteínas.
La síntesis quimioenzimática de sustancias de potencial uso terapéutico es una poderosa
herramienta combinatoria ya que aprovecha los beneficios de ambas, es decir a través de
la síntesis orgánica se pueden preparar una amplia variedad de precursores de manera
accesible, y de la biocatálisis enzimática es posible llevar a cabo transformaciones con
una elevada estereoespecificidad y estereoselectividad. El uso de enzimas para llevar
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transformaciones químicas ha tenido un desarrollo notable principalmente en la síntesis
asimétrica y la resolución cinética de mezclas racémicas. Recientemente la
desimetrización entendiéndose como la modificación enzimática que elimina uno o más
elementos de simetría como estrategia para obtener sustancias óptimamente puras se
revela como otra estrategia de gran potencial dentro de la biocatálisis.9
El desarrollo de métodos de síntesis asimétrica tanto químicos como enzimáticos para la
obtención carbohidratos isostéricos como iminoazúcares, tioazúcares y
carboaminoazúcares ha tenido un significativo desempeño y potencial generando una
importante variedad de sustancias activas en el tratamiento del VIH, diabetes, enfermedad
de Gaucher, y cáncer.
La sacarosa es un disacárido abundante y accesible que se obtiene de la caña de azúcar
y donde México ocupa el sexto lugar como productor a nivel mundial y de donde se extrae
del 8 al 15% de sacarosa a partir de la safra de la caña de azúcar. Desafortunadamente el
abuso en el consumo de este edulcorante natural es una de las causas principales en la
alta incidencia de personas con diabetes mellitus. La enzima invertasa (sacarasa) es una
-hidrolasa que desdobla el disacárido sacarosa en los monosacáridos -D-glucopiranosa
y -D-fructofuranosa en cantidades equivalentes (figura 12). Su nombre se debe a que
cambia la rotación óptica de la sacarosa [+ 66.5] a una rotación negativa producto de la
hidrólisis, que es promedio de la rotación de la glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4].
Sacarosa -D-glucopiranosa -D-fructofuranosa
Figura 12. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa.
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La enzima invertasa se emplea en la industria alimenticia para obtener fructosa a partir de
sacarosa debido a que tiene mayor poder edulcorante y no cristalliza fácilmente. Una
amplia variedad de microorganismos producen invertasa para utilizar la sacarosa, entre
ellos tenemos a Cellulomonas flavigena como una fuente accesible de invertasa.
2.8.-PROFARMACO
Debido a que los fármacos con los que se cuenta para el tratamiento de la diabetes tipo 2,
producen efectos secundarios significativos, se propone el desarrollo de un iminoazúcar
como profármaco con posible actividad hipoglucemiante, sintetizado a partir de sacarosa,
por medio de una serie de reacciones se introducirá en la posición 6 de la glucosa un
grupo amina, que posteriormente, será sometido a la acción de la enzima hidrolítica
invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el sustrato modificado conteniendo el
grupo amino, que es un isóster clásico del alcohol primario del sustrato natural, en esta
ruta sintética, la hidrólisis del disacárido modificado representa la liberación del
intermediario de glucosa conteniendo el grupo amino el cual llevara a cabo una reacción
de adición nucleofílica intramolecular dando lugar a la formación de la imina cíclica la cual
por reducción catalítica conducirá a la formación del iminoazùcar, que constituye uno de
los productos de interés como sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante. El
producto resultante será evaluado como profármaco, teniendo en cuenta que al tenerlo
como un posible profármaco, este tendrá algunas ventajas, las cuales no se tendrían en
un fármaco, como lo son estabilidad, especificidad y menor toxicidad
.
Figura 13. Diversas razones por la que se diseña un profármaco.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 17
3.-JUSTIFICACIÓN
La diabetes mellitus es un problema de salud mundial y en México constituye uno
de los principales padecimientos ocupando el tercer lugar en decesos y el noveno
lugar en incidencia con alrededor de 9 millones de adultos identificados.
A pesar de la posibilidad de contar con una aceptable variedad de fármacos
hipoglucemiantes los efectos secundarios indeseables son significativos entre los
que se mencionan la falta de capacidad de respuesta de las células beta para
producir mayor cantidad de insulina por efecto del fármaco, la hipoglucemia,
acidosis láctica, hepatotoxicidad, flatulencia y diarrea. Por esta razón proponemos
la obtención de iminoazúcares derivados de sacarosa dirigidos hacia la inhibición
de -glucosidasa que además posean capacidad edulcorante.
Se propone el uso de sacarosa como material de partida debido a que por una
parte no se han encontrado al momento de presentar esta propuesta reportes de
obtención de iminoazúcares a partir de este disacárido, y por otra debido a su
abundancia y accesibilidad.
La sacarosa es un disacárido accesible no tóxico que además de su importante
papel en sector alimenticio puede ser un importante material de partida en la
obtención de sustancias farmacológicamente activas.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 18
4.- OBJETIVOS
4.1.- OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un procedimiento químico, que permita obtener aminoazucares endo y
exocíclicos de potencial actividad inhibitoria de -glucosidasa a partir de sacarosa.
4.2.-OBJETIVOS ESPECIFICOS
Síntesis de intermediarios y productos.
Caracterización espectroscópica por resonancia magnética nuclear de hidrogeno,
carbono 13, espectrometría de masas y en su caso difracción de rayos X, de
intermediarios y productos.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 19
5.- METODOLOGÍA
La metodología sintética para la obtención de los iminoazúcares objeto de nuestro estudio
se basa en los esquemas 1 y 2 que se describe a continuación.
