Date post: | 16-Sep-2015 |
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OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS A TRAVS
DEL MICROSCOPIO
El Microscopio
El microscopio (de micro-, pequeo, y scopio, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista.
El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico.
UNIDAD
1 TIPOS DE MICROSCOPIOS Clasificacin:
Segn la fuente de emisin.
Segn el nmero de lentes.
Los microscopios, segn la fuente de emisin son:
MICROSCOPIO PTICO MICROSCOPIO ELECTRNICO
Microscopios
Estereoscpicos o lupas
Compuestos
M. ptico, corriente
M. contraste de fases
M. de fluorescencia
M. Electrnico
M. E. de transmisin
M. E. de barrido
Tipos de microscopios,
segn el nmero de lentes
Microscopio estereoscpico
Este microscopio hace posible la visin tridimensional de los objetos.
Ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeos aumentos.
El ptimo de visin estereoscpica se encuentra entre 2 y 40X.
Microscopio ptico compuesto
Poseen dos lentes que producen una imagen ampliada, vertical e invertida al objeto
Tiene un lmite de resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m). Aumenta las imgenes hasta 1000 veces. El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, o triocular. Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas
UNIDAD
1 Partes del microscopio ptico .
Sus principales componentes son:
Oculares. Lentes a travs de las que se
observa la preparacin ampliada.
Objetivos. Lentes que aumentan el tamao
de la imagen.
Platina. Sobre ella se coloca la
preparacin, que se sujeta con una pinza.
Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba
o abajo para enfocar la imagen.
Iluminacin. Espejo o lmpara que ilumina la
preparacin.
Partes
Partes Fuente. Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada Lente Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la imagen formada en los objetivos. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado Lente Objetivo: lente situada cerca del especimen.
Objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan ndices que indican el aumento, la abertura numrica y otros datos. Un objetivo con estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, con tubo de longitud 160 mm. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, son de 100X y se distingue por uno o dos crculos negros en su extremo inferior.
Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Revlver: Sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro. Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura. Platina: Plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn del mismo.
Partes
Ocular
Objetivo
Diafragma
Efecto del diafragma
Dependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en
correspondencia, mayor o menor profundidad de campo
Objetivo menor mayor campo, mayor profundidad de campo o
de enfoque
Objetivo mayor menor campo, menor profundidad de campo o de enfoque
Si cerramos el diafragma mayor profundidad de
campo, pero menos luz
Si abrimos el diafragma menor profundidad de
campo, pero ms luz
Efecto del micromtrico
Moviendo el tornillo micromtrico (nunca ms de una vuelta)
alternativamente hacia delante o hacia atrs, podremos apreciar
nuevos detalles en la preparacin
Aqu, por ejemplo, logramos ver los cloroplastos de
estas clulas vegetales al mover ligeramente hacia
atrs o hacia delante el tornillo micromtrico
Microscopio de campo claro
Fuente
Muestra
Condensador
Ocular ( X 10)
Objetivo ( X 20, X 40 o X 100) ( X 100 con aceite de inmersion)
Para observar las
muestras es necesario
realizar tinciones para
aumentar la diferencia de
contraste entre los
microorganismos y el
medio.
UNIDAD
1 Imgenes con el microscopio ptico
Este tipo de microscopio permite observar clulas
vivas y los movimientos
que realizan
mantenindolas en su
medio.
Protozoos
UNIDAD
1
Tambin permite observar tejidos en finos cortes, pero en este caso hay
que fijar las muestras, de manera que
las clulas estn muertas.
Para ver mejor las muestras pueden teirse con colorantes especficos que
destaquen estructuras como el ncleo
o la pared celular.
CLULAS ANIMALES
CLULAS VEGETALES
Imgenes con el microscopio ptico
Microscopio ptico de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen.
El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada.
Microscopio de campo oscuro
-Se coloca una placa opaca entre el
condensador y la muestra.
-Solo los rayos reflejados o difractados
entran al objetivo.
-Se obtiene una imagen con fondo
oscuro y la muestra iluminada.
-No es necesario fijar las muestras.
Condensador
Placa opaca
Muestra
Objetivo
Chlamydomonas
Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia.
Fuente
Muestra
Condensador
Anillo de fase
Anillo transparente
Objetivo
-Convierte pequeas
diferencias en indices de
refraccion en variaciones
detectables por el ojo. - Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas a travs de las distintas partes de una clula. - El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
-Permite observar
estructuras sin necesidad
de fijar las muestras.
Microscopio de contraste de fases
-1/4 rayos
en
fase
anillo de fase
Los rayos desviados se cancelan con los no desviados
objetivo
-1/4
Contraste de fase
Se observan imgenes con el fondo claro
(rayos no desviados) y las muestras
oscuras con limites bien definidos.
Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para espcimenes delgados, o clulas aisladas
Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.
Contraste de fase
Microscopio de fluorescencia Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y
380 nm) menor que la luz blanca (380 a 750 nm). Esta luz excita ciertas sustancias que emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que las hace visibles.
Algunos materiales no requieren colorantes pues tienen fluorescencia propia y otros deben ser teidos con colorante fluorescente, es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos.
