2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
2 Alteraciones cromosómicas
Técnicas de diagnóstico molecular para la
detección de anomalías cromosómicas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Citogenética molecular
Hibridación fluorescente in situ (FISH)
– FISH en metafase
– FISH en interfase
Cariotipo espectral (SKY)
Hibridación genómica comparada (CGH)
Otras técnicas:
– FISH en hebra (Fiber FISH)
– Mapeo óptico
– Microdisección de cromosomas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Conceptos básicos
Compactación y estructura de la cromatina
Mutaciones y polimorfismos
– genómicas,
– cromosómicas y
– génicas
Cariotipos convencionales
Mapeo de cromosomas: nomenclatura
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Tipo de muestra
! Diagnóstico genético preimplantatorioen técnicas de reproducción asistida
Células de la médula ósea
Células fetales en líquidoamniótico o vellosidades
coriónicas
Células embrionarias
Sangre (o células mucosabucal)
Aplicaciones
Técnicas de diagnóstico molecular para ladetección de anomalías cromosómicas
! Evaluar a una pareja conantecedentes de abortos o infertilidad
! Evaluar una apariencia anormal delcuerpo que sugiere una anomalíagenética
! Análisis en casos de leucemia ylinfomas (el cromosoma Filadelfia estápresente en el 85% de los casos de LMC)
! Diagnóstico prenatal para evaluaranomalías cromosómicas en un fetoen desarrollo
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Biopsia médula ósea
Toma de muestra
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Diagnóstico prenatal
Toma de muestras
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Diagnóstico preimplantatorio
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Genoma humano
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Cromosoma
Mil
lon
es
de
pa
res
de
ba
se
sComplemento haploide:
2,9 Gbases
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Organizacióndel ADN
Niveles de enrollamiento:
Doble hélice 2 nm
Nucleosomas 11 nm
Solenoides 30 nm
Bucles de cromatina 300 nm
Cromátide 700 nm
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Lazo de ADN Esqueleto proteico
El ADN de una célula “mide” 2 metros
Microfotografía de un cromosoma sin histonas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Organización del ADN
Heterocromatina
– ADN compacto poco accesible a la transcripción
Eucromatina
– ADN más laxo que permite la transcripción
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Alteraciones en el ADN
Un cambio heredable en la secuencia de ADN es una
mutación o un polimorfismo.
Mutación: cambio presente en una pequeña proporción de
la población (variante) o del organismo.
Polimorfismo: cambio presente en al menos un 1% de la
población.
No tienen por qué producir efectos en el fenotipo.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Mutaciones
Génicas
– Afectan a un único gen y frecuentemente son cambios
pequeños en el ADN
Cromosómicas
– Afectan a la estructura de uno o varios cromosomas
Genómicas
– Cambios en el número de cromosomas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Anomalías cromosómicas
Numéricas: afectan al número de cromosomas.
Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de partedel material genético
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Alteraciones cromosómicasestructurales
Duplicación
Deleción
Inversión
Translocación
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Alteraciones cromosómicasestructurales
CROMOSOMA MARCADOR
Fragmento sin
identificar
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Ejemplo de translocación
Esquema de la translocación(9;22) que da origen alcromosoma Filadelfia en laleucemia mieloide crónica
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Anomalías cromosómicas
" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)
" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía (4n)
Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de partedel material genético
Numéricas: afectan al número de cromosomas.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Anomalías cromosómicas
" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Frequencia de trisomíasen abortos espontáneos
Down
EdwardsPatau
Aneuploidías
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Riesgo de trisomía 21con la edad materna
Aneuploidías
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Síndrome de Turner:única monosomía viable
45,X
Falta de desarrollo decaracterísticas sexualessecundarias.
Cuello ancho (doble tejidoconectivo a los lados del cuello)
Pecho ancho “Anormalidadesrenales y cardiovasculares.
No afecta el IQ pero existe ciertogrado de inmadurez ycomportamiento infantil.