El esquema 1 inicia con la protección selectiva de sacarosa 1 en las posiciones
hidroxílicas 6 y 4 de glucosa para los cual se utiliza benzaldehído dimetilacetal en medio
ácido, 15 generando el intermediario protegido 2. El siguiente paso consiste en la reacción
de tosilación en piridina para incorporar el ester sulfónico en la posición 4 de fructosa
conteniendo la posición hidroxílica primaria2 y posterior peracetilación con anhídrido
acético en piridina para generar el intermediario 3. Este último paso tiene la finalidad de
permitir la separación de las señales de los hidrógenos del disacárido en su espectro de
resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) así como favorecer la purificación
del disacárido en sistemas no polares. El intermediario resultante se hace reaccionar con
azida de sodio en DMF para mediante una reacción de sustitución nucleofílica reemplazar
el grupo tosilo por el grupo azida y dar lugar a la formación del intermediario 4. La
reacción subsecuente de este intermediario bajo condiciones de hidrogenación catalítica
conduce a la formación intermediario 5 el cual contiene una amina primaria en la posición
4’ de la fracción de fructosa del disacárido. La remoción final de los grupos protectores
benciliden y acetato se llevara a cabo con Yodo en metanol y solución de metóxido de
sodio respectivamente para generar el intermediario de sacarosa isostérico 6.
El siguiente paso es crítico y consiste en someter el intermediario 6 a la acción de la
enzima hidrolítica invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el sustrato
modificado conteniendo el grupo amino en la posición 4’ de fructosa que es un isóster
clásico del alcohol primario del sustrato natural. Si el reconocimiento no es posible se
someterá el intermediario de sacarosa antes mencionado a condiciones de hidrílisis ácida
con la finalidad de separar los monómeros constitutivos, aunque como se ha
documentado existe el riesgo de modificación estructural de los carbohidratos cuando
están sujetos a condiciones ácidas. Para esta ruta sintética la hidrólisis del disacárido
modificado representa la liberación del intermediario de fructosa 8 conteniendo el grupo
amino el cual llevara a cabo una reacción de adición nucleofílica intramolecular dando
lugar a la formación de la imina cíclica la cual por reducción catalítica conducirá a la
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 20
formación del imino azucar 9 que constituye uno de los productos de interés como
sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante.
O
R1O
R1OR2O
OR2 O O
OR3
OR3
OR4
R3O
O
R1O
R1OR2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4
R3O
1 R1, R2, R3, R4 = H
2 R1 = CH(Ph), R2, R3, R4 = H
i
vi
3 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = Ts
4 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
5 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = NH2iv
HO+
6 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
v
O
HO
OH
H2NNHO
OH
HOH
HO
vii
7 8
9
Esquema 1.- Metodología de síntesis para la obtención de los iminoazúcares (1)
El esquema 2 propone la protección inicial de sacarosa 1 con benzaldehído dimetilacetal
en medio ácido, seguido por una reacción de peracetilación generando el intermediario 10
el cual es a desprotección selectiva del grupo benciliden bajo condiciones de Perlman
dando lugar al intermediario 11. El siguiente paso consiste hacer reaccionar con cloruro
de tosilo en piridina con la finalidad de producir el intermediario 12, el cual contiene el
éster sulfónico en la posición 6 de glucosa. Posteriormente se sigue una secuencia de
pasos similares al esquema 1 consistentes en la reacción con azida de sodio en DMF,
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 21
hidrogenación catalítica y desacetilación 13 y 14 respectivamente. La acción hidrolítica de
invertasa o de tipo ácido sobre el aminodisacárido 14 de acuerdo a la hipótesis generará
los intermediarios 15 y 16, de los cuales el primero llevará a cabo la ciclización
intramolecular para conducir al iminoazúcar 17 de potencial actividad hipoglucemiante.
O
R1O
R1'OR2O
OR2 OO
OR3
OR3
OR4
R3O
O
R1O
R1'OR2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4
R3O
1 R1, R1', R2, R3, R4 = H
10 R1, R1' = CH(Ph), R2, R3, R4 = Ac
i
vi
11 R1,R1' = H, R2 , R3, R4 = Ac
12 R1 = OTs, R1' = H, R2 , R3, R4 = Ac
ii
iii
13 R1 = N3, R1' = H, R2 , R3, R4 = Aciv
HO+
14 R1 = NH2, R1' , R2 , R3, R4 = Hv
vii
15 16
17
H
NH2
O
OH
OH
OH
N
OH
OH
HO
H
i) a) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. b) Ac2O, Py, t.a. ii) Pd(OH)2, MeOH. iii) TsCl, Py, t.a., 7 h.
