Andrea Rubio del Busto

María Cecilia Sáenz Barrio y María Trinidad Cedrón Fernández

Facultad de Ciencia y Tecnología

Grado en Química

2015-2016

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Determinación de aceites esenciales microencapsulados(limón y árbol del té) empleados como bioplaguicidas

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016

publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es

Determinación de aceites esenciales microencapsulados (limón y árbol del té) empleados como bioplaguicidas, trabajo fin de grado

de Andrea Rubio del Busto, dirigido por María Cecilia Sáenz Barrio y María Trinidad Cedrón Fernández (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN QUÍMICA

DETERMINACIÓN DE ACEITES ESENCIALES MICROENCAPSULADOS

(LIMÓN Y ÁRBOL DEL TÉ) EMPLEADOS COMO BIOPLAGUICIDAS

ANDREA RUBIO DEL BUSTO

TUTORAS

Mª CECILIA SÁENZ BARRIO Mª TRINIDAD CEDRÓN FERNÁNDEZ

Logroño, junio de 2016

Memoria realizada por Andrea Rubio del Busto como Trabajo Fin de Grado en el

Departamento de Química (Área Química Analítica), bajo la supervisión de las Dras. Mª

Cecilia Sáenz Barrio y Trinidad Cedrón Fernández.

Agradecer al CTIC-CITA (Centro

Tecnológico de la Industria Cárnica de La

Rioja - Centro de Innovación y Tecnología

Alimentaria de La Rioja) su colaboración en

la preparación de las microcápsulas. En

especial, destacar la implicación y ayuda

de Jorge Barriobero.

1

Índice

1. Introducción .......................................................................................................................... 4

1.1. Antecedentes ................................................................................................................... 5

1.2. Bioplaguicidas como alternativa a pesticidas de síntesis ................................................. 6

1.3. Aceites esenciales como bioplaguicidas ........................................................................... 7

1.4. Microencapsulación mediante secado por aspersión ...................................................... 9

1.5. Métodos para la determinación de la composición de aceites esenciales .................... 11

2. Objetivos ............................................................................................................................. 13

3. Materiales e instrumentación ............................................................................................. 15

3.1. Materiales ....................................................................................................................... 16

3.2. Instrumentación ............................................................................................................. 17

3.2.1. Cromatografía de gases-masas (CG-MS) ............................................................. 17

3.2.2. Cromatografía de gases-FID (CG-FID) .................................................................. 17

3.2.3. Spray-Dryer.......................................................................................................... 18

4. Resultados ........................................................................................................................... 19

4.1. Ensayos previos .............................................................................................................. 20

4.1.1. Cromatografía de gases-masas (CG-MS) ............................................................. 20

4.1.2. Cromatografía de gases-FID ................................................................................ 23

4.2. Validación del método analítico ..................................................................................... 29

4.3. Determinación de los compuestos activos en los aceites esenciales ............................ 43

4.4. Eficacia de la microencapsulación y rendimiento del proceso ...................................... 44

4.5. Liberación del compuesto activo.................................................................................... 47

5. Conclusiones........................................................................................................................ 49

RESUMEN

En este trabajo se han estudiado los aceites esenciales de limón y del árbol del té, cuyos principios

activos mayoritarios son limoneno y terpinen-4-ol respectivamente. Ambos tienen un gran

potencial para desarrollar nuevos antimicrobianos y acaricidas.

La identificación de los componentes de los aceites de limón y del árbol del té se lleva a cabo por

CG-MS y para la cuantificación de los principios activos estudiados, se emplea la cromatografía de

gases con detector de ionización de llama (CG-FID). Se ha validado el método, para ello se han

calculado las características analíticas tales como la sensibilidad, la linealidad, los límites de

cuantificación y detección y la precisión.

Como los aceites esenciales son muy volátiles, con el objetivo de impedir su pérdida o protegerlos

de la reacción con otros compuestos, son introducidos en una matriz o sistema polimérico

formando microcápsulas, de donde se liberan de forma gradual. Tanto la cuantificación de

principio activo que se encuentra en el interior, como el cálculo del rendimiento y la eficacia del

proceso de microencapsulado, se lleva a cabo por cromatografía de gases-FID.

Para conocer la velocidad a la que se liberan dichos compuestos, se ha realizado un estudio a lo

largo del tiempo empleando el mismo método cromatográfico.

ABSTRACT

In this work we have studied the essential oils of lemon and tea tree, whose majority active

principles are limonene and terpinen-4-ol respectively. Both have great potential to develop new

antibiotics and miticides.

The identification of the components of the oils of lemons and tea tree is performed by GC-MS

and for quantification of the active principles studied, gas chromatography with flame ionization

detector is used (GC-FID). The method has been validated, for this purpose have been calculated

analytical characteristics such as sensitivity, linearity, limits of detection and quantificacion and

accuracy.

As essential oils are highly volatile, in order to prevent loss or protect them from reaction with

other compounds, they are introduced in a polymer matrix or system forming microcapsules,

from which are released gradually. Both quantitation of active principle found inside, as the

calculation of performance and efficiency of the microencapsulation process, is carried out by FID

gas chromatography.

In order to know the speed at which these compounds are released, a study was done over time

using the same chromatographic method.

1. INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN 5

1.1. ANTECEDENTES

Plaguicida es cualquier sustancia química o mezcla de sustancias destinada a prevenir, destruir,

atraer, repeler o combatir cualquier plaga, incluidas las especies indeseadas de plantas o

animales, durante la producción, almacenamiento, transporte, distribución y elaboración de

alimentos o productos agrícolas 1.

Las plagas son organismos vivos no deseados o peligrosos para los humanos y su alrededor ya

que compiten con éstos para conseguir alimento, destruyen la propiedad y propagan

enfermedades. Además pueden tener un impacto económico negativo.

Todos los plaguicidas poseen un alto grado de toxicidad para algunos organismos vivos, de

otro modo no tendrían uso práctico. Sin embargo en ocasiones dañan a seres humanos y otros

organismos vivos, pues el blanco al que están dirigidos puede poseer sistemas fisiológicos o

bioquímicos similares a los organismos que no se desea atacar 2. De este modo se destruyen

hábitats, se reduce la biodiversidad y quedan amenazadas especies en peligro de extinción3. Es

decir, su uso no sólo entraña beneficios sino que también conlleva diversos riesgos para el

medio ambiente, así como para la salud, tanto de los trabajadores expuestos como de la

población en general.

La lucha contra las plagas es uno de los métodos más importantes para aumentar la

productividad de las explotaciones agrícolas, ya que las pérdidas causadas por éstas son muy

elevadas. El empleo de plaguicidas, relativamente económicos y altamente efectivos, para

alcanzar este objetivo fue considerado una revolución en la agricultura. En cambio, el uso de

estos agentes químicos presenta varios inconvenientes. Los insectos y otros parásitos se

vuelven resistentes a los plaguicidas lo que hace necesario utilizar dosis mayores o productos

más efectivos.

Por todo ello se recomienda limitar el uso de plaguicidas y buscar nuevas soluciones menos

peligrosas. Hay alternativas al uso de plaguicidas de síntesis que incluyen métodos de cultivo

usando controles biológicos, como feromonas y plaguicidas microbianos. Mientras que otras

opciones suponen el empleo de plaguicidas biológicos o la liberación de organismos para

combatir las plagas3, como ocurre con las larvas de la mosca Aphidoletes aphidimyza

(Cecidomyiidae) utilizadas para el control de pulgones4.

1 Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, ed.. «DEFINICIONES PARA LOS

FINES DEL CODEX ALIMENTARIUS». 1986 2 Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias

Tóxicas 2004 (CICOPLAFEST). 3 Miller GT, Sustaining the Earth, 6th edition. Thompson Learning, Inc. Pacific Grove, California. Chapter

9. 2004 4 www.agroes.es/agricultura

INTRODUCCIÓN 6

1.2. BIOPLAGUICIDAS COMO ALTERNATIVA A PESTICIDAS DE

SÍNTESIS

La reducción de residuos de plaguicidas en alimentos, la salud y la seguridad humana, el poder

controlar la resistencia de las plagas y la responsabilidad ambiental, han llevado a los

agricultores y productores a considerar a los bioplaguicidas como alternativas a los plaguicidas

químicos.

Los bioplaguicidas son productos de protección de cultivos derivados de fuentes naturales que

se utilizan para el control de plagas, patógenos y malas hierbas. Se agrupan en dos categorías

principales: microbianos y bioquímicos.

Microbianos: utilizan organismos vivos tales como bacterias, hongos, virus, protozoos

y levaduras.

Bioquímicos: utilizan compuestos bioactivos de origen natural que presentan

mecanismos de actuación no tóxicos. Incluyen extractos de plantas,

semiquímicos/feromonas (compuestos orgánicos que los organismos utilizan para

transmitir mensajes químicos) y ácidos orgánicos.

En la Tabla 1 se presentan algunas de las principales características de los bioplaguicidas frente

a las de los pesticidas convencionales.

Tabla 1. Características de los bioplaguicidas y pesticidas de síntesis.

BIOPLAGUICIDAS PESTICIDAS CONVENCIONALES

Menos tóxicos y nocivos que los pesticidas convencionales

Elevados costes sanitarios y ambientales

Muy específicos para la plaga objetivo. Eficacia moderada

Eficaces en el control de plagas (pero no específicos). Acción rápida

Eficaces en pequeñas cantidades

Se descomponen rápidamente, a menudo son biodegradables (evitan problemas de contaminación)

Larga actividad residual, lo que conlleva una elevada contaminación.

Menos propensos a problemas de resistencia

Con el paso del tiempo las plagas han desarrollado resistencia contra ellos

Sin embargo, no todo son aspectos beneficiosos y útiles. Debido a su elevada especificidad, los

agricultores necesitarán diferentes bioplaguicidas para combatir distintos tipos de plagas y

agentes patógenos (cuando con el empleo de un único pesticida podían combatirse varias

INTRODUCCIÓN 7

plagas). Además, es posible que no haya productos biológicos disponibles para un tipo de

plaga determinado y el uso de un agroquímico sintético sea la única opción para eliminarla.

Otro de los inconvenientes está relacionado con el mantenimiento de la viabilidad microbiana

durante el almacenamiento y la compatibilidad con los pesticidas químicos. Es por ello,

principalmente, por lo que los bioplaguicidas aún no han reemplazado a los pesticidas

convencionales. No obstante, los avances en la formulación de almacenamiento están

extendiendo la vida útil de estos productos y aumentando su compatibilidad.

1.3. ACEITES ESENCIALES COMO BIOPLAGUICIDAS

Los aceites esenciales destacan como productos de múltiples posibilidades de aplicación en la

agricultura.

Un aceite esencial (AE) es una mezcla de varias sustancias químicas biosintetizadas por las

plantas que dan el aroma característico a algunas flores, árboles, frutos, hierbas, especias,

semillas y ciertos extractos de origen animal. Se trata de productos químicos aromáticos, no

grasos, volátiles (se evaporan rápidamente) y poco densos.

Están compuestos, generalmente, por mezclas complejas de monoterpenos y fenoles. Por

ejemplo, el 1,8-cineol es el principal constituyente del aceite de romero (Rormarinus officinalis

Lin.), el eugenol es el componente mayoritario del aceite de clavo (Syzygium aromaticum Merr.

& Perry) y el timol, el del aceite de tomillo (Thymus vulgaris Lin.)5. En el caso del aceite de

limón (Citrus lemon), el principio activo mayoritario es el limoneno. Mientras que en el aceite

esencial del árbol del té (Melaleuca alternifolia), es el terpinen-4-ol el componente principal.

