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TÉCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
TÉCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
Lina María López de Ávila, MSc.Docente Escuela de Microbiología
Universidad de Antioquia
METODOLOGÍAS MODERNAS
Rápidos Inmunológicos
Moleculares Biosensores
Métodos rápidos
Cualquier método para la detección, recuento, caracterización y
subtipificación de microorganismos mediante el cual se obtienen
resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los
métodos convencionales.
Rapidez
Exactitud
Bajo costo
Facilidad de uso
Aceptabilidad
Medios cromogénicos y fluorogénicos
Métodos de cultivo modificados
Basados en bioquímica
Medios de cultivo cromogénicos o fluorogénicos
Enumeración de coliformes fecales y E. coli
Enumeración de microorganismos patógenos: Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus
Sustrato: carbohidrato, aminoácido, fosfato
Cromógeno o fluorogéno: derivados de indolil o sustratos 4-metilumbeliferil
Cromógeno / fluorogéno Nombre comercial Color /fluorescencia
5-Bromo-4-cloro-3-indoxil X Azul turquesa a verde menta
5-bromo-3-indoxil Lapis™ Azul
5-bromo-6-cloro-indoxil Magenta™ Morado a magenta
6-cloro-3-indoxil Salmon™ Rosa a salmón
N-metilindoxil Green™ Verde
2-Nitrofenil ONP Amarillo
4-metilumbeliferil MU Azul (UV 365 nm)
ELF® ELF® Bajo luz UV verde (377 nm)
Sustrato Microorganismo Cromogénico Fluorogénico
β-D-glucuronido E. coli si Si
β-D-galacto-piranosido Enterobacterias, coliformes Si No
β-D-glucopiranosido Klebsiella spp, enterobacter spp. Si No
N-acetil-β-D-glucosamida Candida albicans Si Si
Myo-inositol-1-fosfato B. cereus, Listeria sp. Si Si
Fosfato S. aureus Si Si
E. Coli /Coliformes E. Coli O157:H7 Salmonella spp. S. aureus L. monocytogenes
Grupo Bacillus cereus
Chromocult BCM E. coli O157:H7 Rambach agar CHROMagar S.
aureusBBL CHROMagar
Listeria BCM
RAPID´E. coli 2Flourocult E. coli O157:H7
AgarSM ID medium S. aureus ID Agar Rapid´L. mono R&F Bacillus
anthracis agar
CHROMagar E. coli O157:H7 ID-Medium CHROMagar SMS Agar ALOA
EMX-Agar Rainbow agar O157
BBL CHROMagar Salmonella
LIMONO-Ident-Agar
TBX agar
Coli ID medium
E. coli O157:H7
No fermentación de sorbitol
No posee β-D-glucuronidasa
S. aureus
Reducción de telurito
Proteolisis albúmina
L. monocytogenes
Detección de fosfolipasa C
No fermentación de xilosa
Salmonella spp.
Detección de Caprilato esterasa y β-glucosidasa
Métodos de cultivo modificados
Indicadores de calidad
Patógenos
Número mas probable
Simplate®Tecnología de detección binaria, múltiples enzimas.Requiere menos microorganismos para generar cambios de color.
Métodos de cultivo modificados
Tempo®
Métodos bioquímicos
ImpedanciaResistencia al paso de una corriente alterna a través de un material conductor.El metabolismo microbiano cambia este parámetro eléctrico.El tiempo de detección es inversamente proporcional al numero de bacterias en la muestra.
Recuento de viables
Pruebas de esterilidad
Detección y cuantificación de
indicadores
Screening de patógenos
Monitoreo ambiental
Screening de compuestos
antimicrobianos
Bioluminiscencia
ATP indicador de viabilidad celular
Inmunoensayos
Permiten la detección de: Células intactas, toxinas, productos
metabólicos.
No permiten la diferenciación de células vivas y muertas.
Condiciones de stress generan expresiones aberrantes de antígenos.
Anticuerpos policlonales
Anticuerpos monoclonales
Resultados presuntivos
Separación inmunomagnética
Partículas magnéticas cubiertas con Ac1. La suspensión del alimento se mezcla con las
partículas magnéticas 30-60 min2. El complejo magnético es puesto en un
separador magnético.3. El complejo magnético es lavado varias veces con
un buffer para eliminar contaminantes4. Las células son eluidas para posteriores análisis.