iv) NaN3, DMF, reflujo 6 h. H2, Pd-C, EtOH. v) MeONa, MeOH. vi) Invertasa o H3O+. vii) H3O+,
Pd-C, EtOH
Esquema 2.-Metodología de síntesis para la obtención de los iminoazúcares (2)
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 22
6.- Material
Reactivos:
Sacarosa Grado analítico
Acido p-Toluensulfonico
Benzaldehído dimetilacetal
Cloruro de tosilo
Azida de sodio
Hidróxido de paladio en carbón activado
Dimetilformamida (DMF)
Piridina
Anhídrido acético
Hidrogeno (g)
Yodo
Materiales:
Silica gel
Sulfato de sodio anhidro
Solución reveladora de azucares (sulfato cérico amoniacal)
Agente filtrante “celita”
Placas de silica gel
Matraz bola de diferentes volúmenes
Viales
Columnas de purificación
Soporte universal
Pinzas de nuez
Pinzas
Espátulas
Matraz de precipitados de diferente volumen
Pipetas Pasteur
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Propipetas
Barras magnéticas
Solventes orgánicos:
Metanol Grado analítico
Diclorometano grado analítico
Acetato de etilo Grado analítico
Hexano grado analítico
Acetona Grado analítico
Equipo:
Rotavapor
Parrilla de calentamiento con magneto
Campana de extracción
Cámara de UV
Equipo para resonancia magnética nuclear
Balanza analítica
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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7.- DESARROLLO
Obtención de 4,6-O-Benciliden-1,2,3-tri-O-Acetil glucopiranosa (2)
Figura.-14- Reacción de obtención del intermediario 2.
En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética se adiciona sacarosa (5.81 g,
16.9 mmol) y posteriormente en el siguiente orden se agrega, dimetil formamida anhidra
DMF (80 mL), benzaldehído dimetal acetal (2.84 mL, 18.9 mmoL) y Acido p-
Toluensulfonico (0.644 g), y la reacción se deja con agitación durante 24 h a temperatura
ambiente. Se coloca la mezcla de reacción en rotavapor para eliminar el DFM a
temperatura >90 °C hasta obtener un residuo viscoso. Posteriormente se disuelve 1.9 g
de la mezcla viscosa en 5 mL de piridina, se adiciona lentamente 5 mL de anhídrido
acético manteniendo la reacción con agitación a temperatura ambiente durante 24 h. La
reacción se evaporó en rotavapor para generar una mezcla productos que contienen al
intermediario 2 en forma de anómeros, los cuales fueron purificados por cromatografía en
columna usando como fase estacionaria silica gel, y como sistemas de elusión hexano-
acetato de etilo a concentraciones 2:1, 1:1, 1:2 v/v y metanol para obtener 1 g (53%) de
la mezcla anómerica del intermedio 2 como un sólido cristalino.
Obtención de 4,6-Di-O-benciliden-1’,2,3,3’,4’,6’-hexaacetilsacarosa (8)
Figura.-15- Reacción de obtención del intermediario 8.
O
OO
OH
HO
HOHO
HOOH
OHHO
OO
O
OOAcO
OAc
OAc OAc
AcO
OAc
Ph
1 8
a
a) 1) PhCH(OCH3)2, DMF, p-TsOH. 2) Ac2O, Py.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Este intermediario se obtiene siguiendo el procedimiento anteriormente descrito para la obtención del intermediario 2, y en el proceso de purificación por cromatografía en columna aparece en fracciones posteriores con sistema de elusión hexano-acetato de etilo 1:1, obteniéndose como un sólido cristalino con rendimiento de 15% (0.3g, 0.48
mmol) con un valor de Rf menor . El análisis por 1H NMR de (8) en CDCl3, 300 MHz, , p.p.m. muestra: 2.0-2.1 (6S , 18H acetatos), 3.6-3.8 (m, 2H-4’,5’), 4.1-4.4 (m, 7H-5,6,2’,5’), 4.8 (dd, 1H-2), 5.3 (t, 1-H-4), 5.4 (d, 1H-3’), 5.5 (s, 1H-bencill), 5.6 (t, 1H-3), 5.7 (d, 1H-1), 7.3-7.4 (m, 5H aromáticos).
Obtención de 1, 2,3-Tri-O-Acetil Glucopiranosa (3)
Figura.-16- Reacción de obtención intermediario 3.
En un matraz de bola de 100 mL se adiciona el intermediario 2 (1 g, 2.5 mmol), a este se
le agrega 30 mL de una mezcla de metanol-acetato de etilo (3:2), e hidróxido de paladio,
como catalizador (0.1 g), para realizar una hidrogenación catalítica, se deja reaccionar a
temperatura ambiente y con agitación. Esta reacción se lleva a cabo en el transcurso de
24 h, monitoreándola mediante placas de cromatografía de placa fina. Posteriormente
cuando la reacción se completa, se retira el catalizador, por medio de una percolación
utilizando metanol como sistema de elución. El producto (intermediario 3) de esta reacción
es un sólido cristalino con un rendimiento de 80% (0.8 g, 2.6mmol).
Obtención de 4,6-Dihidroxi-1’,2,3,3’,4’,6’-hexaacetylsacarosa (9)
c
c) H2, Pd-C, AcOEt-MeOH
OO
O
OOAcO
OAc
OAc OAc
AcO
OAc
Ph
8
HOHO
O
OOAcO
OAc
OAc OAc
AcO
OAc
9
Figura.-17- Reacción de obtención intermediario 9.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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En un matraz de 50 mL se agrega el intermediario 8 (0.1 g, 0.16 mmol), posteriormente
se agregan 15 mL de una mezcla de metanol-acetato de etilo (3:2), e hidróxido de
paladio (0.05 g), teniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente y con agitación
constante para que se lleve a cabo la hidrogenación catalítica, esta reacción se completó
en 24 h, teniendo que ser monitoreada por medio de cromatografía de placa fina.
Posteriormente cuando la reacción se completa, se retira el catalizador, por medio de una
percolación utilizando metanol como sistema de elución. El producto de esta reacción es
un sólido cristalino, con un rendimiento de 72 % (0.075 g, 0.13 mmol).
Obtención de 6-Tosil-1,2,3-Tri-O-Acetil Glucopiranosa (4)
Figura.-18. Reacción de obtención intermediario 4.