Algunos de los terpenoides purificados de los aceites esenciales son moderadamente tóxicos

para los mamíferos pero, con muy pocas excepciones, los aceites por sí solos o los productos

basados en los aceites no son tóxicos para los mamíferos, aves y peces 6,7.

Ensayos de toxicidad en los que se emplearon como modelos truchas arco iris jóvenes

mostraron que el eugenol es aproximadamente mil quinientas veces menos tóxico que otros

insecticidas botánicos y quince mil veces menos tóxico que un insecticida organofosforado9.

Otra característica que ha popularizado el empleo de estos compuestos es que no son

persistentes en agua y suelos, y presentan rangos de vida media que oscilan entre las treinta y

cuarenta horas, con una degradación completa a las cincuenta horas8.

5 Isman, M. B.: «Pesticides Based on Plant Essential Oils», Pestic. Outlook 10, Inglaterra, 1999

6 Isman, M. B.: «Plant Essential Oils for Pest and Disease Management» Crop. Prot. 19, 2000

7 Stroh, J.; M. T. Wan; M. B. Isman; D. J. Moul: «Evaluation of the Acute Toxicity to Juvenile Pacific Coho

Salmon y Rainbow Trout of Some Plant Essential Oils, a Formulated Product and the Carrier», Bull. Environ. Contam. Toxicol. 60, EE. UU., 1998 8 Misra, G.; S. G. Pavlostathis: «Biodegradation Kinetics of Monoterpenes in Liquid and Soil-Slurry

Systems», Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, Alemania, 1997

INTRODUCCIÓN 8

Debido a su volatilidad, los aceites esenciales presentan una persistencia limitada en

condiciones de campo9. Sin embargo, en el mercado se encuentran, en estos momentos, un

gran número de productos para uso agrícola (insecticidas, fungicidas, herbicidas) basados en

aceites esenciales10 de los que se citarán algunos ejemplos a continuación.

El aceite esencial de Melaleuca quinquenervia, especie de la familia Myrtaceae, posee

actividad antimicrobiana y acaricida para el control de plagas en hortalizas, cítricos y caña de

azúcar. Puede decirse que el aceite esencial extraído de esta planta tiene actividad

antihelmíntica, antimicrobiana, antifúngica, antiviral y se utiliza como repelente de insectos11, 12, 13. Además, las hojas de Melaleuca pueden ser útiles para el tratamiento de la presión

arterial alta, el herpes simplex y pueden tener efectos hipoglucémicos y disminuir los niveles

de azúcar en sangre.

Los aceites extraídos de frutos cítricos tales como el aceite de naranja (Citrus sinensis) y el

aceite de limón (Citrus lemon), han mostrado actividades antimicrobianas contra

microorganismos patógenos (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa y Salmonella entérica)14.

Camarrillo15 ha encontrado que el carvacrol y el timol, presentes en especies como el orégano

y el tomillo, presentan actividad microbiana en ciertos microorganismos de interés en

alimentos. Y en el caso del aceite esencial de canela, se ha demostrado, en pruebas in vivo,

que controla el desarrollo de hongos endógenos del trigo. Otros autores16, encontraron que el

aceite esencial del árbol del té (Melaleuca alternifolia), presenta actividad antimicrobiana

frente a Staphylococcus aureus.

Aquellos aceites esenciales que poseen una gran actividad antimicrobiana contienen un

elevado porcentaje de compuestos de naturaleza fenólica como carvacrol (componente

mayoritario del orégano), timol (tomillo) o eugenol (clavo) (Tabla 2).

9 Quarles, W.: «EPA Exempts Least-Toxic Pesticides», IPM Pract.: the Newsletter of Integrated Pest

Management 18 (9) EE. UU., 1996 10

Isman, M. B.: «Botanical Insecticides, Deterrents and Repellents in Modern Agriculture and an Increasingly Regulated World», Annu. Rev. Entomol. 51, EE. UU. 2006 11

Anthony JA, Fyfe L, Smith H. Plant active components- a resource for antiparasitic agents? Trends Parasitol.21, 2005 12

Farag RS, Shalaby AS, El-Baroty GA, Ibrahim NA, Ali MA, Hassan EM. Chemical and biological evaluation of the essential oils of different Melaleuca species. Phytother Res; 18. 2004 13

Amer A, Mehlhorn H. Repellency effect of forty-one essential oils against Aedes, Anopheles, and Culexmosquitoes. Parasitol Res; 99. 2006 14

Espina, L., Somolinos, M., Lorán, S., Conchello, P., García, D. y Pagán, R. Chemical composition of comercial citrus fruit essential oils and evaluation of their antimicrobial activity acting alone or in combined processes. Food Control; 22. 2011 15

Camarillo, E. Actividad antifúngica de aceites esenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum BLume) y Orégano (Origanum vulgare L.) y su efecto sobre la producción de aflatoxinas en nuez pecanera. Revista Mexicana de Fitopatología. 1(24). 2006 16

Carson, C.F.; Mee, B.J.; Riley T.V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob Agents Chemother; 46. 2002

INTRODUCCIÓN 9

Tabla 2. Componentes de aceites esenciales que poseen propiedades antimicrobianas.

NOMBRE COMÚN DE LA PLANTA

NOMBRE CIENTÍFICO DE LA PLANTA

COMPONENTE % MÁXIMO EN

EL AE

Cilantro Coriandrum sativum Linalol

E-2-decenal 26 % 20 %

Canela Cinnamomum zatlandicum

Trans-cinamaldehído 65 %

Orégano Origanum vulgare

Carvacrol Timol

Terpineno P-Cimeno

80 % 64 %

2-52 % 52 %

Romero Rosmarinus officinalis

-Pineno Acetato de bornilo

Alcanfor 1,8 Cineol

2-25 % 0-17 % 2-14 % 3-89 %

Clavo Syzygium aromaticum Eugenol

Acetato de eugenilo 75-85 % 8-15 %

Tomillo Thymus vulgaris Timol

Carvacrol ϒ- Terpineno

10-64 % 2-11 % 2-31 %

Árbol del té Melaleuca alternifolia

Terpinen-4-ol ϒ- Terpineno

- Terpineno 1,8-Cineol

29-45 % 10-28 % 3-13 % 4-16 %

Limón Citrus lemon Limoneno

ϒ- Terpineno

- Pineno

63 % 9 % 2 %

1.4. MICROENCAPSULACIÓN MEDIANTE SECADO POR ASPERSIÓN

MICROENCAPSULACIÓN

Una microcápsula es una unidad que actúa como un contenedor microscópico en el que una

sustancia sólida, líquida o gaseosa (núcleo) se rodea con una envoltura (material pared)

suficientemente resistente, estable e inmiscible aunque adherente con el núcleo. El tamaño de

estas unidades varía entre 0,5 y 200 micras.

Mediante el proceso de microencapsulación ciertas sustancias bioactivas son introducidas en

una matriz o sistema polimérico matricial con el objetivo de impedir su pérdida, protegerlas de

la reacción con otros compuestos presentes o impedir que sufran reacciones de oxidación.

Puede ser considerada como una forma de empaquetamiento a escala microscópica, en la que

un material en particular puede ser cubierto de manera individual para protegerlo del

INTRODUCCIÓN 10

ambiente 17, 18, 19, 20. Proporciona un medio de envasar, separar y almacenar materiales a escala

microscópica para su liberación posterior bajo condiciones controladas.

Para la producción de microcápsulas existen distintos métodos que pueden dividirse en tres

grupos:

a) Procesos físicos: secado por aspersión.

b) Procesos químicos: polimerización interfacial e inclusión molecular.

c) Procesos fisicoquímicos: coacervación, liposomas y gelificación iónica.

Dentro de los métodos físicos se encuentra el secado por aspersión 21, 22, el más utilizado para

microencapsular ingredientes alimenticios, por ser el más económico. Los encapsulantes o

materiales formadores de pared influyen en la estabilidad de la emulsión antes de secar, en el

tamaño de las partículas y en las propiedades de flujo 23, 24, 25.

SECADO POR ASPERSIÓN

El secado por aspersión se basa en nebulizar la disolución que va a ser secada en forma de

gotas muy finas, en el seno de una corriente de gas caliente que generalmente es aire26. Se

forman partículas esféricas, con un diámetro que puede oscilar entre los 20 y los 200 μm 27, 28.

El aire caliente introducido alcanza una temperatura que oscila entre 100 °C y 200 °C. Sin

embargo, las gotas del líquido formadas se calientan solo hasta 40 °C debido a la corta

duración del secado (fracciones de segundo), lo que evita la degradación del producto26.

Este método se puede utilizar en operaciones de recubrimiento de sólidos y líquidos porque a

medida que se evapora el disolvente, el material de recubrimiento envuelve las partículas, lo

que puede ser útil para enmascarar olores y sabores y mejorar la estabilidad29. Otra utilidad

del secado por aspersión es la microencapsulación de gotas de líquidos oleosos. Se consigue

17

Yoshii, H., T. Furuta & A. Soottitantawat Microencapsulation of food flavors by spray drying. In Encyclopedia of Agricultural, Food, and Biological Engineering (D.R. Heldman, ed..) Taylor & Francis. 2003. 18

Pedroza, R., L. Cruz, D. Ricque, M. Tapia, M. Gaxiola & N. Simoes Memorias del VI Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. Cancún, México. 2002 19

Rosenberg, M., T. Kopelman & Y. Talmon J. Agric. Food Chem. 38. 1990. 20

McNamee, B., E. Dolores & M. O’Sullivan J. Agric. Food Chem. 49. 2001. 21

Soottitantawat, A., H. Yoshii, T. Furuta, M. Ohgawara, P. Forssell, R. Partanen, K. Poutanen & P. Linko J. Agric. Food Chem. 52. 2004. 22

Soottitantawat, A., H. Yoshii, T. Furuta, M. Ohgawara & P. Linko J. Food Sci. 68. 2003 23

Yoshii, H., A. Soottitantawat, X. Liu, T. Atarashi, T. Furuta, S. Aishima, M. Ohgawara & P. Linko Inn. Food Sci. & Emer. Tech. 2. 2001. 24

Jimenez, M., H. García & C. Beristain Eur. Food Res. Tech. 219. 2004 25

Kolanowski, W., D. Jaworska, J. Weißbrodt & B. Kunz J. Amer. Oil Chem. Soc. 84. 2007. 26

Därr A. Tecnología farmacéutica. Zaragoza: Editorial Acribia. 1981. 27

Masters K. Spray Drying Handbook. 5th ed. New York: Longman Scientific and Technical; 1991. 28

Voigt R. Tratado de tecnología farmacéutica. Zaragoza: Editorial Acribia. 1982. 29

Secado por aspersión y su uso en la encapsulación. 2006.

INTRODUCCIÓN 11

emulsificándolas en agua con ayuda de goma arábiga o almidón y luego sometiéndolas al

proceso de secado por aspersión30.

MICROENCAPSULACIÓN MEDIANTE SECADO POR ASPERSIÓN

Una de las grandes ventajas de este proceso, en comparación con otros métodos de

microencapsulación, además de su simplicidad, es que es apropiado para materiales muy

volátiles y sensibles al calor, ya que el tiempo de exposición a temperaturas elevadas es muy

corto 21.

Los principales encapsulantes (material pared) utilizados para este método son: carbohidratos

(almidón y derivados, maltodextrinas, jarabes de maíz, sacarosa, dextrana, ciclodextrinas,

carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, nitrocelulosa, acetilcelulosa); gomas (arábiga,

mezquite, guar, alginato de sodio, carragenina); lípidos (ceras, parafinas, grasas, ácido

esteárico, tristearina, mono y diglicéridos) y proteínas (gelatina, proteína de soya, caseinatos,

suero de leche, zeína, gluten, caseína).