Inmunoensayos
Sistemas de flujo lateral - inmunocromatografíaEnsayo tipo “sandwich” en una membrana porosa (nitrocelulosa)
Anticuerpo de captura
Anticuerpo de detección
Singlepath®
DuPont™ Lateral Flow System
RapidChek® SELECT
Ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA)
Peroxidasa – Peróxido de hidrogeno(Fenilendiamina)
Fosfatasa alcalina – P-nitrofenilfosfato
β-Galactosidasa – O-nitrofenil-B-D-galactopiranósido
Indirecta
Sandwich
Inhibición competitiva
LOCATE® Biopharm
3M Tecra™
RIDASCREEN® Campylobacter
Métodos basados en bacteriófagos
Especificidad de los bacteriófagos
IMS con proteínas recombinantes
FENOTIPO
Genes
Condiciones ambientales
Cepas particulares
Condiciones cultivo
Aplicación Ventajas Problemas
Detección directa de patógenos
No requiere cultivo Puede detectar células muertas.Inhibición por componentes del alimento.Sensible a contaminaciones en el laboratorio
Confirmación a partir de pre-enriquecimiento
Rápido y sensiblePosible automatizaciónNo se afecta por la microbiota acompañante
Caracterización de patógenos
Identifica cepas virulentas y no virulentasCaracterización múltiple
Otras aplicaciones Identificación de organismos genéticamente modificados
MÉTODOS MOLECULARES
Aspectos importantes…
1. Preparación de la muestra
Componentes del alimentos pueden afectar la sensibilidad del método.
Calcio, grasas, glicogeno, compuestos fenólicos, enzimas.
Falla en la lisis celular
Captura y degradación de ácidos nucleicos
Inhibición de la polimerasa
Eliminación de inhibidores
Filtración
Adecuada extracción de ADN
Separación inmuno magnética (IMS)
Pre-enriquecimiento de la muestra
2. Blanco molecular
Presente en la célula en alto numero de copias.Suficientemente heterólogo.
Genes RNA ribosomal (rRNA)
Genes de virulencia
Genes codificantes de toxinas
Genes involucrados en el metabolismo celular
Aspectos importantes…
3. Tipo de metodologías
Basadas en PCR
Amplificación isotérmica
Basadas en hibridación
Electroforesis en campo pulsado
Ribotyping
Microarreglos
Aspectos importantes…
Metodologías basadas en PCR
PCR tradicional
Amplificación de una secuencia blanco y visualización por electroforesis en gel de
agarosa.
Cuantificación de punto final
Posibilidad de contaminación
PCR múltiple
PCR anidada
Metodologías basadas en PCR
PCR en tiempo real
Fragmento amplificado
Sistema de detección
Cuantificación absoluta vs.
Cuantificación relativa
Metodologías basadas en PCR
Agentes fluorescentes
No específicosNo reconocen secuencias especificasUnion al ADN - Intercalantes
- Unión al surco menorLa fluorescencia aumenta con la cantidad de producto amplificado
Dímeros de primers
Curva de melting (Tm)
Curva de meltingEvaluación rango de temperaturas (60-90°C)La fluorescencia disminuye gradualmente hasta que desaparece totalmente
Agentes fluorescentes
EspecíficosSondas especificas marcadas con fluoroforos
Taqman
Molecular beacons
Scorpions
Sondas TaqMan
Sondas de hidrólisis
Actividad exonucleasa 5´de Taq polimerasa
Reportero – Quencher
TaqMan = PacMan
Molecular beacons
Sondas de hibridación en horquilla
Bucle: 18-30 pb complementario a la
secuencia blanco
Tallo: 5-7 nt complementarios entre si
5´fluoroforo
3´qencher
Primers Scorpions
Primer unido covalentemente a una sonda
Equipos
PCR en tiempo real
Sistemas comerciales
Kit Formato Bacterias Casa comercial
BAX® Convencional Salmonella, E. coli 0157:H7, L. monocytogenes, Campylobacter Qualicon
LightCycler® Foodproof Tiempo real Listeria, Salmonella, E. coli Roche
Mericon Tiempo real L. monocytogenes, Campylobacter, Salmonella QIAGEN
TaqMan® Tiempo real Campylobacter, E. coli, L. monocytogenes Applied BioSystems
IQ-Check™ BioRad
R.A.P.I.D® LT Tiempo real L. monocytogenes, Salmonella, E. coli Idahotech
RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente)
Primers arbitrarios (10 pb) de baja astringencia
Patrón de bandeo único para cada cepa
AFLP (Polimorfismos en longitud de los fragmentos amplificados)
Metodologías basadas en PCRGenotipificación
Metodologías basadas en hibridación
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
Identificación de rRNA con sondas marcadas con fluorocromos
Detección por epifluorescencia
Limite de detección 104 UFC/ml
Ribotyping
Reconocimiento de genes ribosomales Procariotas: 5S, 16S y 23S rRNA RFLPs de genes rRNA
1. Purificación y digestión de DNA genómico2. Electroforesis en gel de agarosa3. Southern blot
Micro arreglos
Colección de moléculas biológicas sobre soporte solido.
BIOSENSORES
Dispositivos analíticos que combinan sistemas de reconocimiento biológico con
señalización física o electroquímica.
Alta sensibilidad, selectividad y reproducibilidad
Fácil manejo, bajo costo
Corto tiempo de análisis
Resultados en tiempo real
Fácil automatización
Biosensores
Bioreceptor(Reconocimiento)
TejidosMicroorganismos
OrganelasCélulasEnzimas
AnticuerposÁcidos nucleicos
Transductor(Señal medible)
ÓpticoElectroquímicoTermométricoPiezoeléctrico
Micro mecánico
CLASIFICACIÓN