Para la obtención de este intermediario, en un matraz de bola de 50 mL se agrego el
intermediario 3 (0.2 g 0.65 mmol), cloruro de tosilo (1 g, 5.26 mmol) y piridida (5 mL), para
que se lleve a cabo la reacción la mezcla tiene que estar a temperatura ambiente y
provista de agitación, la reacción se completó en 24 h, teniendo que ser monitoreada
mediante cromatografía de capa fina para verificar que la reacción se llevó a cabo.
Posteriormente se realiza una purificación por cromatografía en columna usando como
fase estacionaria silica gel, y como sistemas de elusión hexano-acetato de etilo a
concentraciones 2:1, 1:1, 1:2 v/v y metanol para obtener el intermediario 4 con un
rendimiento de 40% (0.08 g, 0.24 mmol).
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Obtención de 6-Tosil-1’,2,3,3’,4’,6’-hexaacetylsacarosa (10)
Figura.-19.- Reacción de obtención intermediario 10.
Para la obtención del intermediario 10 de la secuencia a partir de la sacarosa, se agregó
en un matraz de bola de 50 mLse, el intermediario 9 (0.075 g 0.13 mmol), cloruro de
tosilo (0.5 g, 1.05 mmol) y piridida (4 mL), para que se lleve a cabo la reacción la mezcla
de mantuvo a temperatura ambiente y provista de agitación, la reacción se completó en
24 h, teniendo que ser monitoreada mediante cromatografía de capa fina para verificar
que la reacción se llevó a cabo.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 28
8.- RESULTADOS Y DISCUSION
Los intermediarios que se describen fueron obtenidos de acuerdo al esquema 3 que se
representa a continuación.
a) 1) PhCH(OCH3)2, DMF, p-TsOH. 2) Ac2O, Py. b) H2, Pd-C, AcOEt-MeOH.c) Ts-Cl, Py.
d) NaN3, DMF. e) H2, Pd-C, AcOEt-MeOH. f) MeONa, MeOH.
Esquema 3.- Secuencia de reacciones para síntesis del iminoazúcar.
La síntesis de los intermediarios descritos inicia con la reacción de protección selectiva de
las posiciones 4,6 de sacarosa con benzaldehído dimetilacetal en DMF. La reacción fue
evaporada a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua con la finalidad de
eliminar la DMF la cual presenta un punto de ebullición de 140oC y la residual fue
eliminada con una corriente de aire durante 24 h. Posteriormente la mezcla viscosa de
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 29
difícil purificación por cromatografía en columna fue disuelta en piridina y anhídrido
acético y la reacción se continuo durante 24 h. Al término de este lapso se monitoreo la
reacción por cromatografía en capa fina presentando varias manchas como se observa
en la figura 20. Esta placa presenta manchas de residuos de materia prima que no
reacciono y de productos formados, estas se pueden observar después de aplicar una
solución reveladora de azúcares (sulfato cérico amoniacal), a la placa, y posteriormente
someterla a calentamiento en parrilla para carbonizar el azúcar presente.
Figura 20.- Comparación entre los la mezcla de reacción inicial (1) y la reacción de obtención del
intermediario (2) sin purificar.
La mezcla fue purificada por cromatografía en columna empleando diferentes gradientes
de concentración de un mezcla de hexano-acetato de etilo y se obtuvieron 2 fracciones
puras correspondientes al intermediario 2 con un valor de Rf de 0.91 y otra del
intermediario 8 con un valor de Rf de 0.1 (hexano-acetato de etilo 1:1). El rendimiento
obtenido fue de 35 y 15 % respectivamente, sin embargo se observa perdida de producto
en las fracciones parcialmente puras. (Figura 21)
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 21.- Comparación entre el intermediario 2 y el 8 purificados.
El producto de mayor valor de Rf fue caracterizado por resonancia magnética nuclear de
hidrógeno (1H RMN), carbono 13, y difracción de rayos X, encontrando que la estructura
corresponde al intermediario de glucosa protegida 2. Este resultado fue inesperado, ya
que involucra la ruptura del enlace glicosídico que une a las unidades de glucosa y
fructosa, y probablemente se debió a que las condiciones de reacción en medio acido, y
posterior eliminación de la DMF por calentamiento en rotavapor a temperaturas cercanas
al punto de ebullición del agua provocaron la hidrólisis referida, lo cual condujo a la
formación del derivado de glucopiranosa 2 en forma de mezcla racémica. Este
intermediario fue sometido a la secuencia de reacciones planteadas en el esquema 3 con
la finalidad de obtener el correspondiente derivado de aminoazúcar 7 ya que este coincide
con uno de los 2 aminoazúcares propuestos en el esquema general (ruta 2).
El espectro de 1H RMN del intermediario 2 como mezcla anomérica muestra señales
simples en 2 ppm que corresponden a 6 grupos metilo, de 3.6 a 4.4 ppm se observan
varias señales múltiples que contienen los hidrógenos H-5, H-6 y H-6 de la mezcla, de
5.0-5.6 ppm un grupo de señales triples que corresponden a H-3, H-4 y H-2 del anómero
beta, una señal simple para el hidrógeno bencílico y una señal doble de dobles para el
H-2 del anómero alfa. En 5.8 y 6.3 se observan 2 señales dobles que pertenecen a los
hidrógenos anoméricos beta y alfa respectivamente. Finalmente los hidrógenos
aromáticos se observan como una señal múltiple en la región 7.2-7.6 (figura 22).