La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.
Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo
Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A).
Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo
(azul), microtubulos (verdes), actina (rojo).
Microscopio de fluorescencia
Lampara
Muestra
Condensador de campo oscuro
Filtro de excitacion
Filtro de emision
-Las muestras deben estar teidas
con fluoroforos
-Las muestras son excitadas a una
longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.
-Anticuerpos conjugados
-Hoecht (tie DNA)
-Expresion de proteinas
de fusion fluorescentes
(GFP)
Operacin del microscopio
Coloque el objetivo de menor aumento en posicion de empleo, y baje la platina completamente. Colocar la preparacion sobre la platina, y sujetela con las pinzas. Realizar el enfoque: Acercar al maximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macrometrico. Eso debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacion. Mirando a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo, con el macrometrico, y cuando se observe ntida la muestra, girar el micromtrico, hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen deber estar ya casi enfocada, y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino.
Mantenimiento y precuaciones
Al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de menor aumento
Cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar que se ensucien los lentes.
Nunca tocar los lentes con las manos
Despues de usar el objetivo de inmersion, limpiar el aceite con pauelos para ptica, con una mezcla alcphol acetona ( 7:3) o con xilol
En el, la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (con vaco
para mejorar el paso de los electrones).
Aumenta la imagen con lentes magnticas.
Aumenta las imgenes hasta un milln de veces.
Las imgenes que se producen son en blanco y negro y muchas veces tienen
colores falsos.
Objetivos. Lentes que aumentan el
tamao de la imagen (internos).
Iluminacin. Can de electrones que
genera un haz que puede atravesar la
muestra o rebotar en ella (interno).
Oculares. Lentes a travs de las que
se observa la preparacin ampliada
(externos).
El microscopio electrnico
Microscopio electrnico
Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla.
Observamos la imagen a travs de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisin).
Las imgenes se recogen en una placa fotogrfica que es impresionada directamente por los electrones.
El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET)
Un MET mira a replicas de clulas muertas , despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados.
Los electrones son dispersados cuando pasan a travs del espcimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.
El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm.
Microscopio electrnico de transmisin
UNIDAD
1 Slo permite observar clulas muertas, pero la ventaja es que permite estudiar las estructuras internas de los
orgnulos celulares.
En este caso las muestras deben ser muy finas para que puedan ser
atravesadas por los electrones y
tienen que estar deshidratadas.
Imgenes en el MET
El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)
Al igual que el MET, el MEB permite mirar a clulas muertas, despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados.
Con esta tcnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espcimen.
Sirve para examinar la superficie de los objetos y muestra la forma real de los objetos.
Microscopio electrnico de barrido
Microscopio de Campo Claro Alga verde (eucariota)
Microscopio de Fluorescencia Bacteria filamentosa Teida con naranja de acridina
Microscopio de Contraste de Fases Saccharomyces cerevisiae
Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas
mediante microscopio (micrografas) y seala qu tipo de
microscopio se utiliz en cada caso. Justifica
a. Ameba, organismo
formado por una sola
clula (unicelular), que
mide cerca de 50
micrones
b. Clulas del interior de una
trompa de Falopio. Cada uno
de los pelitos que se ven mide 10 micrones de largo y
se llaman cilios
c. Espermio
acercndose a un
vulo. El vulo
humano es una
clula que mide
poco ms de 100
micrones
EJERCICIO
d. Ncleo de una
clula animal, de
alrededor de 5
micrones de
dimetro
e. Corte transversal de una
hoja, espesor 1 mm
f. Poros de salida de
glndulas gstricas.
Por una de ellas sale
un chorro de jugo
gstrico. Diametro de
poro, 5 micras
g. Corteza cerebral
humana, que tiene un
espesor de unos pocos
milmetros
h. Glbulo blanco
deformado al atravesar
por un capilar
sanguneo. Este capilar
tiene un dimetro de
unos 10 micrones
i. Capilar sanguneo
cortado
transversalmente,
por el que asoma un
glbulo rojo, clula
que mide 7 micrones
de dimetro
TINCION Una tincin o coloracin es una tcnica utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Para mejor aprovechar la observacin microscpica, debe relacionarse el comportamiento del tinte con la composicin qumica de las partes de la anatoma bacteriana. Los colorantes utilizados son compuestos orgnicos con grupos cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos. Cromforos son los grupos funcionales de la molcula responsables de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares libres). Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si solo pero que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades: metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.
Tipos de Colorantes
Colorantes
Cationicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente tales como acidos nucleicos, polisacaridos
acidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta, Safranina.
Anionicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como numerosas proteinas. Ejemplos:
Eosina, Fucsina acida y Rojo congo.
Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas. Ejemplos: Sudan negro.
Tipos de tincin
Tincin in vivo (colorantes vitales) es el proceso de teir tejidos vivos. El propsito ms comn es revelar detalles de la citoestructura. Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5000 a 1:50000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente txicas para los organismos. Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Tincin in vitro (colorantes no vitales). Involucra el coloreo de clulas o estructuras que han sido removidas de su contexto biolgico. Ejem: tincion Gram.
