Post on 09-Aug-2020
transcript
Transformasi Genetik dan Karakterisasi
Tanaman Produk Rekayasa Genetika
Oleh:
Wahyu Indra Duwi Fanata1,2
1PS Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Jember
2Divisi Biologi Molekul dan Bioteknologi, Center for Development of Advanced Science and Technology
(CDAST) Universitas jember
I. Transformasi Genetik
II. Karakterisasi Tanaman Transgenik
Pokok Bahasan
I. Transformasi Genetik
II. Karakterisasi Tanaman Transgenik
Rekayasa Genetika Pada Tanaman
Syarat terjadinya transformasi genetik
– DNA harus masuk dalam sel
– DNA harus terintegrasi dalam
genom
– DNA harus terekspresi
Masuknya gen asing ke dalam sel:
– Agrobacterium sebagai
perantara
– Transfer gen secara langsung
Transfer Gen dimediasi oleh Agrobacterium
T-DNA
auxA auxB cyt ocsLB RB
• LB, RB: left dan right borders
• auxA, auxB: mengkode enzim yang memproduksi auxin
• Cyt: mengkode enzim yang memproduksi cytokinin
• Ocs: mengkode octopine synthase, memproduksi octopine
✓ Meningkatnya produksi hormon tesebut akan menstimulasi pembelahan sel
✓ Menghasilkan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol
Modifikasi T-DNA
Prosedur Transformasi Genetik
Prosedur Transformasi Genetik
Tran and Sanan-Mishra, Biotechnology Reports, 7:143-149
Transfer Gen Secara dengan Metode “Particle Bombardment”
• Prinsip dasar dari metode ini adalah memasukkan
partikel logam (emas atau tusngten) yang telah
diseliputi oleh T-DNA dengan menembus dinding
sel menuju nukelus.
• Eksplan yang sudah “ditembak” kemudian
ditumbuhkan menjadi tanaman baru melalui teknik
kultur jaringan
• Lebih efisien dan lebih sederhana
• Namun sel rentan rusak dan peralatan yang
digunakan sangat mahal
Konfirmasi Keberadaan transgen dalam genom
Apriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758
I. Transformasi Genetik
II. Karakterisasi Tanaman Transgenik
Pemilihan Tanaman Transgen dengan
Insersi Tunggal T-DNA
• Tanaman dengan dua/lebih insersi mempunyai kemungkinan yang lebih tinggi
untuk terjadi fenomena gene silencing
• Tanaman dengan insersi tunggal mempunyai tingkat ekspresi gen yang lebih
stabil dan seragam
• Pemilihan tanaman transgenik dengan inserti tunggal T-DNA sangat penting
untuk dilaksanakan
• Jumlah insersi umumnya dianalisa dengan menggunakan metode Southern
Blot atau dengan cara menghitung rasio segregasi pada tanaman T1
Southern Blot
• Analisa Southern Blot menggunakan bahan radioaktif (α
32P) untuk tanaman padi non transgenik (WT) dan
transgenik heterosigot (Het) dan homosigot (Ho) untuk
mengetahui jumlah T-DNA yang ada dalam genom.
• Satu pita DNA yang terdeteksi pada masing-masing jenis
tanaman transgenik menunjukkan bahwa masing-masing
padi transgenik mengandung satu T-DNA.
Fanata et. al., The Plant Journal, 73:966-979
Apriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758
Southern Blot (non radiokatif)
Rasio Segregasi
• Tanaman generasi T0 masih mengandung T-DNA di
salah satu kromosom (heterosigot)
• Apabila tanaman T0 menyerbuk sendiri, maka sifat
keturunannya akan bersegregasi menurut hukum
mendel
• Tanaman T0 dengan satu insersi T-DNA dengan sifat
resisten antibiotik akan menghasilkan keturunan (T1)
dengan rasio ketahan 3:1 (resisten : sensitif)
Chi et.al., Plant Physiology, 148: 808-817
Analisa Tingkat Ekspresi Gen dan Translasi Protein
Analisa tingkat ekspresi target gen
umumnya menggunakan teknik PCR
dangan menggunakan cDNA sebagai
template
Analisa tingkat translasi target protein
umumnya menggunakan teknik
western blot menggunakan antibody
spesifik yang hanya berinteraksi
dengan target proteinApriasti et.al., Molecular Biology Reports, 45:2749-2758
Penggunaan Gen Reporter Sebagai
Indikator Ekspresi Gen
Toki et.al., The Plant Journal, 47:969-9768
Gen yang menyandi Green Flurescent Protein (GFP) seringkali digunakan sebagai penanda aktivitas
gen pada tingkatan translasi
Analisa Fenotipa tanaman TransgenikTanaman Trx-m RNAiTanaman Overekspresi gen hrf1
Zhang et.al., Journal of Experimental Botany, 62:4229-42238 Chi et.al., Plant Physiology, 148: 808-817
1. Transformasi genetik dapat menggunakan metode agrobacterium atau
metode partikel bombardment
2. Teknik kultur jaringan yang efisien berperan penting dalam
keberhasilan tarnsformasi genetik
3. Konfirmasi kebenaran tanaman transgenik dilakukan dengan
menggunakan metode PCR dan southern blot
4. Galur tanaman transgenik yang dipilih untuk pengjian lanjutan
sebaiknya mengandung satu insersi T-DNA
Kesimpulan