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 22.- Espectro de 1H RMN del intermediario (2).
El espectro de 13C RMN del intermediario 2 como mezcla anomérica muestra señales en
20 ppm para los grupos metilo de los acetatos, de 64 a 102 ppm se observan señales de
carbono pertenecientes a la glucopiranosa y al dioxano, de 126 a 136 ppm se observan
señales correspondientes al anillo aromático y en 170 ppm señales características del
carbonilo de los acetatos.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 23.- Espectro de 13
C RMN del intermediario (2).
Las fracciones que contenían el producto con menor de Rf fueron analizadas por
espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN), carbono 13, y
difracción de rayos X observando que la corresponde al intermediario esperado de
sacarosa 8.
El espectro de 1H RMN del intermediario 8 se observan señales características en 2 ppm
para 18 hidrógenos de los acetatos, en 3.6-3.8 ppm se observa una señal múltiple
pertenecientes a 2 H para H-3’ y H-4’, en 4.1-4.4 ppm una señal múltiple que corresponde
a H-5,6,1’6’, en 4.8 ppm se observa una señal doble de doble que pertenece a H-2, en 5.3
se observa una señal triple perteneciente a H-4, en 5.4 ppm se observa una señal doble
correspondiente a H-3’, en 5.5 ppm una señal simple que representa al hidrogeno del
bencílico, en 5.6 una señal triple que corresponde a H-3 , en 5.7 se observa una señal
doble que representa a H-1 y finalmente en 7.3-7.4 se observa una señal múltiple
correspondiente a 5 hidrógenos del anillo aromático.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
Soto Ortega Miguel Página 33
El análisis por 1H NMR de (8) en CDCl3, 300 MHz, , p.p.m. muestra: 2.0-2.1 (6S , 18H
acetatos), 3.6-3.8 (m, 2H-4’,5’), 4.1-4.4 (m, 7H-5,6,2’,5’), 4.8 (dd, 1H-2), 5.3 (t, 1-H-4), 5.4
(d, 1H-3’), 5.5 (s, 1H-bencill), 5.6 (t, 1H-3), 5.7 (d, 1H-1), 7.3-7.4 (m, 5H aromáticos).
Figura 24.- Espectro de 1H RMN del intermediario 8.
En el espectro de 13C RMN del intermediario 8 se observan en 20 ppm señales
pertenecientes a los carbonos del metilo de los grupos acetatos entre 60-106 ppm se
observa los carbonos intracíclicos correspondientes a las unidades de glucosa, en 126-
138 se observan los carbonos correspondientes a el anillo aromático y en 170 ppm
señales pertenecientes a los grupos carbonilo.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 25.- Espectro de 13
C RMN del intermediario 8.
Este intermediario fue cristalizado a evaporación lenta y analizado por medio de difracción
de rayos X. Se observan datos relevantes que los anillos de 6 de la glucosa y el grupo
1,3-dioxano se encuentran en forma de silla configuración 4C1, en tanto que el anillo de la
fructosa se encuentra en una configuración tipo sobre. Además se observa que el anillo
aromático se encuentra fuera del plano en ángulo aproximado de 90° (figura 26). Los
valores de longitud y ángulo de enlace, ángulo de torsión e interacciones intermoleculares
fueron determinados y se muestran en forma de tablas. La estructura tridimensional del
intermediario no ha sido reportada previamente por lo que se ha preparado el manuscrito
para su publicación (anexo).
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 26. Configuración estructural de la sacarosa protegía (Intermediario 8)
El análisis de esta molécula se presenta en el anexo.
Al intermediario 2 se le realizo una hidrogenación catalítica utilizando una solución de
AcOEt-MeOH (3:2), como medio disolvente, e hidróxido de paladio en carbón activado
como catalizador. Esta reacción se completo en un tiempo de 24 h, monitoreando que se
llevara a cabo, por medio de cromatografía de capa fina.
Completada la reacción, se observó por medio de la cromatografía de capa fina, la
presencia de un solo producto que carbonizo al someterlo a la solución reveladora de
azúcares. Al comparar este intermediario 3 con el 2 se observo que la reacción se llevo a
cabo satisfactoriamente ya que el desplazamiento de los intermediarios es diferente.
Figura 27
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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A esta reacción se le retiro el catalizador por medio de una percolación con metanol. Que
después se llevo a evaporación lenta en rota vapor, generando el intermediario 3 como un
sólido cristalino.
Figura 27.- Comparación entre los intermediarios 2 y 3
El intermediario 3 fue caracterizado por resonancia magnética nuclear de hidrógeno y
carbono 13,
El espectro de 1H RMN del intermediario 3 como mezcla anómerica muestra señales
simples en 2 ppm correspondientes a los hidrógenos de los grupos acetatos, en de 3.2-
3.9 ppm se observan varias señales múltiples que contienen los hidrógenos H-5, H-6 y H-
6 de la mezcla, en 4.9-5.4 ppm un grupo de señales triples que corresponden a H-3, H-4
y H-2 anómero beta, y una señal doble de dobles para el H-2 del anómero alfa. En 5.7 se
observa la señal correspondiente al Anómero, y en 6.3 ppm la señal correspondiente al
anómero. Se observa que las señales que representaban a los hidrógenos del anillo
aromático desaparecieron, lo que demostró que la desprotección se llevo a cabo
satisfactoriamente.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 28.- Espectro de 1H RMN del intermediario 3.