Estos encapsulantes deben tener la capacidad de proporcionar una emulsión estable durante

el proceso de secado por aspersión y tener muy buenas propiedades de formación de película

para proveer una capa que proteja al ingrediente activo de la oxidación 31.

1.5. MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN

DE ACEITES ESENCIALES

En la bibliografía consultada, la mayoría de los procedimientos para determinar la composición

química de los diferentes aceites esenciales se basaron en la técnica de cromatografía de gases

acoplada a espectrometría de masas (CG-MS)32, 33. Es el caso de la determinación del aceite de

las hojas de toronjil (Melissa officinalis L) 33 y del aceite esencial de clavo34, 35.

30

Information Spray dryers. 2006.

http://www.niro.dk/ndk_website/NIRO/cmsdoc.nsf/WebDoc/ndkk5hmc6zSpray-Dryers 31 Yánez J, Salazar J, Montoya L, Chaires J, Jiménez M, Márquez E, et al. Aplicaciones biotecnológicas de

la microencapsulación. Avance y Perspectiva; 21. 2007 32

Acevedo A., Castañeda M., Blanco K., Cardenas C. Composición y capacidad antioxidante de especies aromáticas y medicinales con alto contenido de timol y carvacrol. Scientia et Technica Año XIII. Nº 33, 2007 33

Acevedo D., Navarro M., Montero P., Composición química del aceite esencial de las hojas de Orégano (Origanum vulgare). Información tecnológica, 24 (4), 2013 34

Srivastava, A., Srivastava, S. K. y Syamsundar, K. V., Bud and leaf essential oil composition of Syzygium aromaticum from India and Madagascar. Flavour and Fragance Journal, 20. 2005 35

Aguilar-González A.E., López-Malo A. Extractos y aceite esencial del clavo de olor (Syzygium aromatic) y su potencial aplicación como agentes antimicrobianos en alimentos. Temas Selectos de Ingeniería de Alimentos,7-2. 2013

INTRODUCCIÓN 12

Otra alternativa para identificar los compuestos que constituyen el aceite esencial es mediante

cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), así Rana36 et al, analizaron aceite esencial de

clavo por HPLC en el modo isocrático usando una columna C18 de fase reversa.

36

Rana, I., Rana, A. y Charan R., Evaluation of antifungal activity in essential oil of the Syzygium aromaticum (L) by extraction, purification and analysis of its main component eugenol. Brazilian Journal of Microbiology, 42, (4). 2011.

2. OBJETIVOS

OBJETIVOS 14

El objetivo principal de este trabajo es la determinación de los compuestos mayoritarios

presentes en los aceites esenciales de limón y del árbol de té que pueden emplearse como

bioplaguicidas microencapsulados.

Este objetivo puede subdividirse en los siguientes:

1. Identificación de los compuestos mayoritarios de los aceites mencionados anteriormente

mediante cromatografía de gases-masas (CG-MS).

2. Puesta a punto y validación del método cromatográfico (CG-FID).

3. Fabricación y análisis de las microcápsulas.

4. Cuantificación de la eficacia de microencapsulado y del rendimiento del proceso.

5. Evaluación en el tiempo de la liberación del compuesto activo de las microcápsulas.

3. MATERIALES E

INSTRUMENTACIÓN

MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 16

3.1. MATERIALES

Los aceites esenciales utilizados en este trabajo y suministrados por Sigma Aldrich han sido:

- ACEITE ESENCIAL DE LIMÓN

Categoría: Aceite esencial

Nombre botánico: Citrus lemon

Nº CAS: 8008-56-8

Nº EINCS: 284-515-8

Origen: California

Densidad: 0,850 g/mL

- ACEITE ESENCIAL DE ÁRBOL DEL TÉ

Categoría: Aceite esencial

Nombre botánico: Melaleuca alternifolia

Nº CAS: 68647-73-4

Nº EINCS: -

Origen: Australia

Densidad: 0,898 g/mL

Los patrones de los compuestos mayoritarios, han sido suminstrados por Sigma Aldrich.

- LIMONENO, ESTANDAR ANALÍTICO, ≥99,0 %

Nº CAS: 5989-27-5

Origen: Suiza

Densidad: 0,842 g/mL

- TERPINEOL, MEZCLA DE ISÓMEROS, ≥96,0 %

Nº CAS: 8000-41-7

Origen: Francia

Densidad: 0,930 g/mL

- 3- OCTANOL (PATRÓN INTERNO)

Pureza: ≥97 %

Nº CAS: 589-98-0

Densidad: 0,818 g/mL

Los disolventes utilizados han sido:

- HEXANO ANHÍDRIDO, 95 %

Nº CAS: 110-54-3

Densidad: 0,655 g/mL

- DICLOROMETANO ANHÍDRIDO, ≥99,8 %

Nº CAS: 75-09-2

Densidad: 1,33 g/mL

MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 17

Las microcápsulas han sido fabricadas en el CTIC-CITA llevando el material pared:

- Maltodextrina (MD) y goma arágiba (GA) (Sosa Ingredients S.L)

Los aparatos utilizados han sido:

- Agitador horizontal SBS, modelo ABT-4 (Afora)

- Vortex tipo REAX top (Heidolph)

3.2. INSTRUMENTACIÓN

3.2.1. CROMATOGRAFÍA DE GASES-MASAS (CG-MS)

Los análisis realizados en este trabajo se han llevado a cabo en un cromatógrafo de gases

acoplado a un espectrómetro de masas (CG-MS) HP-G1800B GCD System Agilent Technologies

5975C equipado con un puerto de inyección Split-Splitles (relación 1:50), un inyector manual

Agilent 7863 y un software HP Chem Station.

Para el análisis de los aceites esenciales y la determinación de sus componentes se empleó una

columna capilar no polar Teknokroma, una columna TRB-5MS con una fase estacionaria de

dimetil - difenilpolisiloxano (95 % - 5 %) (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm).

Su estructura, formada por Poli(difenildimetil)siloxano, pertenece al grupo de polisiloxanos

conocidos como “siliconas” y se presenta en la Figura 1.

Figura 1. Estructura de la fase estacionaria, poli(difenildimetil)siloxano.

3.2.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES-FID (CG-FID)

El cromatógrafo de gases empleado fue un Hewlett-Packard (HP) 5890 serie I equipado con un

inyector automático, un detector de ionización de llama (FID) y un software ChemStation

A.05.02 y puede verse en la Figura 2.

La columna utilizada ha sido HP5 Crosslinked 5 % PM ME Siloxano (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm)

ligeramente polar. Según la bibliografía se trata de la columna más utilizada en análisis de

aceites esenciales ya que permite acortar ligeramente los tiempos frente a las columnas

apolares.

MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 18

Figura 2. Cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama empleado.

3.2.3. SPRAY-DRYER

El equipo de secado por atomización empleado en el proceso de microencapsulación fue un

Büchi mini Spray Dryer B-290 como el que se presenta en la Figura 3.

Se compone principalmente de un sistema de alimentación del líquido (1) y un dispositivo de

atomización que consiste en una boquilla de atomización (2), una cámara de secado (3) y un

sistema colector del producto seco (4).

Figura 3. Büchi mini Spray Dryer B-290.

1

4

3

2

4. RESULTADOS

RESULTADOS 20

4.1. ENSAYOS PREVIOS

4.1.1. CROMATOGRAFÍA DE GASES-MASAS (CG-MS)

Los primeros ensayos consistieron en identificar los componentes de los dos aceites de limón y

del árbol del té y determinar cuáles son los mayoritarios. Para ello se prepararon diluciones

1:10 de cada aceite en hexano y en diclorometano y se analizaron por CG-MS. Se seleccionaron

el hexano (HX) y el diclorometano (DM) puesto que se trata de disolventes con distinta

polaridad, el primero es un disolvente no polar mientras que el segundo es polar aprótico.

Para los análisis, la temperatura del horno se programó desde 50 °C (2 minutos) hasta 310 °C

(2 min.) aumentando 6 °C/min. Las temperaturas del inyector y detector fueron 230 °C y 250

°C respectivamente. El gas de arrastre empleado fue helio (99,995%) a una velocidad de flujo

de 1 mL/min y el rango de masas m/z 50-450.

Comparando los resultados con la base de datos del sistema se identificaron los componentes

de los aceites ya que cada uno presentará un tiempo de retención característico.

ACEITE ESENCIAL DE LIMÓN

Los cromatogramas obtenidos a partir del análisis del aceite esencial de limón se recogen en la

Figura 4, donde la imagen de la izquierda se corresponde con la muestra de hexano y la de la

derecha, con la de diclorometano. Como se observa, el principio activo (p.a) mayoritario del

aceite de limón es el limoneno. Y los tiempos de retención en hexano y diclorometano son

similares.

Figura 4. Cromatogramas del aceite esencial de limón en hexano y diclorometano.

RESULTADOS 21

En la Tabla 3 se muestran los principios activos que corresponden a los tiempos de retención

obtenidos por CG-MS.

Tabla 3. Compuestos mayoritarios del aceite esencial de limón.

PRINCIPIO ACTIVO TIEMPO DE RETENCIÓN

(min) HX DM

ESPECIFICACIONES

Limoneno

8,32 8,35

1-Metil-4-(1-metiletenil)-ciclohexeno

C10H16

Masa molecular: 136,23 g/mol

Densidad: 0,842 g/cm3

Punto fusión: -74,35 °C

Punto ebullición: 176 °C

3 – Careno

8,98 9,01

3,7,7,-trimetilbiciclo[4.1.0]hept-3-eno

C10H16

Masa molecular: 136,23 g/mol

Densidad: 0,867 g/cm3

Punto ebullición: 168 °C

- Pineno

6,98 7,01

6,6-Dimetil-2-metilenobiciclo[3.1.1]heptano

C10H16

Masa molecular: 136,23 g/mol

Densidad: 0,860 g/cm3

Punto fusión: -61 °C

Punto ebullición: 166 °C

RESULTADOS 22

ACEITE ESENCIAL DEL ÁRBOL DEL TÉ

Los resultados del AE del árbol del té obtenidos al realizar los análisis en el cromatógrafo de

gases-masas se presentan en la Figura 5 (en hexano izquierda y en diclorometano derecha).

Figura 5. Cromatogramas del aceite esencial del árbol del té en hexano y diclorometano

Los cromatogramas obtenidos en hexano y diclorometano son similares. El tiempo de

retención de 11,76 corresponde al terpineno-4-ol según la biblioteca del CG-MS y aparece

como el compuesto mayoritario.

En la Tabla 4 se presentan los principios activos correspondientes a los tiempos de retención

de los cromatogramas.

RESULTADOS 23

Tabla 4. Componentes mayoritarios del AE del árbol del té.

PRINCIPIO ACTIVO TIEMPO DE

RETENCIÓN (min) HX DM

ESPECIFICACIONES

Terpinen-4-ol

11,76 11,77

3-ciclohexen-1-ol, 4-metil-1-(1-metiletil)

C10H18O

Masa molecular: 154,25 g/mol

Densidad: 0,934 g/cm3

Punto fusión: 35-40 °C

Punto ebullición: 218-221 °C

ϒ – Terpineno

9,00 9,01

1-Isopropil-4-metil-1,4-ciclohexadieno

C10H16

Masa molecular: 136,23 g/mol

Densidad: 0,853 g/cm3

Punto fusión: -10 °C

Punto ebullición: 182 °C

2 – Careno

7,98 7,98

3,7,7,-trimetilbiciclo[4.1.0]hept-2-eno

C10H16

Masa molecular: 136,23 g/mol

Densidad: 0,862 g/cm3

Punto fusión: -13 °C

Punto ebullición: 167 °C

4.1.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES-FID

Una vez identificados los compuestos mayoritarios a partir de los cromatogramas obtenidos

por CG-MS, se realizaron los análisis por CG-FID para comprobar y comparar los tiempos de

retención de cada uno. Se tomaron 60 μL de AE de limón y se llevaron a un volumen final de 50

mL (Disolución 1). Para el aceite esencial del árbol del té se tomaron 50 μL y se llevaron a un

matraz de 50 mL (Disolución 2). De la Disolución 1 se tomaron por una parte 2 mL y se llevaron

a un matraz de 10 mL en hexano y, por otra parte, se tomaron 4 mL y se llevaron a otro matraz

de 10 mL en diclorometano. De la Disolución 2, tanto para hexano como para diclorometano

se tomaron 3 mL y se llevaron a un volumen final de 10 mL.