Aneuploidías
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Individuo triploide
" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía(4n)
Cariotipo 69,XXX
Poliploidías
Letal
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Visualización
Tinciones convencionales tiñen específicamente el ADN
– T. de Feulgen
– T. de Wright
– Hematoxilina
– DAPI (fluorescente)
Existen tinciones que específicamente marcan distintas regiones de los
cromosomas
– bandeo Q
– bandeo G
– bandeo R
– bandeo C
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
! Las células deben estar endivisión
! Deben pararse en metafase
! Deben someterse a choqueosmótico para conseguirbuena separación de loscromosomas
! Hay que fijarlas
! Deben teñirse loscromosomas para que seanidentificables
Importante: máximas condiciones de esterilidad
Requisitos para el estudio del cariotipo
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Método de estudio del cariotipo
1) Toma de sangre periférica y separación de los glóbulos blancos(linfocitos T)
2) Incubación en presencia de productos que inducen a la mitosis(mitógenos) tales como la fitohemoaglutinina
3) Detención de la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, queinterfiere en la polimerización de los microtúbulos del huso mitótico)
4) Paso por un medio hipotónico que hace que las células se hinchen
5) Depositar una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el cualse hace presión para dispersar los cromosomas)
6) Fijar, teñir y fotografiar los núcleos estallados (10-15; 30 en mosaicos)
7) Antes había que ampliar la fotografía y recortar y ordenar loscromosomas. Hoy en día existen aparatos de captación y programas deanálisis que elaboran el cariotipo automáticamente.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cariotipo
Representación ordenada de los cromosomas de un
individuo atendiendo a su número, forma y tamaño
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Métodos de tinción
Tiñe las regiones organizadorasdel nucléolo
Tinción con nitrato de plataNOR
Resaltan las regionescentroméricas
Extracción de DNA/proteínas,tinción con Giemsa
C
Resaltan las regionesteloméricas
Varias técnicasT
Patrón inverso al Q y G, útilpara definir los extremos de
los cromosomas
Naranja de acridina, Giemsamodificado
R
Las bandas G oscurascorresponden a las Q brillantes
Tinción con Giemsa, tras pre-tratamiento del cromosoma
con tripsina
G
Bandas fluorescentes brillantesTinción con quinacrinaQ
CaracterísticasMétodoBandeo
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Ejemplos de bandeo
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Bandeo G
Más habitual
Se tratan previamente con
tripsina antes del Giemsa
400 bandas por genoma,
cada banda de 5 a 10 Mb
Heterocromatina en las
bandas oscuras.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cariotipo de alta resoluciónTinción de los cromosomas en profase o en metafase
temprana (más largos y finos).
Permite distinguir el doble de bandas (800).
Se añade metotrexato además de colchicina antes de la
tinción con Giemsa.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Tipos de cromosomas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Tipos de cromosomas
Ejemplos
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Ideograma
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Nomenclatura
P brazo corto (petite)
q brazo largo
del deleción
inv inversión
dup duplicación
ins inserción
+ ganancia
- pérdida
I,iso isocromosoma
r cromosoma en anillo
t translocación
tel telómero
ISCN: International System for Human
Cytogenetic Nomenclature
http://www.iscn1995.org/
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Fórmulas cromosómicas
46,XX
46,XY
47,XXY
47,XX,+21
46,XY,19p+
46,XX,del(7)(q13)
46,XY,t(5;17)(p13.3;p13)
46,X,i(X)
48,XX,+15,+16 [8]/46,XX [27]
Corrector de sintaxis:
http://www.mcndb.org/iscn/index.jsp
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Fluorescent In Situ
Hybridization: FISHHibridación in situ fluorescente
Es la detección de sondas fluorescentes
altamente específicas que se han
hibridado a cromosomas en interfase o
metafase.
Las sondas de ADN pueden marcarse
con moléculas fluorescentes (método
directo) o no fluorescentes que se
detectan con anticuerpos fluorescentes
(método indirecto).