En el espectro de 13C RMN del intermediario 3 se observan en 20 ppm señales
pertenecientes a los carbonos del metilo de los gropos acetatos entre 50-90 ppm se
observa los carbonos intracíclicos correspondientes a las unidades de glucosa, y en 170
ppm señales pertenecientes a los grupos carbonilo. Se observa que las señales de los
carbonos perteneciente al anillo aromático desaparecen entre la región de 126 a 136 ppm
como resultado de la reacción de desprotección de la glucosa.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 29.-Espectro de 13
C RMN del intermediario 3.
Al intermediario 8 se le realizo una hidrogenación catalítica utilizando una solución de
AcOEt-MeOH (3:2), como medio disolvente, e hidróxido de paladio en carbón activado
como catalizador. Esta reacción se llevo a cabo en transcurso de 24 h, monitoreando que
la reacción se lleve a cabo por medio de cromatografía de capa fina, posteriormente se le
retiro el catalizador por medio de una percolación con metanol. Que después al
evaporarla, dio como resultado el intermediario de sacarosa desprotegido 9, como una
mezcla viscosa. Este intermediario al realizarle una placa mostró la presencia de
impurezas, lo que no permito que éste fuera caracterizado por 1H RMN, ya que el
espectro muestra señales complejas.
Sin embargo el espectro de 1H RMN del intermediario 9, muestra que la desprotección se
llevó a cabo satisfactoriamente, siguiendo la secuencia descrita, al no presentarse las
señales del anillo aromático
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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Figura 30.- Espectro de 1H RMN del intermediario 9.
Al intermediario desprotegido de glucosa 3, se le realizo una reacción para incorporar en
la fracción hidroxilica libre un buen grupo saliente, para esto se le hizo reaccionar con
cloruro de tosilo en piridina, completándose la reacción en 24 h, siendo monitoreada por
cromatografía de capa fina, la cual mostró que se tenían más de un producto, por lo que
posteriormente la mezcla fue purificada por cromatografía en columna empleando
diferentes gradientes de concentración de un mezcla de hexano-acetato de etilo y se
obtuvo una fracción pura correspondientes al intermediario 4 con un valor de Rf de 0.6
(hexano-acetato de etilo 1:1), como un sólido cristalino. El cual fue caracterizado por
medio de 1H RMN.
En este espectro de 1H RMN del intermediario 4 como mezcla anómerica muestra
señales simples en 2 ppm correspondientes a los hidrógenos de los grupos acetatos, en
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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2.4 se observa una señal simple correspondiente al metilo de grupo tosilo en 3.2 -5.4
ppm se observan varias señales múltiples que contienen los hidrógenos de la unidad de
glucosa, en 5.4-6.2 se observa las señales de los hidrógenos anómericos y finalmente en
7.2 y 7.8 se observan una señal doble correspondiente al grupo tosilo.
Figura 31.-Espectro de 1H RMN del intermediario 4.
En el espectro de 13C RMN del intermediario 4 se observan en 20 ppm señales
pertenecientes a los carbonos de los grupos acetatos, entre 64-92 ppm se observa los
carbonos intracíclicos correspondientes a las unidades de glucosa, en 128-136 se
observa la presencia de carbonos aromáticos correspondientes a el anillo aromático del
grupo tosilo, y en 170 ppm señales pertenecientes a los grupos carbonilo.
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Figura 32.- Espectro de 13
C RMN del intermediario 4
El intermediario 4 se hizo reaccionar, adicionándole 0.1 g de NaN3 en 2 ml de DMF, para
realizar la sustitución del tosilo por el grupo azida, esta reacción se llevo en condiciones
de baño de agua a 60-70 °C durante 6 hrs. El monitoreo mediante cromatografía de placa
fina mostro la presencia de varios productos, en la mezcla de de reacción, lo que llevo a
realizar una purificación por cromatografía en columna empleando diferentes gradientes
de concentración de un mezcla de hexano-acetato de etilo, obteniéndose el intermediario
6 el cual no se caracterizo debido a que presentaba demasiadas impurezas.
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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9.- CONCLUSIONES
Se obtuvieron los intermediarios (2), (3), (8) y (9) que son precursores para la
obtención de un iminoazúcar.
Uno de los pasos críticos en la obtención de los intermediarios se da en el proceso
de purificación, ya que tenerlos completamente puros permite que la
caracterización completa.
Los intermediarios obtenidos fueron caracterizados por 1H RMN, 13C RMN y el
intermediario 8 por difracción de rayos X.
Se obtiene avances significativos en la obtención de los intermediarios a partir de
la secuencia de síntesis descrita en el esquema 3.
10.- RECOMENDACIONES PARA UN TRABAJO FUTURO
Se recomienda buscar condiciones neutras que eviten la hidrólisis de la sacarosa.
Utilizar como alternativa del cloruro de tosilo, anhídrido tríflico.
Escala la reacciones para obtener mayor cantidad de intermediarios
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11.-CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Tabla.2.-Cronograma de actividades
12.- BIBLIOGRAFIA
1.- C.A., Aguilar-Salinas, O., Velázquez Monroy, F. J. Gómez-Pérez, A., González Chávez, A., Lara Esqueda, V., Molina Cuevas, J.A., Rull-Rodrigo, R. Tapia Conyer, Diabetes Care 2003, 26:2021.
2.- R., Rai, I., McAlexander, C.-W. T., Chang Org. Prep. Proced. Int., 2005, 37, 339.
3.- F.J. Alarcón-Aguilar, F. Calzada-Bermejo, E. Hernández-Galicia, C. Ruiz-Angeles, R. Roman-Ramos, J. Ethnopharmacology 2005, 97, 447.