Las condiciones cromatográficas iniciales se indican en la Tabla 5.

RESULTADOS 24

Tabla 5. Condiciones cromatográficas.

VARIABLE CONDICIONES

Temperatura inyector 220 °C

Temperatura detector 220 °C

Columna HP5 Crosslinked 5% PM ME Siloxano, ligeramente polar

Gas portador He (mL/min) 1

Caudal de aire (mL/min) 400

Caudal de hidrógeno (mL/min)

40

Volumen de inyección (μL) 1

Relación de Split 10:1

Programa de Temperatura 50 °C (1 min.), 50-150 °C a 6 °C /min, 150 °C (20 min.), 150-200 °C a 10 °C /min; 200 °C (10 min)

ACEITE ESENCIAL DE LIMÓN

Se realizaron los análisis por CG-FID tanto en hexano como en diclorometano.

A continuación, en la Figura 6, se presenta el cromatograma obtenido para la disolución del AE

de limón en hexano.

Figura 6. Cromatograma aceite esencial de limón en hexano.

Los tiempos de retención de los principios activos mayoritarios se recogen en la Tabla 6.

Tabla 6. Tiempo de retención de los compuestos del aceite de limón en hexano.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

6.697 2972.8 1386.2 -Pineno

7.927 14497.7 6688.3 Limoneno

8.672 1559.4 727 Careno

Los resultados obtenidos para la disolución preparada en diclorometano quedan reflejados en

la Figura 7.

min0 10 20 30 40 50

counts

3400

3600

3800

4000

4200

4400

4600

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\LIMNHE~1.D)

1.4

89

1.5

67

1.6

64

1.7

17

1.8

34

1.9

31

5.7

37

6.6

22

6.6

97

7.0

18

7.0

90

7.9

27

8.6

72

13

.92

4

RESULTADOS 25

Figura 7. Cromatograma aceite esencial de limón en diclorometano.

Los tiempos de retención de los compuestos mayoritarios se han recogido en la Tabla 7.

Tabla 7. Tiempo de retención de los compuestos del aceite de limón en diclorometano.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

7.137 6110 2897.2 -Pineno

8.330 30422.5 14311.9 Limoneno

Se observan pequeñas diferencias en los tiempos de retención de los compuestos identificados

en el aceite esencial de limón en función del disolvente. Sin embargo, esperaremos a tener los

resultados del aceite esencial del té para seleccionar uno de los dos disolventes.

ACEITE ESENCIAL ÁRBOL DEL TÉ

Los análisis por CG-MS se realizaron en hexano y en diclorometano.

El análisis de la disolución del AE del árbol del té en hexano mediante CG-FID, se muestra en la

Figura 8.

Figura 8. Cromatograma aceite esencial árbol del té en hexano.

min0 10 20 30 40

counts

3800

4000

4200

4400

4600

4800

5000

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\LIMNDI~1.D)

1.8

56

1.9

35

2.2

99

7.1

37

8.3

30

min0 5 10 15 20

counts

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

FID2 A, (PINTERNO\29021613.D)

1.4

32

1.6

24

1.7

36

1.8

22

8.2

66

9.3

83

12

.48

8

RESULTADOS 26

Los tiempos de retención correspondientes a los compuestos mayoritarios que han sido

identificados se recogen en la Tabla 8.

Tabla 8. Tiempo de retención de los compuestos del té en hexano.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

8.266 4385.7 209 2-Careno

9.383 10450.5 4899.9 ϒ-Terpineno

12.488 20177.3 8795.6 Terpinen-4-ol

En cuanto al cromatograma del aceite esencial del árbol del té en diclorometano, se presenta

en la Figura 9.

Figura 9. Cromatograma aceite esencial árbol del té en diclorometano.

En la Tabla 9 se presentan los tiempos de retención correspondientes a los compuestos

mayoritarios del AE del árbol del té identificados en el análisis.

Tabla 9. Tiempo de retención de los compuestos del té en diclorometano.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

8.272 3833.6 1656.6 2-Careno

9.389 8669 3879 ϒ-Terpineno

12.493 17839.8 7579.3 Terpinen-4-ol

Como muestran los datos de las Tablas 8 y 9, los tiempos de retención (tr) de los compuestos

mayoritarios del AE del árbol del té en hexano y en diclorometano son los mismos, siendo el

terpinen-4-ol (tr = 12,493 min) el mayoritario.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos del estudio por CG-MS y CG-FID, los compuestos

mayoritarios seleccionados fueron: limoneno (para el AE de limón) y terpinen-4-ol (para aceite

esencial del árbol del té), aunque en este caso, a partir de ahora se hablará de terpineol ya que

es el principio activo que se compró y es una mezcla de varios isómeros entre los que se

encuentra el terpinen-4-ol.

min0 5 10 15 20

counts

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

FID2 A, (PINTERNO\29021606.D)

1.4

78

8.2

72

9.3

89

12

.49

3

RESULTADOS 27

MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN

El método de cuantificación que se va a utilizar es el del patrón interno (pi), para ello se ha de

seleccionar un compuesto cuyo tiempo de retención no interfiera con los de los compuestos

que se van a determinar. Es decir, no debe coincidir con el tiempo de retención de limoneno y

terpineol, ni éstos deben variar debido a la presencia del patrón interno. Además debe ser

soluble en el disolvente a utilizar. Teniendo en cuenta la experiencia del grupo de investigación

se probó con 3-octanol.

Al añadir el pi, la respuesta que se emplea cambia. Ahora se tiene en cuenta la relación entre

el área del compuesto activo estudiado (limoneno o terpineol) y el área del patrón interno (3-

octanol).

El cromatograma del pi seleccionado (50 ppm) se presenta en la Figura 10 y el tiempo de

retención correspondiente se recoge en la Tabla 10.

Figura 10. Cromatograma de 3-octanol en diclorometano.

Tabla 10. Tiempo de retención de 3-octanol

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

7.731 3213.9 3119.4 3-Octanol

Como puede observarse, el tiempo de retención es distinto al del limoneno y terpineol, sin

embargo, se volverán a cromatografiar disoluciones de los aceites más el patrón interno. Para

ello se preparan disoluciones de aceite esencial y de patrón interno en diclorometano y se

analizan por CG-FID.

ACEITE ESENCIAL DE LIMÓN + PATRÓN INTERNO

El cromatograma del aceite esencial de limón se presenta en la Figura 11 y los tiempos de

retención obtenidos se indica en la Tabla 11.

min0 2 4 6 8 10 12 14

counts

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

FID2 A, (PINTERNO\29021610.D)

1.3

49

1.4

46

1.4

79

1.5

83

7.7

31

RESULTADOS 28

Figura 11. Cromatograma aceite esencial de limón + pi en diclorometano.

Tabla 11. Tiempos de retención de aceite de limón y patrón interno.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

7.751 22269.3 10686.5 3-Octanol

8.613 43084.8 20398.8 Limoneno

9.413 4869.1 2206.8 Careno

ACEITE ESENCIAL DEL ÁRBOL DEL TÉ + PATRÓN INTERNO

En la Figura 12 se indica el cromatograma de la disolución de AE del árbol del té con patrón

interno en diclorometano.

Figura 12. Cromatograma aceite esencial del árbol del té + patrón interno en diclorometano.

Los tiempos de retención, tanto del pi como de los compuesto mayoritarios del AE del árbol

del té, se recogen en la Tabla 12.

Tabla 12. Tiempo de retención de los compuestos del aceite de té y de 3-octanol.

TIEMPO (min) ÁREA ALTURA COMPUESTO

7.732 19475.4 9275.8 3-Octanol

8.276 4584 2051.2 2-Careno

9.392 10847.3 4898.7 ϒ-Terpineno

12.496 21626.2 9221.3 Terpineol

min0 2 4 6 8 10 12 14

counts

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

FID2 A, (PINTERNO\29021601.D)

1.4

89

7.2

61

7.7

51

8.6

13

9.4

13

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

counts

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

FID2 A, (PINTERNO\26021606.D)

1.4

77

7.7

32

8.2

76

9.3

92

12

.49

6

RESULTADOS 29

Como del estudio realizado con hexano y diclorometano se obtienen resultados similares, para

el resto de trabajo se selecciona el hexano ya que el diclorometano es un disolvente clorado y

genera más residuos.

Por otra parte, y teniendo en cuenta los tiempos de retención obtenidos, se ajusta la rampa de

temperaturas del método de acuerdo a cada compuesto para así reducir el tiempo total de

medida. De manera que, a partir de ahora, el programa de temperaturas será distinto en

función del principio activo que se determine tal y como se indica en la Tabla 13.

Tabla 13. Tiempos de retención y programa de temperaturas para limoneno y terpineol.

Principio activo Tiempo de

retención (min) Programa de temperatura

Limoneno 8,6 50 °C (2 min.); 50-120 °C a 6 °C/min; 120 °C (2 min)

Terpineol 12,5 50 °C (2 min.); 50-150 °C a 6 °C/min; 150 °C (4 min)

4.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

Los métodos utilizados en un laboratorio de análisis químicos han de ser evaluados y

sometidos a prueba para asegurarse de que producen unos resultados válidos y coherentes

con el objetivo previsto, es decir, han de ser validados.

La validación o la verificación de un método se realizan mediante una serie de pruebas

normalizadas y experimentales de las que se obtienen datos sobre su exactitud, precisión,

sensibilidad, límite de detección y cuantificación, repetibilidad y precisión intermedia, entre

otros.

Una vez seleccionado el disolvente, los patrones puros, las condiciones cromatográficas y el

patrón interno, se calcularon las características del método analítico.

A continuación se definen las características analíticas estudiadas.

LINEALIDAD

La linealidad de un método define su aptitud para obtener resultados proporcionales a la

concentración de analito dentro de un rango predeterminado. Muchos autores37, 38, 39 plantean

que R2 debe presentar un valor mayor de 0,999 para que el método se considere lineal.

37

Martin-Smith M, Rudd DR. The importance of proper validation of the analytical methods employed in the quality control of pharmaceuticals. Acta Pharm Jugosl;40. 1990. 38

Camacho MA, Torres AI, Gil ME, Obregón MM, Ruz V. Validation protocol of analytical methods for finished pharmaceutical products. ATP Pharma Practique, 3(3). 1993. 39

Torres AI, Camacho MA. Validation of two analytical methods applied to two new cytostatic drugs. STP Pharma Practique; 2(2). 1992

RESULTADOS 30

El rango lineal se corresponde con el rango de concentraciones de analito para las cuales el

método ofrece resultados proporcionales a la concentración. Este intervalo está comprendido

entre la concentración correspondiente al límite de cuantificación y la concentración máxima

con la que se obtiene una señal proporcional.

SENSIBILIDAD

Propiedad analítica que se define como la capacidad de un método para discriminar entre

concentraciones similares de analito. La sensibilidad de un método analítico se corresponde

con la pendiente de la recta de calibración.

LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de detección (LOD) es la menor cantidad de analito que genera una señal distinta de

cero con un nivel de confianza especificado. Se calcula como la relación ente la desviación

estándar del blanco (Sb) multiplicada por tres y la pendiente de la ecuación de la recta.