Colorantes histolgicos ms comunes
Azul brillante de Coomassie Tie en forma no especfica a todas las protenas con un fuerte color azul. Se utiliza para teir corridas de protenas en electroforesis en gel. Azul de metileno Se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Azul Nilo Tie a los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para teir clulas vivas. Bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teir clulas vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar clulas que se encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales clulas poseen unas membranas mucho ms permeables.
Carmn
Es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al ncleo. Las tinciones con carmn requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.
Cristal violeta
El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tie las paredes celulares de color prpura.
Son sustancias capaces de formar complejos
insolubles con los colorantes y que ayudan al
proceso de coloracin: los mordientes.
Ejemplos de mordientes comnmente usados
son el Lugol, el cido tnico y algunas sales.
MORDIENTES
TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
b) La fijacin
c) Coloracin.
2 tipos de
tinciones
Positivas: se emplea el uso de colorantes que tien al
microorganismo y no al
medio.
Negativas: se emplea el uso de colorantes que no tienen afinidad por los constituyentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tien al medio y no a
las bacterias, sirven para ver celulas con capsulas de
mucopolisacaridos.
Simples: uso de un solo colorante. Sirven para
distinguir formas.
Diferenciales: uso de un colorante inical y luego un colorante
de contraste. Sirven para diferenciar
distintos tipos de celulas (Ejemplo:
tincion Gram)
Tinciones
Observacin en fresco y coloracin vital.
Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observacin en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluidos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta tcnica podr observarse la morfologa y agrupacin de las bacterias as como tambin la movilidad. Observacin en fresco. Tcnica. 1- Sobre un portaobjetos colocar con el asa una gota de agua y realizar una suspensin de la muestra en estudio. No extender. 2- Colocar un cubreobjetos. 3- Observar con poca luz. Coloracin vital. El procedimiento es similar al de la observacin en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solucin diluida de colorante en lugar del agua
Tincin negativa. Se utilizan sustancias que no penetran en la clula y tie el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medicin de microorganismos. Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china. Con este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin estructuras extracelulares como la cpsula. Tcnica. 1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa, una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %. 2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de valo. 3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin.
Tincin de clulas para la observacin microscpica
Extensin de una fina capa de clulas sobre el porta
Secado al aire
Fijacin por flameado del porta
Adicin del colorante lavado y secado
Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X
TINCIN SIMPLE
COLORACIONES ESPECFICAS.
Coloracin de Gram.
Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883
y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.
En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern
las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras
que las Gram (-) se vern rojas.
La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+)
y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.
TINCIN DE GRAM
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Tincin del frotis Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las clulas se tien de color azul-violeta.
Aadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las clulas siguen de color azul-violeta.
Decolorar con alcohol Las clulas Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran.
Tincin de contraste Con safranina 2 minutos. Las clulas G+ se ven azul-violeta. Las G- rosas o rojas.
Gram +
Gram -
TINCIN DIFERENCIAL
Permite distinguir dos grandes grupos de bacterias que poseen diferencias
estructurales en la pared celular.
Peptidoglicano
Polimero de N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico unidos por peptidos.
Tincin Gram
Tincin Gram
Tincin Gram
1) Preparar un extendido
A partir de cultivos en medio liquido: Se toma un poco de
cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto.
A partir de cultivos en medio solido: Se apoya el ansa sobre
una colonia, luego se coloca una gota de agua sobre el
portaobjeto y se desparrama el material con el ansa..
Protocolo
2) Fijar el material Una vez que el material esta seco, pasar
el portaobjeto sobre el mechero.
Tincin Gram
3) Cubrir el portaobjeto con
Cristal violeta
Se deja el colorante durante 20
segundos.
4) Lavar con agua
Gram + Gram _
5) Agregar el mordiente (lugol) (Lugol: solucion de I2 y KI). Se deja actuar el
mordiente durante 20 segundos y luego se
lava con agua.
Tincin Gram
6) Agregar el decolorante (Decolorante: solucion de acetona y EtOH).
El agregado del decolorante produce una DESHIDRATACIN de la pared de
pptido glicano que la transforma en una barrera fsica impermeable al
solvente.
Como consecuencia se impide el lavado del cristal violeta, quedando
atrapado en el interior de las bacterias Gram +.
Gram + Gram _
Tincin Gram
7) Agregar el colorante de
contraste (safranina)
8) Lavar con agua
Gram + Gram _
Tincin Gram
Rosa (Gram -) Violeta (Gram +)
Clasificacin en funcin de su posicin
Tincin de esporas
1) Preparacion del extendido y fijacion por
calor.
2) Cubrir con verde de malaquita calentando
durante 3 minutos.
3) Lavar con agua.
4) Agregar colorante de contraste
(safranina).
5) Lavar con agua.
Protocolo:
Tincin de esporas
Tincin de acido resistencia (Ziehl-Neelsen)
Permite distinguir bacterias del genero Mycobacterium. Estas poseen en su
pared acido micolico (hidroxilipido de cadena ramificada que se encuentra
acomplejado al peptido glicano de la pared celular.