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4.- (a) Y. Blériot, D. Gretzke, T. M. Krülle, T. D. Butters, R. A. Dwek, R. J. Nash, Naoki Asano and G. W.J. Fleet Carbohydrate Research 2005, 340, 2713. (b) J. P. Saludes, S. C. Lievens, and T. F. Molinski Journal of Natural Products 2007, 70, 436. (c) A. Kato, N. Kato, I. Adachi, J. Hollinshead, G. W. J. Fleet, C. Kuriyama, K. Ikeda, N. Asano, and R. J. Nash Journal of Natural Products 2007, 70, 993.
5.- (a) G. S., Jacob Current Opinión in Structural Biology 1995, 5, 605. (b) Y., Kobayashi, M., Shiozaki, J. Org. Chem. 1995, 60, 2570.
6..- M. Brito-Arias, Synthesis and Characterization of Glycosides ed Springer, 2007, 27.
7.- Y. Ichikawa, Y-C-Lin, D.P. Dumas, G-J. Shen, E. García-Junceda, M.A. Williams, R. Bayer, C. Ketcham, L.E. Walker, J.C. Paulson, C..-H. Wong, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9283.
8.- C.-H., Wong, R.L., Halcomb, Y. Ichikara, T., Kajimoto Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 521.
9.- E. García-Urdiales, I. Alonso, V. Gotor, Chem Rev. 2005, 105, 313.
10.- (a) Y., Ichikawa, Y., Igarashi, M., Ichikawa, Y., Suhara J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3007. (b) A. Roy, B. Achari, S. B. Mandal, Synthesis 2006, 6, 1035.
11.- (a) H.J.M. Gijsen, L. Qiao, W. Fitz, C.-H. Wong, Chem. Rev. 1996, 96, 443. (b) G.C., Look., C.H., Fotsch, C.-H:, Wong, Acc. Chem. Res. 1993, 26, 182.
12.- R.R., Hung, J.A. Straub, G.M. Whitesides J. Org. Chem. 1991, 56, 3849.
13.- L.T. Kanerva, E., Vantinnen Tetrahedron Asymmetry 1993, 4, 85.
14.- C.-H. Wong Pure & Appl. Chem. 1995, 67, 1609
15.- (a) P.J., Garegg, L, Olsson, S., Oscarson, J. Org. Chem. 1995, 60, 2200. (b) J. Robyt Carbohydrates ed. Springer 1996.
Paginas electrónicas
16. - www.diabetes.org
17.-http://enfermeriadiabetes.blogspot.com/2008/01/causas-de-la-diabetes.html
18.- www.fda.com
19.-http://www.grupovisual.com.mx/cuidatuazucar/Profesionales/Prof11.
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12.-Anexo
4,6-di-O-benzylidene-1’,2,3,3’,4’,6’-hexaacetylsucrose
Marco Brito-Ariasa, Miguel Soto-Ortegaa, Hugo Jiménez-Vázquezb
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional
Avenida Acueducto s/n Barrio la Laguna Ticomán, 07340, México DF, México.
Escuela Nacional de Ciencias Biológica, Instituto Politécnico Nacional
Av Prolongación de Carpio y Plan de Ayala Colonia Santo Tomás México DF, México.
The synthesis and X-ray diffraction analysis of compound (8), C31 H38 O17 is described.
The 1,3-dioxane and pyranoside rings shows 4C1 chair conformations and for the D-
fructofuranoside moiety and envelop 3E conformation is observed. The phenyl group is
oriented perpendicular to de 1,3-dioxane chair and the acetate groups equatorial for the
pyranoside ring and axial for the furanoside. Compound (8) crystallizes in the orthorhombic
system with P21 21 21 space group and cell parameters of a = 8.2018(2) Å b = 18.6416(3)
Å , c = 22.0994(5) Å.
Comment
Sucrose is an abundant and low cost sugar mainly used as natural edulcorant (Robyt,
1998), and when sustituted by chorine at certain positions as the artificial edulcorant
sucralose (Fairclough, 1975). Despite this important usefullness sucrose has not been
exploited suficiently as synton for preparing modified derivatives containing isosteric
substituents which could eventually lead us to pharmaceutical active substances (El
Ashry& El Nemr 2005; Furneaux, 1993). As a part of an strategy directed toward the
preparation of modified sucrose derivatives we have prepared the protected sucrose
derivative (I) which contains a benzylidene group at the 4 and 6 postion of the
glucopyranoside moiety and fully acetylated at the remaining hydroxylic positions. This
intermediate will allow us to functionalize the hydroxylic position at the pyranoside ring
after deprotection of the benzylidene protecting group under mild conditions.
The title compound (8) (Fig.1), shows two 4C1 chair conformations belonging to the 1,3-
dioxane and the pyranoside rings with puckerings parameters Q = 0.5735 Å, = 7.90o,
=303.55o and Q = 0.5807 Å, =1.54o, = 40.45o, being both values in agreement with a
“Síntesis y caracterización estructural de iminoazúcares de potencial actividad hipoglucemiante”
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chair conformation. Also the angle disposition for the endocyclic bond C1-O5-C5 of 111.9o
is in agreement with 4C1 conformations having the substituents positionated at equatorial
positions. The phenyl group is oriented almost perpendicular to the 1,3-dioxane and the
acetate groups attached to the pyranoside ring at equatorial positions. The -anomeric
bond C1-O1 value 1.41.4 (3) Å is more elongated than the reference value of 1.385 (4)
Å for O-glycosidic bond (Jeffrey, 1990, Brito-Arias, 2007). For the furanoside ring the
torsion angle values are 2.0o for C15-C14-O11-C17 revealing these elements on the plane
and -28.7o for C14-C15-C16-C17 indicating an envelop exo E for C16 in agreement with a
synperiplanar conformation (Evans, 1989). The analysis of potential hydrogen bonds
shows diferent intramolecular contacts C--H..O which are summarized in table 1 (Spek,
2002).