LOD =

El límite de cuantificación (LOQ) es la menor cantidad que puede ser determinada

cuantitativamente con una incertidumbre asociada para un nivel de confianza dado. Se calcula

como diez veces la desviación estándar del blanco (Sb) dividido de la pendiente de la ecuación

de la recta.

LOQ =

PRECISIÓN

Nivel de concordancia entre los resultados experimentales obtenidos cuando aplicamos varias

veces el mismo método analítico a la misma muestra (réplica).

La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El grado de

precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se calcula como desviación

estándar de los resultados.

Repetibilidad

Desviación estándar obtenida al analizar una misma muestra varias veces, en el mismo

laboratorio, en un periodo de tiempo corto, sin cambiar de equipo de medida, reactivos o

analista. Se calcula como:

Sr % =

x 100

RESULTADOS 31

Reproducibilidad

Desviación estándar obtenida al analizar varias veces la muestra en días distintos y diferentes

laboratorios, pudiendo variar condiciones tales como el equipo, reactivos o analistas. Se habla

de reproducibilidad interlaboratorio ya que las medidas se realizan en laboratorios distintos.

Cuando las medidas se realizan en un solo laboratorio, preparando los patrones de calibración

cada vez, en distintos días y cambiando en la medida de lo posible de equipo y analista, se

habla de reproducibilidad intralaboratorio. A esta reproducibilidad se la conoce como

precisión intermedia y es la característica analítica que se ha calculado mediante la siguiente

expresión:

Precisión intermedia =

x 100

Media = valor medio de todos los resultados obtenidos en los distintos días.

En primer lugar hay que comprobar si las varianzas son homogéneas con ayuda del estadístico

de Levene y, posteriormente, calcular ANOVA. A partir de los resultados de ANOVA, tomar el

valor de media cuadrática inter-grupos y calcular la precisión intermedia siguiendo la

expresión.

RECUPERACIÓN

Con el objetivo de evaluar la exactitud del método establecido para determinar todo el analito

presente en la muestra, se calculará el porcentaje de recuperación que corresponde a la

diferencia entre la concentración medida de un analito en una muestra fortificada (Cs, a la que

se ha agregado una cantidad conocida de compuesto activo) y la concentración medida en la

misma muestra sin fortificar (C), dividido por la concentración de la sustancia agregada (Ca).

Recuperación (%) =

x 100

Definidas las características analíticas que se calcularon, se presentarán los resultados para

cada uno de los aceites esenciales.

- ACEITE ESENCIAL DE LIMÓN

LINEALIDAD

Para determinar el límite superior del rango lineal, se prepararon una serie de disoluciones de

limoneno en hexano de concentración entre 10 y 300 ppm y una concentración de pi igual a 50

ppm y se analizaron por triplicado. Los resultados obtenidos se indican en la Tabla 14 y se

representan en la Figura 13. Los datos completos se encuentran en la Tabla 1 del Anexo 1.

RESULTADOS 32

Tabla 14. Concentración y señal media de las disoluciones de limoneno.

1 2 3 4 5 6

[LIMONENO] (ppm) 9,94 59,61 119,23* 178,84 238,45 298,07

ALimoneno/Api 0,2655 0,9060 2,5969 2,6841 3,4333 4,8332

* El punto correspondiente a la concentración de 119,23 ppm no se ha tenido en cuenta.

Figura 13. Representación de los datos obtenidos para calcular el límite superior del rango lineal.

Se considera que el limoneno es lineal hasta una concentración de 240 ppm ya que el punto

correspondiente a la concentración de 300 ppm se desvía.

Una vez sabemos hasta qué punto es lineal el limoneno, se calculará la ecuación de la recta.

Para ello se preparan disoluciones de limoneno junto con pi de un rango de concentraciones

comprendido entre 0,50 y 100 ppm. La concentración de 3-octanol es de 50 ppm.

Se ha elegido una concentración máxima de limoneno de 100 ppm puesto que en los análisis

de cuantificación, según el contenido de limoneno en el AE que da la bibliografía consultada,

se espera obtener una respuesta que al interpolarla quede en torno a 50 ppm, una zona

intermedia de la recta.

Las concentraciones de limoneno y la media de las señales obtenidas se indican en la Tabla 15

y se representa en la Figura 14. Los datos del análisis por triplicado de estas disoluciones se

indican en la Tabla 2 del Anexo 1.

Tabla 15. Concentración y señal media de las disoluciones empleadas para la recta de calibrado.

1 2 3 4 5 6 7 8

[LIMONENO] (ppm)

0,50 2,98 6,95 9,94 29,81 49,68 73,52* 99,36

ALimoneno/Api 0,0089 0,0592 0,1395 0,1869 0,5890 0,9599 1,6014 1,9821

*El punto correspondiente a la concentración de 73 ppm no se ha tenido en cuenta en los

cálculos de las propiedades analíticas por considerar que se desvía.

ALimoneno/Api = 0,0154[Limoneno] + 0,0125

R² = 0,9904

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 100 200 300 400

Alim

on

eno/A

pi

[Limoneno] (ppm)

RESULTADOS 33

Figura 14. Recta de calibrado de limoneno.

En la Tabla 16 se recogen los valores de la pendiente y ordenada en el origen correspondientes

a la ecuación de la recta de calibrado de limoneno.

Tabla 16. Pendiente y ordenada en el origen y sus desviaciones.

Coeficientes Error típico R2

Ordenada en el origen -0,0053 0,0062 0,9997

Pendiente 0,0199 0,0001

SENSIBILIDAD

Como la sensibilidad viene dada por la pendiente, para el limoneno tenemos que la

sensibilidad es: 0,0199 ± 0,0001 L/mg

LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOD y LOQ)

Para poder calcular la desviación estándar del blanco se preparó una rectas con cinco

disoluciones muy diluidas en las que la concentración de limoneno varía de 0,5 a 5 ppm como

se indica en la Tabla 17. La concentración de pi es 50 ppm. Las cinco disoluciones de la recta se

analizaron en orden y se repitió el proceso un total de 10 veces.

Tabla 17. Concentración de limoneno en las disoluciones de las rectas diluidas.

Compuesto activo 1 2 3 4 5

[Limoneno] (ppm)

0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

De este modo se obtienen diez ecuaciones de la recta, es decir, diez pendientes y diez

ordenadas en el origen (ver Anexo 1, Tablas 3 y 4) a partir de las cuales es posible calcular la

desviación estándar de las mismas. Estos valores se recogen en la Tabla 18.

ALimoneno/Api = 0,0199[Limoneno] - 0,0053 R² = 0,9997

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 20 40 60 80 100 120

Alim

on

en

o/A

pi

[Limoneno] (ppm)

RESULTADOS 34

Tabla 18. Valores para calcular LOD y LOQ.

Limoneno

Desviación estándar ordenada en el origen 0,0011

Pendiente 0,0413

Ecuación de la recta ALimoneno/Api = 0,0413[Limoneno] - 0,0032*

* Se observa que el valor de la pendiente obtenida a partir de las disoluciones diluidas es

distinta a la pendiente de la recta de calibrado (0,0199). Es decir, el comportamiento es

diferente en función de la concentración.

Si se analizan muestras de baja concentración, debe utilizarse la pendiente de la recta diluida.

En este trabajo se utiliza la pendiente de la recta de calibrado porque según la bibliografía

consultada, la cuantificación de las muestras dará valores en torno a 50 ppm.

Con los valores de la Tabla 18 se calcula el límite de detección y cuantificación según las

siguientes expresiones:

LOD =

LOQ =

Los resultados se presentan en la Tabla 19.

Tabla 19. Límites de detección y cuantificación para limoneno

Limoneno

LOD (ppm) 0,0799

LOQ (ppm) 0,2663

Una vez determinado el LOQ, podemos decir que el rango lineal del limoneno se encuentra

entre 0,266 y 240 ppm.

PRECISIÓN

Repetibilidad

Para el cálculo de la repetibilidad se preparó una disolución de limoneno junto con pi de

concentración intermedia, 50 ppm, y se analizó 10 veces. La concentración de 3-octanol es de

50 ppm Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 20.

RESULTADOS 35

Tabla 20. Relación de áreas en el cálculo de la repetibilidad para limoneno.

ALimoneno Api ALimoneno/Api

12993 15484 0,8391

12829 15353 0,8356

12797 15312 0,8358

12765 15288 0,8350

12744 15227 0,8369

12948 15543 0,8330

12465 14991 0,8315

12640 15201 0,8315

12849 15394 0,8347

13056 15664 0,8335

En la Tabla 21 se indican los valores necesarios para el cálculo de la repetibilidad así como el

resultado de la desviación estándar relativa porcentual (Sr %)

Tabla 21. Repetibilidad del limoneno.

Limoneno

Media 0,8347

Desviación estándar (S) 0,0024

Desviación estándar relativa porcentual (Sr %) 0,29 %

Precisión intermedia

Una disolución de concentración igual a 50 ppm tanto para limoneno como para 3-octanol se

prepara cada 15-20 días y se analiza por triplicado en el CG-FID. Los datos obtenidos se

presentan en la Tabla 5 del Anexo 1.

En primer lugar, con ayuda del estadístico de Levene, se comprueba si las varianzas son

homogéneas. Para ello tenemos que:

H0 = s12 = s2

2 = s3

2 = s4

2

H1 = las varianzas son distintas

Los resultados se indican en la Tabla 22

Tabla 22. Prueba de homogeneidad de varianzas.

Estadístico de

Levene gl1 gl2 Sig.

Limoneno 1,175 3 7 ,385

RESULTADOS 36

El p-valor = 0,385 > 0,05, lo que significa que no hay diferencias significativas entre las

varianzas. Es decir, las varianzas son homogéneas y se acepta la hipótesis nula (H0). Puede

hacerse ANOVA, cuyos resultados se presentan en las Tablas 23 y 24.

Tabla 23. Descriptivos de los datos de limoneno para calcular la precisión intermedia.

N Media

Desviación típica

Error típico

Intervalo de confianza para la media al 95%

Mínimo Máximo

Límite inferior Límite superior

Limoneno

1 2 ,8293 ,0012 ,0009 ,8182 ,8405 ,8284 ,8302

19 3 ,8336 ,0026 ,0015 ,8271 ,8401 ,8310 ,8363

36 3 ,8304 ,0006 ,0004 ,8288 ,8320 ,8297 ,8310

52 3 ,8337 ,0016 ,0009 ,8299 ,8376 ,8320 ,8351

Total 11 ,8320 ,0025 ,0007 ,8303 ,8336 ,8284 ,8363

Tabla 24. ANOVA de un factor para limoneno.

Suma de

cuadrados gl

Media cuadrática

F Sig.

Limoneno

Inter-grupos ,000039 3 ,000013

4,334 ,050 Intra-grupos ,000021 7 ,000003

Total ,000060 10

Si tenemos en cuenta la ecuación para calcular la precisión intermedia, debemos considerar los

valores de las tablas marcados en azul, de manera que:

Precisión intermedia limoneno =

x 100 = 0,43%

RECUPERACIÓN

Para estudiar la recuperación se tomaron 60 μL del AE de limón y se llevaron a un volumen

final de 50 mL (Disolución 1). A partir de la Disolución 1 se preparó otra más diluida tomando 1

mL y llevándolo a un volumen final de 10 mL (Disolución 2). A la Disolución 2 se añadió el

patrón interno (50 ppm) y se analizó por triplicado. A partir de los datos obtenidos en los

cromatogramas (Tablas 6 del Anexo 1), se pudo determinar la cantidad de compuesto activo

presente en la muestra interpolando en la recta de calibrado (Tabla 25).

Tabla 25. Concentración de limoneno en la muestra.