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH
Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.
Después se tiñen los núcleos con un color de
contraste inespecífico (generalmente DAPI).
Finalmente se visualiza en el microscopio.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Protocolo básico
Los portaobjetos con los núcleos fijados:
1 Desnaturalización del ADN (70% en formamida).
2 Se añade la sonda, se cubre y se sella. Se incuba de 2 a
12 horas a 37º.
3 Se quita el cubre y se lava con detergente y sales.
4 Se añade colorante para el fondo.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en metafase
Tipos de sonda:
– Cósmidos
– Satélites alfa
– Sondas completas
(painting probes)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
Cósmidos:
– Secuencias únicas que
hibridan en segmentos
pequeños
– Se usan en estudios de
microdeleciones
Sonda de 1,4 kb cromosoma 11
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
Sonda específicapara el síndromeWilliams-Beuren(Elastina: 7q11.23)y control
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
Sonda específica(22q11.2) para elsíndrome diGeorge:microdelecióncromosoma 22Control (22q13)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
Sondas consecuenciacentromérica ytelomérica delcromosoma 12
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
Sonda consecuenciatelomérica delcromosoma 4q
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas específicas
FISH de bandamulticolor
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas satélite
Satélites alfa:
– Sonda formada por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de los centrómeros.
– En la mayoría de los casos son específicos para cada cromosoma
– Se usan para determinar aneuploidías o para identificar el origen
de cromosomas marcadores.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas satélite
Sondas para
cromosomas 14 y 22:
se detecta un
cromosoma marcador
dicéntrico
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas satélite
Sonda para secuencia Alu
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas completasSonda para el cromosoma 1
Sonda para el cromosoma 19.Marca el extremo de otrocromosoma identificando elmaterial de un cromosomamarcador.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas completas
Caso de una translocación
desequilibrada, una porción del
brazo 4 reemplaza el extremo
del cromosoma 1
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Sondas completas
sonda
cromosoma 1
sonda
cromosoma 4
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase
No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para poder
realizar el FISH.
Normalmente cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra
en interfase, con los cromosomas descondensados.
De todas maneras es posible realizar el FISH aunque los resultados no
sean tan específicos. Se utiliza sobretodo para detectar aneuploidías o
grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales
o tumorales
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase
DXZ1 DYZ3 D18Z1
X
Y
1818
Metafase Interfase
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:aneuploidías
Aneuploidías en células embrionarias
1ª ronda
– sonda 13
– sonda 21
2ª ronda:
– sonda 18
– sonda X
– sonda Y
Feto varón normal*
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:aneuploidías
Aneuploidías en células embrionarias
1ª ronda
– sonda 13
– sonda 21
2ª ronda:
– sonda 18
– sonda X
– sonda Y
Feto femenino con trisomía 21
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones recíprocas
46,XY 46,XX,t(12;17)(p13;p13)
sondas subteloméricas y centroméricas
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones recíprocas
Primero se prueban las sondas en linfocitos de ambos
progenitores para comprobar su correcta hibridación
tel 12
tel 17
ctr 17
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones recíprocas
tel 12
tel 17
ctr 17
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones recíproca
tel 12
tel 17
ctr 17
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones recíprocas
tel 12
tel 17
ctr 17
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en linfocitos:
186 93%
7 3,5%
5 2,5%
1 0,5%
1 1,5%
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en interfase:traslocaciones robertsonianas
Robertsonian translocation der(13;21)(q10;q10)
miscarriage
chromosome 13
chromosome 21
male female
Carrier Normal
Down syndrome Carrier Down syndrome Normal
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
SKY (Spectral Karyotyping) es una técnica que permite
visualizar los 23 pares cromosomas a la vez teñidos con
diferentes sondas fluorescentes.
Se utiliza sobre todo en el estudio de células tumorales. Las
sondas para cada cromosoma es de un color (o
combinación; solo hay 5 colores) distinto.