Table 1. Hydrogen Binding Geometry for ( 8 ).
D - H...A D – H H...A D...A D - H...A
Intra C(1)--H(1)..O(10) 0.98 2.49 3.1045 120
C(1)--H(1)..O(15) 0.98 2.56 3.3926 143
Intra C(2)--H(2)..O(12) 0.98 2.32 2.7057 102
Intra C(3)--H(3)..O(13) 0.98 2.38 2.7238 100
Intra C(5)--H(5)..O(1) 0.98 2.43 2.7976 102
Intra C(15)--H(15)..O(17) 0.98 2.49 3.3044 141
Intra C(19) --H(19A) ..O(17) 0.97 2.28 2.6825 104
C(25) --H(25A) ..O(12) 0.96 2.54 3.3392 140
C(29) --H(29C) ..O(12) 0.96 2.56 3.4091 147
C(31) --H(31C) ..O(14) 0.96 2.56 3.5056 168
-------------------------------
Symetry codes = 1+x,y,z
= 2-x,-1/2+y,1/2-z
= -1+x,y,z
= 1/2+x,1/2-y,1-z
O
OO
OO
OAc
OAc
OAcAcO
OAc
AcO
Fig 1.-Compound (8)
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Experimental
Compound (8) was prepared by following a two steps sequence starting from sucrose
which was treated with benzaldehyde dimetylacetal in dimethylformamide and then
peracetylation under acetic anhydride-pyridine conditions to provide after purification by
column chromatography compound (8 white crystalline solid. Spectroscopic 1H NMR
analysis for (8) in CDCl3, 300 MHz, , p.p.m. shows: 2.0-2.1 (6S , 18H acetates), 3.6-3.8
(m, 2H-16,17), 4.1-4.4 (m, 7H-5,6,18,19), 4.8 (dd, 1H-2), 5.3 (t, 1-H-4), 5.4 (d, 1H-15), 5.5
(s, 1H-benzyl), 5.6 (t, 1H-3), 5.7 (d, 1H-1), 7.3-7.4 (m, 5H aromatics).
Compund (8) Table 2.
Crystal data
Empirical formula C31 H38 O17
Formula weight 682.61
Temperature 293(2) K
Wavelength 0.71073 Å
Crystal system Orthorhombic
Space group P 21 21 21
Unit cell dimensions a = 8.2018(2) Å = 90°.
b = 18.6416(3) Å = 90°.
c = 22.0994(5) Å = 90°.
Volume 3378.88(12) Å3
Z 4
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Density (calculated) 1.342 Mg/m3
Absorption coefficient 0.110 mm-1
F(000) 1440
Crystal size 0.39 x 0.28 x 0.18 mm3
Theta range for data collection 2.37 to 32.48°.
Index ranges -11<=h<=12, -27<=k<=20, -24<=l<=31
Reflections collected 16634
Independent reflections 6014 [R(int) = 0.0267]
Completeness to theta = 27.50° 98.3 %
Absorption correction Semi-empirical from equivalents
Max. and min. transmission 0.980 and 0.956
Refinement method Full-matrix least-squares on F2
Data / restraints / parameters 6014 / 0 / 439
Goodness-of-fit on F2 1.023
Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0562, wR2 = 0.1229
R indices (all data) R1 = 0.0855, wR2 = 0.1337
Absolute structure parameter -10(10)
Largest diff. peak and hole 0.262 and -0.221 e.Å-3
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Thermal ellipsoids drawn at 30% probability.
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The absolute configuration of the structure was not determined by the X-ray analysis but
was already known from the configuration of the starting material. H atoms were placed in
calculated positions, with distance C-H distances in the range of 0.96-0.98 Å.
Data collection: Program used to solve structure SHELXS97 (Sheldrick, 1997), molecular
graphics ORTEP-3 for Windows (Farrugia, 1997, 1999).
MBA is grateful with COFAA and SIP IPN for finantial support and with Efren Garcia-Baez
for the critical reading.
References
Brito-Arias, M., Cruz-Salazar, D., Molins, E., Acta Cryst. (2007), E63, o359-o360.
El Ashry, E.S.H., El Nemr, A. Nitrogen Heterocycles(2005), Ed Blackwell, 139.
Evans, G.G., and Boeyens, J.A. Acta Cryst. (1989), B45, 581-590.
Fairclough, P.H., Hough, L.& Richardson, A.C. (1995). Carbohydr. Res, 40, 285-298.
Farrugia, L.J (1997). J. Appl. Cryst. 30, 565.
Farrugia, L.J (1999). J. Appl. Cryst. 32, 837-838.
Furneaux, R.H., Tyler, P.C., Whitehouse, L.A. (1993). Tetrahedron Lett. 34, 3613
Robyt J.R., Essentials of Carbohydrate Chemistry(1998), Ed. Springer , 21.
Sheldrick, G.M. (1997). SHELXS97. University of Göttingen, Germany.
Spek, A.L. (2003). J. Appl. Cryst. 36, 7-13.