[Limoneno] (ppm)

1 55,77

2 56,08

3 55,98

Una vez determinada la concentración de analito, se prepara otra vez la Disolución 2, Se añade

el patrón interno en la misma concentración y, además, se adiciona un 25 % de la

concentración de principio activo (limoneno) calculada. Como la concentración determinada se

RESULTADOS 37

encuentra en torno a 56 ppm, se añadieron 14 ppm de limoneno y se realizó el análisis por

triplicado. Los resultados se indican en la Tabla 7 del Anexo 1.

En la Tabla 26, se recogen los valores de concentración tras la adición del analito, así como el

factor de recuperación calculado.

Tabla 26. Recuperación del limoneno.

1 2 3

[Limoneno] (ppm) 69,51 69,63 70,52

Recuperación limoneno (%) 98,2 96,8 103,8*

Se observa un factor de recuperación medio de 97,5 ± 2,0 % (sin considerar el valor de 103,8).

- ACEITE ESENCIAL DEL ÁRBOL DEL TÉ

LINEALIDAD

Se prepararon seis disoluciones de terpineol en un rango de concentraciones entre 10 y 300

ppm. Se añadió 3-octanol en una concentración igual a 50 ppm. Las muestras se analizaron por

triplicado. Los resultados obtenidos se indican en la Tabla 27 y se representan en la Figura 15.

Los datos completos se encuentran en la Tabla 8 del Anexo 1.

Tabla 27. Concentración de las disoluciones y señal media obtenida.

1 2 3 4 5 6

[TERPINEOL] (ppm) 10,04 60,26 120,53 180,79 241,06 301,32

ATerpineol/Api 0,1840 0,6878 1,2726 1,8997 2,2828 3,3895

Figura 15. Representación de los datos obtenidos para calcular el límite superior del rango lineal

ATerpineol/Api = 0,0104 [Terpineol] + 0,0321

R² = 0,9822

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

0 50 100 150 200 250 300 350

ATe

rpin

eo

l/A

pi

[Terpineol] / ppm

RESULTADOS 38

Los puntos correspondientes a las concentraciones de 240 y 300 ppm se desvían mucho, por

tanto, el límite superior del rango lineal del terpineol se considera de 180 ppm.

Determinado el límite superior del intervalo lineal del terpineol, se calculó la ecuación de la

recta de calibrado. Se prepararon disoluciones de terpineol con concentraciones entre 1 y 100

ppm. Se añadió el patrón interno en una concentración igual a 50 ppm

La concentración máxima de la recta de calibrado es 100 ppm por los valores que se estiman

de terpineol en el AE a partir de la bibliografía consultada.

En la Tabla 28 se muestran las concentraciones de terpineol así como la media de la relación

de señales obtenidas para el cálculo de la recta de calibrado (los datos del análisis por

triplicado se indican en la Tabla 9 del Anexo 1). Su representación gráfica se indica en la Figura

16.

Tabla 28. Concentración y señal de las disoluciones empleadas para la recta de calibrado.

1 2 3 4 5 6 7 8

[TERPINEOL]/ppm 1,004 3,013 7,031 10,04 30,13* 50,22 74,33 100,44

ATerpineol/Api 0,0120 0,0336 0,0833 0,1342 0,2894 0,5594 0,8285 1,1109

* Los datos correspondientes a una concentración de 30 ppm no se tienen en cuenta a la hora

de calcular la ecuación de la recta ya que se desvían.

Figura 16. Recta de calibrado de terpineol.

La pendiente y la ordenada en el origen de la recta de calibrado de terpineol se indican en la

Tabla 29. También se incluyen las desviaciones estándar de las mismas, así como el coeficiente

de correlación (R2).

ATerpineol/Api = 0,011[Terpineol] + 0,0074 R² = 0,9997

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0 20 40 60 80 100 120

ATe

rpin

eo

l/A

pi

[Terpineol] / ppm

RESULTADOS 39

Tabla 29. Valores de la recta de calibrado para terpineol.

Coeficientes Error típico R2

Ordenada en el origen 0,0074 0,0045 0,9997

Pendiente 0,0110 0,00009

Se obtiene un buen valor de R2 para el rango de concentraciones estudiado.

SENSIBILIDAD

La sensibilidad viene dada por la pendiente de la recta de calibrado. Por tanto:

Sensibilidad terpineol = 0,0110 ± 0,0001 L/mg

LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOD y LOQ)

Para calcular el LOD y el LOQ se prepararon disoluciones muy diluidas de terpineol + 50 ppm

de 3-octanol. La concentración de terpineol se indica en la Tabla 30. Cada bloque de

disoluciones (1 a 5) se pinchó diez veces, de esta manera se obtuvieron diez rectas.

Tabla 30. Concentración de terpineol de las disoluciones diluidas.

Compuesto activo 1 2 3 4 5

[Terpineol] (ppm) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

Los resultados se recogen en la Tabla 10 del Anexo 1.

Como teníamos diez rectas, del análisis se obtienen diez pendientes y diez ordenadas en el

origen (ver Tabla 11 del Anexo 1), lo que permite calcular la desviación estándar de la

ordenada en el origen. Estos datos, junto con la ecuación de la recta y el valor medio de la

pendiente se presentan en la Tabla 31.

Tabla 31. Desviación estándar de la ordenada en el origen, pendiente y ecuación de la recta.

Terpineol

Desviación estándar ordenada en el origen 0,0012

Pendiente 0,0285

Ecuación de la recta ATerpineol/Api = 0,0285[Terpineol] – 0,0012

Con las ecuaciones indicadas en la teoría, se calcula el límite de detección y el límite de

cuantificación para el terpineol. Los resultados se indican en la Tabla 32.

Tabla 32. LOD y LOQ para terpineol.

Terpineol

LOD (ppm) 0,1263

LOQ (ppm) 0,4210

RESULTADOS 40

Al calcular el límite de cuantificaicón, hemos obtenido el límite inferior del rango lineal de

terpineol que se extiende desde 0,421 hasta 180 ppm.

PRECISIÓN

Repetibilidad

Se preparó una disolución en hexano de terpineol de 50 ppm y se añadió pi, 50 ppm. La

disolución se analizó 10 veces el mismo día, con el mismo equipo y en el mismo laboratorio.

Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 33.

Tabla 33. Relación de áreas en el cálculo de la repetibilidad de terpineol

ATerpineol Api ATerpineol/Api

7207 15484 0,4655

7196 15353 0,4687

7128 15312 0,4655

7112 15288 0,4652

7153 15227 0,4697

7319 15543 0,4709

7030 14991 0,4689

7127 15201 0,4688

7182 15394 0,4666

7297 15664 0,4659

Tanto la media como la desviación estándar de los resultados se presentan en la Tabla 34 junto

con el valor de la repetibilidad calculado.

Tabla 34. Repetibilidad terpineol.

Terpineol

Media 0,4676

Desviación estándar (S) 0,0021

Desviación estándar relativa porcentual (Sr%) 0,44 %

Precisión intermedia

Cada dos semanas se prepara una disolución de terpineol de concentración intermedia a la

que se añaden 50 ppm de 3-octanol antes de analizarla por triplicado. El resultado de los

análisis se indica en la Tabla 12 del Anexo 1.

RESULTADOS 41

Para poder aplicar ANOVA, necesitamos comprobar si las varianzas de las señales obtenidas

durante los distintos días de análisis son homogéneas. Para ello se realiza el test de Levene,

donde:

H0 = s12 = s2

2 = s3

2 = s4

2

H1 = las varianzas son distintas

Los resultados se indican en la Tabla 35.

Tabla 35. Prueba de homogeneidad de varianzas.

Estadístico de

Levene gl1 gl2 Sig.

Terpineol 3,290 3 7 ,088

Como p-valor = 0,088 > 0,05, no hay diferencias significativas entre las varianzas y se acepta

la hipótesis nula (H0). Puede hacerse ANOVA. Los resultados del análisis de varianzas se

presentan en las Tablas 36 y 37.

Tabla 36. Descriptivos de los datos de terpineol empleados para calcular la precisión intermedia.

N Media

Desviación típica

Error típico

Intervalo de confianza para la media al 95%

Mínimo Máximo

Límite inferior Límite superior

Terpineol

1 2 ,4702 ,0008 ,0006 ,4629 ,4774 ,4696 ,4707

19 3 ,4722 ,0025 ,0014 ,4661 ,4784 ,4694 ,4739

36 3 ,4677 ,0010 ,0006 ,4653 ,4701 ,4670 ,4688

52 3 ,4665 ,0012 ,0007 ,4634 ,4695 ,4657 ,4679

Total 11 ,4690 ,0028 ,0008 ,4672 ,4709 ,4657 ,4739

Tabla 37. ANOVA de un factor para y terpineol.

Suma de

cuadrados gl

Media cuadrática

F Sig.

Terpineol

Inter-grupos ,000059 3 ,000020

7,696 ,013 Intra-grupos ,000018 7 ,000003

Total ,000076 10

Considerando los valores marcados en azul en las Tablas 36 y 37, se calcula la precisión

intermedia como:

Precisión intermedia terpineol =

x 100 = 0,94%

Se obtiene un valor de precisión intermedia menor del 1 %.

RESULTADOS 42

RECUPERACIÓN

Para estudiar la recuperación, se tomaron 50 μL de AE del árbol del té y se llevaron a un

volumen final de 50 mL (Disolución 1). De la Disolución 1 se tomaron 750 μL y se llevaron a un

volumen final de 10 mL (Disolución 2). Se añadió patrón interno a la Disolución 2 (50 ppm) y se

analizó por triplicado.

Interpolando en la recta de calibrado los valores obtenidos en los cromatogramas (Tabla 13 del

Anexo 1), se determinó la cantidad de principio activo presente en la muestra.

Tabla 38. Concentración de principio activo en la muestra.

[Terpineol] (ppm)

1 45,40

2 45,30

3 45,36

Determinada la concentración de analito en la muestra, se prepara de nuevo la Disolución 2,

se añadió patrón interno en la misma concentración y se adicionó un 25 % del total de

terpineol cuantificado. Es decir, se añadieron 8 ppm de terpineol. Los resultados se indican en

la Tabla 14 del Anexo 1.

A partir de los datos obtenidos, se calculó la recuperación (Tabla 39).

Tabla 39. Factor de recuperación.

1 2 3

[Terpineol] (ppm) 54,27 53,80 54,21

Recuperación terpineol (%) 80,7 77,2 80,5

Se observa un factor de recuperación medio de 79,5 ±4,0 %, un valor menor que el obtenido

para el limoneno

RESULTADOS 43

COMPARACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS

En la Tabla 40 se recogen los valores de las distintas características analíticas calculadas tanto

para el método de determinación del limoneno como para el método de determinación del

árbol del té.

Tabla 40. Características analíticas de los métodos para la determinación de limoneno y terpineol

CARACTERÍSTICA ANALÍTICA

LIMONENO TERPINEOL

Rango lineal (ppm) 0,266-240 0,421-180

Coeficiente de regresión 0,9997 0,9997

Sensibilidad (L/mg) 0,0199 ± 0,0001 0,0110 ± 0,0001

LOD (ppm) LOQ (ppm)

0,0799 0,2663

0,1263 0,4210

Repetibilidad (Sr %) Precisión intermedia

0,29 0,43

0,44 0,94

Recuperación 97,5 % 79,5 %

Tanto el rango lineal como la sensibilidad son mayores para el limoneno que para el terpineol.

Es decir, la recta de calibrado de limoneno presenta una pendiente mayor que la recta de

calibrado de terpineol. Además la concentración de analito máxima para la que se obtiene una

respuesta proporcional, es mayor en limoneno.

El límite de detección (menor cantidad de analito que genera señal) y el límite de

cuantificación (menor cantidad que puede ser determinada de manera cuantitativa) son

menores en el limoneno.