Se utilizan programas informáticos para analizar las
imágenes y formar el cariotipo.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes
Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes
Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
Traslocación entre el 1 y el 11
Traslocación entre el 4 y el 12
Trisomía parcial del extremo 4q
(derivativo)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
Traslocación entre el 2 y el 22
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH multicolor: SKY
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en hebra
Fiber FISH o Halo FISH
Es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el
fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar.
Permite distinguir pequeñas reorganizaciones sin tener que
clonar y secuenciar (habitualmente hasta 20 pb).
Se forman rosarios debido a las roturas de las hebras de
cromatina y el enrollamiento de los extremos.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en hebra
Al extenderse se consigue un 130% de su tamaño teórico
34 µm / 1 kb
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH en hebra
Se usa bastante para detectar deleciones en
clones o para estimar huecos en los proyectos
genoma
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Microdisección decromosomas y FISH inverso
Se puede recortar un fragmento de cromosoma por
micromanipulación (láser y micropipetas) teñido con
Giemsa o con una sonda.
Esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva
sonda.
Se utiliza para detectar el origen de un ADN marcador o
fabricar sondas inespecíficas que hibriden con
determinada región.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Microdisección decromosomas y FISH inverso
1 aislamiento del cromosoma marcador y marcaje
2 hibridación con linfocito de donante sano: es un
fragmento del cromosoma 16 (16)(p13.1!q12.2)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Microdisección decromosomas y FISH inverso
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Búsquedas bibliográficas: Pubmed/ISI Web of knowledge
Artículos / revisiones
Índice de impacto
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2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
Comparative genomic hybridization
Detecta pérdida o duplicación de regiones genómicas.
Es un FISH de dos colores.
Se utiliza sobretodo para determinar las reorganizaciones
cromosómicas de las células tumorales y predecir la
severidad del cáncer. No requiere cultivo de las células.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
1 El ADN-M del tejido a estudiar se marca con un
fluorescente (usualmente verde; Cy3 550 nm).
2 ADN-C de un tejido con un cariotipo normal se marca con
otro fluorescente (rojo; Cy5 660 nm).
El marcaje se realiza por desplazamiento de mella (nick-
translation )
3 Una misma cantidad de ADN de cada muestra se hibrida
con metafases de células normales (linfocitos).
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
1 Si no existe reorganización de la zona la
relación entre ambas sondas será 1:1
2 Si el ADN-M presenta una duplicación habrá
proporcionalmente más sonda marcada y el
cromosoma fijado teñirá de verde.
3 Si el ADN-M presenta una deleción habrá
proporcionalmente menos sonda y el
cromosoma fijado teñirá de rojo
Requiere de software específico y experiencia
del operador.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
DAPI
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
Cy3
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
Cy5
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
Superposición
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH: una metafase
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH: 8 metafases
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH: 8 metafases
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
CGH: limitaciones
Detecta bien deleciones y duplicaciones.
Es ineficaz para detectar traslocaciones o inversiones.
Depende de la población de células originales, si hay
mosaicismo la detección se verá contaminada por
contaminación (>50%).
La sensibilidad es de alrededor de las 2-20 Mb
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
La resolución es mucho mayor hasta 150 kb o incluso genes.
Celdillas de fragmentos genómicos conocidos (BAC, cDNA,
oligonucleótidos) inmobilizados sobre una superficie
sustituyen la metafase del CGH. Aumenta por tanto el
número de copias diana.
Puede distinguir con precisión los puntos de corte de las
alteraciones cromosómicas.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
Se suele añadir ADN Cot-1
Es ADN de origen placentario de 50
a 300 pb enriquecido en
secuencias repetitivas (Alu o
Kpn).
Se usa para bloquear hibridación
no específica en los microarrays.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
Se analizan 120 x 60 = 7200 fragmentos
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
Los microarrays se
preparan a partir
de clones
genómicos:
BACs o YACs
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
El tipo de clon nos
va a limitar la
sensibilidad y el
tipo de
resultados
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
Se suele representar la señal en forma de perfil lineal.