La repetibilidad y la precisión intermedia, términos en los que se expresa la precisión, son

menores para el limoneno. Es decir, el método de cuantificación del limoneno es más preciso

que el de terpineol.

En cuanto a la recuperación, el mejor método es el del limoneno con un 97,5 % frente a un

79,5 % del terpineol.

4.3. DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS ACTIVOS EN LOS

ACEITES ESENCIALES

Una vez validado el método, se procede a determinar la cantidad de limoneno y terpineol

presentes en los aceites esenciales correspondientes. Para ello se prepararó en hexano una

disolución madre de aceite de limón y otra de aceite del árbol del té tomando 60 μL del AE en

el primer caso y 50 μL en el segundo y llevándolos a un volumen final de 50 mL. En un matraz

RESULTADOS 44

de 10 mL con pi (50 ppm) se adicionó 1 mL de la disolución madre de AE de limón y 1,5 mL de

la disolución madre de AE del árbol del té. En otro matraz de 10 mL se añadieron 750 μL de la

disolución madre de aceite del árbol del té y 500 μL de la de limón.

Al analizar los dos principios activos a la vez, el programa de temperaturas empleado en el CG-

FID, será el te terpineol por tener un mayor tiempo de retención. El programa es el siguiente:

- Empezar en 50 °C y mantener dos minutos, de 50 °C hasta 150 °C subir a 6 °C/min y en

150 °C mantener durante 5 minutos.

Cada disolución se analizó por triplicado de manera que para cada aceite se obtuvieron 6

valores recogidos en la Tabla 15 y 16 del Anexo 1.

A partir de los cromatogramas obtenidos, interpolando en las rectas de calibrado y después de

deshacer las diluciones, se obtuvieron los valores de concentración que se indican en la Tabla

41.

Tabla 41. Concentración de limoneno y terpineol en los AE de limón y árbol del té respectivamente.

Aceite esencial [Principio activo] (mg/mL)

Limón 462,0 ± 26,6

Árbol del té 822,0 ± 26,9

4.4. EFICACIA DE LA MICROENCAPSULACIÓN Y RENDIMIENTO

DEL PROCESO

Como ya se ha indicado, las microcápsulas proporcionan un medio para envasar, separar y

almacenar a escala microscópica materiales bioactivos y con una elevada volatilidad. De esta

manera se evita la pérdida, la oxidación y la reacción con otros compuestos. Además las

microcápsulas permiten la liberación gradual del compuesto activo.

En la Tabla 42 se muestran los datos utilizados en este trabajo para el proceso de

microencapsulación de los aceites esenciales.

Tabla 42. Datos del proceso de microencapsulación

ACEITE PESO

TOTAL (g) CORE

(4,4 %) (g) MATERIAL PARED (22 %) 1/3 GA (g) 2/3 MD (g)

AGUA (73,6 %) (g)

MICROCÁPSULAS (g)

Limón 100,00 4,40 7,33 14,67 73,60 11,00

Árbol del té 100,00 4,40 7,33 14,67 73,60 40,80

En la Figura 17 se observa el Spray Dryer empleado en el proceso de microencapsulado y el

producto obtenido.

RESULTADOS 45

Dentro de los indicadores para evaluar las microcápsulas se encuentra la eficacia de

encapsulación. Ésta indica la cantidad de sustancia encapsulada, dando una medida de la

eficiencia del procedimiento de microencapsulado utilizado.

Es decir, la eficacia de encapsulación es el porcentaje de principio activo (p.a) encapsulado en

relación a la cantidad inicial y se calcula siguiendo la fórmula indicada a continuación.

Eficacia (%) =

x 100 =

x 100

También se calcula el rendimiento de encapsulado con respecto al principio activo.

Rendimiento (%) =

x 100

Es importante que ambos valores sean lo más elevado posible ya que de este modo

aseguramos que la mayor cantidad de AE se ha incorporado en el microencapsulado y que la

gran mayoría de principio activo se ha quedado en el interior de la microcápsula.

La cuantificación se llevará a cabo utilizando el método cromatográfico.

El procedimiento para calcular la eficacia y el rendimiento se divide en dos partes

1) EXTRACCIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO SUPERFICIAL DE LA MICROCÁPSULA (AEs)

Con el fin de determinar la concentración de principio activo presente en el aceite que ha

quedado en la superficie de las microcápsulas, se llevará a cabo un lavado de las mismas. El

disolvente empleado será hexano, quedando el diclorometano totalmente descartado debido

Figura 17. Mini Spray Dryer empleado en la microencapsulación y producto obtenido.

RESULTADOS 46

a que disuelve, en parte, las microcápsulas según la bibliografía consultada y la experiencia del

grupo de investigación.

Por otro lado, esta memoria es una continuación de un proyecto de investigación, por lo que el

método de extracción del pa ya está optimizado.

Se pesan 0,3000 g de microcápsulas, se adicionan 10 mL de hexano y se agita durante 15

minutos a temperatura ambiente en un agitador mecánico con rotación horizontal SBS.

Transcurrido el tiempo indicado, se filtra el contenido del tubo sobre papel de filtro en un

matraz de 5 mL que contenía 50 ppm de 3-octanol. El proceso se realiza por triplicado y cada

muestra se cuantifica tres veces. Los datos se recogen en las Tablas 17 y 18 del Anexo.

2) EXTRACCIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO TOTAL DE LA MICROCÁPSULA (AEt)

Se pesan 0,1500 g de muestra y se añaden 1,50 mL de agua desionizada calentada a 60 °C. Se

agita la mezcla en un vortex hasta que el material pared quede totalmente disuelto. A

continuación se adicionan 10 mL de hexano y se agita en un agitador mecánico con rotación

horizontal SBS durante 30 minutos. Se deja enfriar hasta que las fases queden separadas y se

realiza la extracción. El líquido se filtra con filtros de membrana de nylon de 0,45 μm para

eliminar el posible exceso de sólido de los polímeros. Se toman 0,5 mL se añaden a un matraz

de 5 mL que contiene ya patrón interno (50 ppm) y se enrasa con hexano. El proceso se repite

dos veces más y cada muestra se analiza por triplicado. En las Tabla 19 y 20 del Anexo se

encuentran los datos de los cromatogramas.

La diferencia ente el aceite total y el aceite superficial se corresponde con el aceite que queda

en el interior de la microcápsula (AEi).

Los valores del rendimiento y la eficacia así como la cantidad de patrón en la superficia, en el

interior y en la microcápsula en total se indican en la Tabla 43.

Tabla 43. Rendimiento y eficacia del proceso de microencapsulado.

p.a en AEs (μg/g) p.a en AEt (μg/g) p.a en AEi (μg/g) Rendimiento Eficacia

Limoneno 93,5 ± 17,5 54281,4 ± 1742,9 54187,9 ± 1757,0 24,8 % * 99,8 %

Terpineol 264,4 ± 13,3 35626,0 ± 2103,7 35361,6 ± 2114,3 36,4 % * 99,3 %

* Para el cálculo del rendimiento necesitamos conocer la cantidad de compuesto activo que se

ha añadido en el proceso de microencapsulado y la cantidad del mismo que se ha quedado en

las miscrocápsulas, tanto en el interior como en la superficie.

El ejemplo se hará con el aceite de limón.

- Densidad AE limón: 0,85 g/mL

- Masa de AE añadido: 4,4 g

- Volumen AE añadido:

= 5,18 mL de AE añadidos en la preparación de

microcápsulas.

RESULTADOS 47

En el AE hay 464,31mg/mL de limoneno, en las microcápsulas habrá:

461,98 mg/mL x 5,18 mL = 2393,06 mg = 2,4 g de limoneno añadido en el proceso.

Si tenemos 54281 μg/g de limoneno en la microcápsula y se obtuvieron 11 g de

microcápsulas; la cantidad de limoneno total será 11 g x 54281 μg/g = 597091 μg limoneno

= 0,597 g limoneno dentro.

De modo que,

Rendimiento =

x 100 = 24,8 %

4.5. LIBERACIÓN DEL COMPUESTO ACTIVO

El proceso de microencapsulado permite liberar los compuestos activos de manera gradual y

bajo condiciones controladas.

Con la intención de establecer la velocidad de liberación de los compuestos activos, se ha

realizado un nuevo ensayo. En él, una vez se ha determinado la cantidad de compuesto activo

en el interior de las microcápsulas en el día 1, las muestras (que se mantenían precintadas y en

botes) se dejaron expuestas a Tª ambiente. Cada 15-20 días se realizaban nuevas medidas

repitiendo lo procesos de extracción del principio activo tanto del interior de la microcápsula

como del total.

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 44 y la Figura 18.

Tabla 44. Cantidad de principio activo liberado

Día 1 Día 22 Día 38 Día 50

Limoneno interior (mg/g) 54,19 37,64 14,02 3,37

Limoneno liberado (mg/g) 0,00 16,55 40,17 50,82

Terpineol interior (mg/g) 35,36 24,45 16,46 3,33

Terpineol liberado (mg/g) 0,00 10,91 18,90 32,03

RESULTADOS 48

Figura 18. Porcentaje de principio activo liberado.

La velocidad a la que se libera el principio activo durante los primeros días (hasta el día 22) es

similar para ambos principios activos. De hecho, el porcentaje para limoneno y terpineol es del

30 %. Entre el día 22 y el día 38, hay una variación. Se ha liberado un mayor porcentaje de

limoneno que de terpineol, 74 % frente a 53 % del total. Sin embargo, en la última medida los

porcentajes se vuelven a igualar, obteniendo un 93 % para limoneno y un 90 % para terpineol.

Limoneno

Terpineol

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Día 1 Día 22 Día 38 Día 50

% C

om

pu

est

o a

ctiv

o li

be

rad

o

Limoneno

Terpineol

5. CONCLUSIONES

RESULTADOS 50

Las principales conclusiones obtenidas de este trabajo son las siguientes:

1. Dentro de los componentes identificados por CG-MS en el aceite esencial de limón

destacan 3-careno, -Pineno y Limoneno; siendo este último el mayoritario y en el que

nos hemos centrado.

2. Para el aceite del árbol del té, los componentes que se encontraron al realizar los análisis

pertinentes fueron ϒ-Terpineno, 2-Careno, -Pineno y Terpinen-4-ol; entre los que

destaca el Terpinen-4-ol.

3. Al llevar a cabo la validación del método se obtuvieron valores aceptables en todas las

características analíticas calculadas tanto en el caso del limoneno como en el del

terpineol. Los coeficientes de correlación lineal son mayores de 0,999; los límites de

detección y cuantificación están por debajo de 0,5 ppm y la repetibilidad, calculada como

desviación estándar relativa porcentual, es inferior a 3 %. Sin embargo, el método

analítico utilizado para cuantificación de limoneno es más sensible (0,0199 ± 0,0001 L/mg)

que el empleado con el terpineol (0,0110 ± 0,0001 L/mg).

4. En el análisis cuantitativo realizado para determinar la cantidad de los principios activos

en los aceites esenciales empleados, se han obtenido 464,3 ± 26,6 mg/mL para limoneno

y 814,6 ± 26,9 mg/mL para terpineol.

5. En el estudio de las microcápsulas los rendimientos obtenidos son bajos (24,3 % para el

limoneno y del 36,2 % para el terpineol), pero la eficacia para ambos principios activos es

superior al 99%.

6. En el estudio de la liberación del principio activo con el tiempo, los porcentajes obtenidos

en el último análisis (día 50), son del 93 % para el limoneno y del 90 % para el terpineol,

observándose, prácticamente, la total liberación del principio activo.

ANEXO 1

1 ANEXO 1

Tabla 1. Señal obtenida en la determinación del rango lineal.

[Limoneno] (ppm)

ALimoneno Api ALimoneno/Api

9,94

2812 8683 0,3239

1156 4781 0,2419

1324 5737 0,2308

59,61

4753 5301 0,8966

5774 6546 0,8821

5499 5855 0,9393

119,23

15867 6379 2,4875

15454 5915 2,6128

15230 5661 2,6905

178,84

17186 6228 2,7594

16322 5507 2,9640

16696 7169 2,3289

238,45

5833 20570 3,5264

6830 22592 3,3078

6364 22056 3,4657

298,07

28168 5707 4,9355

28916 5910 4,8926

30603 6551 4,6716

2

Tabla 2. Datos obtenidos para la recta de calibrado de limoneno.

[Limoneno] (ppm)

ALimoneno Api ALimoneno/Api

0,50

124 13821 0,0090

123 13843 0,0089

124 14009 0,0089

2,98

769 12794 0,0601

757 12929 0,0585

755 12829 0,0589

6,95

1884 13507 0,1395

1877 13510 0,1389

1885 13448 0,1402

9,94

2554 13671 0,1868

2599 13901 0,1870

2597 13879 0,1871

29,81

7201 12269 0,5869

7136 12099 0,5898

7159 12129 0,5903

49,68

12578 13106 0,9597

12828 13281 0,9659

12793 13325 0,9601

73,52

19386 12056 1,6081

18890 11812 1,5993

19312 12094 1,5969

99,36

24508 12411 1,9747

25933 13101 1,9795

26701 13421 1,9894

3

Tabla 3. Señales obtenidas para las distintas concentraciones de las rectas de limoneno en hexano.

[Limoneno] (ppm)

0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

1 0,0181 0,0375 0,0789 0,1149 0,2004

2 0,0177 0,0369 0,0746 0,1146 0,2011*

3 0,0182 0,0383 0,0742* 0,1144 0,1998

4 0,0178 0,0370 0,0746 0,1149 0,2009

5 0,0178 0,0374 0,0743 0,1154 0,2010

6 0,0192 0,0385 0,0739* 0,1166 0,2016

7 0,0167 0,0365 0,0746 0,1168 0,2016

8 0,0189 0,0387 0,0745 0,1154 0,2029*

9 0,0169 0,0371 0,0611* 0,1167 0,2028

10 0,0193 0,0374 0,0751 0,1158 0,2016

* Los valores marcados con un asterisco se descartaron.

Tabla 4. Pendiente y ordenada en el origen de cada recta diluida de limoneno.

Recta Pendiente Ordenada

1 0,0486 -0,0029

2 0,0389 -0,0018

3 0,0404 -0,0027

4 0,0409 -0,0045

5 0,0409 -0,0043

6 0,0407 -0,0021

7 0,0414 -0,0053*

8 0,0385 -0,0003*

9 0,0414 -0,0044

10 0,0409 -0,0035

MEDIA 0,0413 -0,0033

DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,0026 0,0011

* Los valores marcados con un asterisco no se tuvieron en cuenta a la hora de calcular la

media y la desviación estándar.

4

Tabla 5. Datos para calcular la precisión intermedia de limoneno.

Día ALimoneno/Api

1

0,8284

0,8302

19

0,8363

0,8335

0,8310

36

0,8304

0,8297

0,8310

52

0,8351

0,8341

0,8320

Tabla 6. Relación de áreas para limoneno antes de la adición. Valores de la ecuación de la recta.

ALimoneno Api ALimoneno/Api Ordenada Pendiente

17594 15931 1,1044

-0,0053 0,0199 17945 16155 1,1108

17828 16079 1,1088

Tabla 7. Datos para el limoneno tras la adición del principio activo.

ALimoneno Api ALimoneno/Api Ordenada Pendiente

23666 17175 1,3780

-0,0053 0,0199 23344 16910 1,3804

23875 17078 1,3980

5

Tabla 8. Datos obtenidos para la determinación del rango lineal.

[Terpineol] (ppm) ATerpineol Api ATerpineol/Api

10,04

1281 8437 0,1519

1558 8507 0,1831

2012 9265 0,2171

60,26

5145 7402 0,6950

5070 7018 0,7224

6271 9707 0,6460

120,53

10503 8058 1,3034

11845 9380 1,2628

12071 9645 1,2515

180,79

21667 11464 1,8900

16507 8767 1,8829

19967 10365 1,9263

241,06

21854 9313 2,3466

22498 9571 2,3506

19391 9014 2,1513

301,32

21434 6411 3,3434

22570 6322 3,5700

22253 6837 3,2549

6

Tabla 9. Datos obtenidos para la recta de calibrado de terpineol.

[Terpineol] (ppm) ATerpineol Api ATerpineol/Api

1,00

159 12269 0,0129

142 12099 0,0117

149 12129 0,0123

3,01

465 13671 0,0340

462 13901 0,0332

461 13879 0,0332

7,03

1036 12411 0,0835

1088 13101 0,0831

1116 13421 0,0831

10,04

1618 12056 0,1342

1579 11812 0,1336

1630 12094 0,1347

30,13

4013 13821 0,2903

4008 13843 0,2895

4053 14009 0,2893

50,22

7343 13106 0,5603

7485 13281 0,5636

7441 13325 0,5585

74,33

11132 13507 0,8241

11196 13510 0,8287

11198 13448 0,8327

100,44

14132 12794 1,1046

14435 12929 1,1165

14262 12829 1,1117

7

Tabla 10. Relación de áreas para las distintas concentraciones de terpineol en hexano.

[Terpineol] (ppm)

0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

1 0,0167 0,0349 0,0663 0,1041 0,1789

2 0,0197 0,0351 0,0674 0,1040 0,1778

3 0,0157 0,0364 0,0659 0,1026 0,1771

4 0,0151 0,0354 0,0662 0,1008 0,1757

5 0,0151 0,0348 0,0660 0,1010 0,1751

6 0,0161 0,0361 0,0646 0,1005 0,1745

7 0,0168 0,0346 0,0647 0,0998 0,1759

8 0,0160 0,0353 0,0661 0,0980 0,1758

9 0,0151 0,0352 0,0654 0,1000 0,1735

10 0,0173 0,0347 0,0654 0,1001 0,1755

Tabla 11. Pendiente y ordenada en el origen de las rectas de terpineol en hexano.

Recta Pendiente Ordenada

1 0,0287 -0,0081

2 0,0282 -0,005

3 0,0282 -0,0063

4 0,0291 -0,0082

5 0,0283 -0,0067

6 0,0292 -0,0088

7 0,0279 -0,0057

8 0,0283 -0,0072

9 0,0285 -0,0075

10 0,0284 -0,0072

MEDIA 0,0285 -0,0071

DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,0004 0,0012

8

Tabla 12. Datos empleados para calcular la precisión intermedia.

Día ATerpineol/Api

1

0,4707

0,4696

19

0,4694

0,4739

0,4734

36

0,4673

0,4670

0,4688

52

0,4679

0,4657

0,4658

Tabla 13. Valores de las áreas de terpineol y patrón interno antes de añadir el principio activo.

ATerpineol Api ATerpineol/Api Ordenada Pendiente

8589 16949 0,5068

0,0074 0,0111 8637 17078 0,5057

8534 16855 0,5063

Tabla 14. Relación de áreas terpineol/3-octanol tras la adición de terpineol.

ATerpineol Api ATerpineol/Api Ordenada Pendiente

9625 15783 0,6098

0,0074 0,0111 9345 15458 0,6045

9623 15796 0,6092

9

Tabla 15. Datos empleados para determinar la concentración de limoneno en el aceite esencial de limón.

[AELimón] ALimoneno Api ALimoneno/Api Interpolación [Limoneno]Final (mg/L)

[Limoneno]Final

(mg/mL)

50 ppm

8768 16788 0,5223 26,51 ppm 449323 449,32

8927 17067 0,5231 26,55 ppm 450024 450,02

8845 16903 0,5233 26,56 ppm 450203 450,20

100 ppm

17594 15931 1,1044 55,77 ppm 472592 472,59

17945 16155 1,1108 56,08 ppm 475293 475,29

17828 16079 1,1088 55,98 ppm 474442 474,44

MEDIA

41,24 ppm 461980 461,98

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

13319 13,32

Tabla 16. Relación de áreas empleadas para calcular la concentración de terpineol en el aceite esencial correspondiente.

[AETerpineol] ATerpineol Api ATerpineol/Api Interpolación [Terpineol]Final (mg/L)

[Terpineol]Final

(mg/mL)

75 ppm

8589 16949 0,5068 45,40 ppm 810671 810,67

8637 17078 0,5057 45,30 ppm 808981 808,98

8534 16855 0,5063 45,36 ppm 809943 809,94

150 ppm

17330 16678 1,0391 93,79 ppm 837409 837,41

17084 16575 1,0307 93,03 ppm 830628 830,63

17407 16814 1,0353 93,44 ppm 834299 834,30

MEDIA

821988 821,99

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

13464 13,46

10

Tabla 17. Datos para determinar la cantidad de limoneno superficial en la microcápsula.

Muestra Pesada/g ALimoneno Api ALimoneno/Api Interpolación μg/g

1 0,3022

1170 20851 0,0561 3,08 103,11

1190 20735 0,0574 3,15 105,27

1173 21138 0,0555 3,05 102,09

2 0,3003

958 22378 0,0428 2,42 81,34

935 20884 0,0448 2,52 84,66

946 21069 0,0449 2,52 84,85

3 0,2994

1070 22003 0,0310 2,71 91,46

1131 22350 0,0305 2,81 94,74

1086 21691 0,0306 2,78 93,87

MEDIA

93,49

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

8,74

Tabla 18. Datos para calcular la cantidad de terpineol superficial en la microcápsula.

Muestra Pesada/g ATerpineol Api ATerpineol/Api Interpolación μg/g

1 0,3043

1817 19605 0,0927 7,75 257,27

1802 19558 0,0921 7,70 255,71

1793 19508 0,0919 7,68 255,02

2 0,297

2029 21555 0,0941 7,88 268,11

2063 21604 0,0955 8,01 272,43

2130 22464 0,0948 7,95 270,26

3 0,291

1840 20009 0,0920 7,69 266,83

1815 19620 0,0925 7,74 268,51

1833 20000 0,0916 7,66 265,84

MEDIA

264,44

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

6,63

11

Tabla 19. Datos para calcular la cantidad de limoneno total en la microcápsula.

Muestra Pesada/g ALimoneno Api ALimoneno/Api Interpolación μg/g

1 0,1502

26534 17755 1,4944 75,36 50175,87

26493 17770 1,4909 75,19 50056,70

26506 17736 1,4945 75,37 50177,13

2 0,1496

29185 17945 1,6263 81,99 54807,61

28812 17767 1,6216 81,76 54649,71

29045 17858 1,6265 82,00 54811,38

3 0,1497

26032 15981 1,6289 82,12 54856,66

27401 16840 1,6272 82,03 54798,39

26555 16201 1,6391 82,63 55199,28

MEDIA

53281,41

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

2363,34

Tabla 20. Datos para calcular la cantidad de terpineol total en la microcápsula

Muestra Pesada/g ATerpineol Api ATerpineol/Api Interpolación μg/g

1 0,1501

11892 19420 0,6124 55,00 36640,72

11963 19622 0,6096 54,75 36475,15

11877 19426 0,6114 54,91 36579,56

2 0,1549

12445 21015 0,5922 53,16 34321,82

12454 21082 0,5907 53,03 34234,63

12500 21138 0,5914 53,09 34272,45

3 0,1484

11977 19921 0,6012 53,98 36376,43

11908 20167 0,5905 53,01 35719,69

12132 20379 0,5953 53,44 36013,69

MEDIA

35626,01

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

1051,85