Control normal 46XX
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
El marcaje de XX sobre XY permite distinguir el doble
cromosoma X
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Array CGH
Deleción en 7q11.23 heterocigoto
Flecha indica fluorescencia reducida en 3 BACs
Zona gris indica el centrómero
FISH de confirmación:
sonda verde BAC gen LIMK1,
sonda roja BAC 7q11.21
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Aplicaciones clínicas FISH
Preparación del tejido diana FISH SKY CGH CGHa
Metafase + + + +
Interfase + - + +
Cultivo previo -/+ + - -
Anomalías cromosómicas
Aneuploidías + + + +
Traslocaciones eq, inversiones + +/- - -
Microdeleciones/duplicaciones + - - +
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Suele haber alteraciones cromosómicas en las células
somáticas. Algunas son heredables entre generaciones y
pueden causar predisposición al cáncer.
Las alteraciones cromosómicasa son marcadores diagnósticos
y de valor pronóstico.
La evaluación citogenética molecular de los cánceres es de
gran importancia.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
el cáncer surge tras una acumulación de mutaciones que
confieren a la célula una ventaja selectiva puntual
Muchos tumores exhiben altos niveles de inestabilidad
genómica.
¿Son estas mutaciones cromosómicas causas o efectos del
cáncer?
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Existen determinadas traslocaciones asociados a cánceres
específicos
– Sobreexpresión o desregulación de un protooncogen porque se une
a un fuerte promotor o enhancer.
– Generación de una gen quimera que codifica una proteína de
fusión desregulada
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Sobreexpresión de BCL2 debido al enchancer IG en un
linfoma folicular
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Linfoma de Burkitt
- non Hodgkins
- Cancer agresivo de células B
- también aparece en el
mieloma múltiple
Traslocación IG-MYC
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Un FISH con dos sondas específicas es suficiente
para distinguir la traslocación IG-MYC
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Esquema de la translocación(9;22) que da origen alcromosoma Filadelfia en laleucemia mieloide crónica
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Normal 2 + 2
Proteína de fusión BCR-ABL
Fusíon 1 + 1 + 2
2 + 2 + 1
1 + 1 + 1
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Proliferación
Apoptosis
Estabilidad genómica
Angiogénesis
Invasión
Metastasis
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Origen de los cromosomas marcadores de una línea tumoral
de cáncer de mama.
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Perdida del der(17)
Dos zonas de
amplificaciónTraslocación 17;22
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Amplificación. Células de un cáncer de mama.– sonda verde cromosoma 17 (centrómero)– sonda roja gen HER2/ERBB2 (17q11.2-q12)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Amplificación.
– De 100 a 1000 kb pocas veces incluyen un único gen
– Sobreexpresión y se asocia con mala prognosis o estadío final
– Dos formas:
• Partículas pequeñas (double minutes DMs)
• Regiones de tinción homogénea (homogeneously staining
regions HSR
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Amplificación. Glioblastoma (DMs)– sonda verde cromosoma 17– sonda roja gen EGFR (17q25)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)– sonda amarilla gen MLL (11q23)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)– sonda amarilla gen MLL (11q23)
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Las reorganizaciones suelen implicar a genes relacionados con el cáncer.
Linfoma de células B alargadas/difusas
IL6R,MCL1, SKI REL MYC
ABL,TAN1 CDK2,GLI,SAS,CDK4,MDM2
IL4R BCL2 SIS,YES2
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
En los estadíos avanzados y de mal pronóstico se acumulan las anomalíascromosómicas.
GGH de linfoma de Hodgkin
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
Combinación
restricción
PCR y
array de CGH
para detectar
patrones de
metilación en células
de cáncer de pulmón
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
Cáncer
El gen
MINT26 está
metilado en
las células de
este tumor
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH bases de datos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/
Base de datos de resultados de SKY y CGH
2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético
FISH bases de datos