Comparación entre implantación intralesional y perfusión
regional en el tratamiento de células madre mesenquimales en
tendinitis flexoras
Patricia Becerra (1) LV, Miguel A. Valdés* (1) LV, MS, Diplomado ECVS, ACVS,
Francisco Neves (1) LV, Jay Dudhia (2) LV, Neil G. Hartman (3), Andrew Fiske-
Jackson (2) y Roger K.W. Smith (2) MRCVS, PhD, Diplomate ECVS
(1) Hospital de Referencia La Equina, Apdo 110, Camino de Martagina Km 1
29692 – Manilva, Spain
(2) Dept. of Veterinary Clinical Sciences, The Royal Veterinary College, Hawkshead
Lane, North Mymms, Hatfield, Herts. AL9 7TA. United Kingdom
(3) Department of Nuclear Medicine, Barts & The London NHS Trust, West
Smithfield, London EC1A 7BE. United Kingdom
Summary
Mesenchymal stem cells (MSCs) are being used with increasing frequency in soft
tissue injuries but immediate cell survival and alternative administration routes have
not been investigated. We hypothesised that MSCs are retained within the tendon
after intra-lesional injection but can also “home” to injury sites after intravenous
injection or regional perfusion.
Labelling efficiency of MSCs with technetium-99m (Tc-99m) and
hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) was initially determined in vitro. 10
million labelled MSCs were then implanted into 12 horses with naturally-occurring
tendon or ligament injuries intra-lesionally, intravenously, and by regional perfusion
on consecutive weeks. Labelled MSCs were traced over 36 hours using gamma
scintigraphy.
Maximum in vitro cell labelling was 55% with >90% cell viability. In contrast,
labelling efficiencies varied between 2.7% and 22.5% (mean 9.2%) in clinical cases.
Cells were retained in the damaged area after intra-lesional administration but only
~10% of cells were still present within the tendon after 24 hours. After intravenous
injection, cells largely distributed to the lung fields, with no detectable cells in the
tendon lesions. In contrast, significant labelling of the tendon lesions was observed in
11/12 horses following regional perfusion.
Optimal number of cells is not known but the highest cell numbers were retained after
intra-lesional injection, although with considerable cell loss. Regional perfusion
appeared to be a viable alternative if no core lesion was present. The absence of cells
seen after intravenous administration may be a consequence of low labelling
efficiencies, but cells still did not ‘home’ to the lesion in large numbers.
Introducción:
Las células madre mesenquimales (CMM) se usan de manera creciente en el
tratamiento de lesiones tendinosas y ligamentosas tanto de manera experimental (1, 2)
como en estudios clínicos (3). La supervivencia de las CMM implantadas
intralesionalmente se han investigado usando células marcadas y estudiando su
persistencia entre tres y cuatro meses tras la implantación (4, 5). Dichas células
persistieron, si bien en pequeños números. El momento de esta pérdida en el número
de células no pudo ser determinado, y se desconoce cuantas sobrevivieron el
momento de la implantación. Además, otras vías alternativas de administración a la
implantación intralesional han sido sugeridas, dado que la lesión podría realizar un
“efecto llamada” a las CMM.
Nuestra hipótesis es que las CMM se retienen en la lesión tras su implantación
intralesional, y que tras la administración intravenosa sistémica e intravenosa por
perfusión regional las CMM anidan en la lesión.
Material y método
Eficiencia de marcado celular In Vitro: Partes alícuotas con 10 millones de CMM
fueron marcadas con 200MBq de tecnecio-99m pertecnetato sódico (Tc-99m) y 1 vial
de Hexametilpropilenoamina oxima (exametazina, HMPAO)1. Para obtener la
eficiencia óptima de marcado se compararon tiempos de incubación de 10, 20 y 30
minutos y dos diferentes medios de incubación (Dulbeccos Modified Eagles Medium
(DMEMs) y solución salina tamponada de fosfato (PBS)).
Estudio clínico: Se seleccionaron 9 caballos con tendinitis del flexor digital
superficial inducidas por el ejercicio de manera natural (TFDS) y 3 caballos con
dermitis del accesorio del tendón flexor digital profundo (DAFDP). Las lesiones
tenían que ser agudas, con menos de 21 días de duración. Tras su evaluación clínica y
ecográfica se obtuvieron del esternón 2 x 9.5 ml de partes alícuotas de medula ósea,
siguiendo protocolos ya publicados (6). CMM se aislaron y cultivaron por protocolos
estandarizados (3, 6). Tras unas 3 semanas, 3 alícuotas con 10 millones de CMM de
cada paciente cada una se enviaron al Hospital de Referencia La Equina, una cada
semana en 3 semanas consecutivas. Las CMM se marcaron con Tc-99m HMPAO
antes de cada administración. La eficiencia de marcado se midió en cada alícuota.
Las células fueron administradas a cada caballo por las siguientes 3 vías de
administración, al azar y en semanas consecutivas:
1) Implantación por inyección intralesional bajo guía ecográfica (intralesional - IL)
2) Administración intravenosa en la vena digital palmar en la región de la cuartilla mientras un torniquete era mantenido durante 30 minutos en la
zona metacarpiana proximal (perfusión regional - PR)
3) Administración intravenosa sistémica a través de la yugular (Intravenosa - IV)
1 CERETEC® GE Healthcare.
Las CMM marcadas fueron seguidas durante un período de al menos 36 horas a través
de una gammagrafía a los 5 minutos, 1, 3, 6, 12, 24 y 36 horas tras cada tratamiento.
Las imágenes de gammagrafía se obtuvieron de la zona de la lesión, misma zona
contralateral, el pulmón derecho y el tiroides derecho. Además, en cada una de estas
regiones se realizó recuento de destellos a 1 cm de la piel. Estos valores y los valores
obtenidos en las imágenes de gammagrafías definiendo regiones de interés (RDI) se
analizaron estadísticamente.
Resultados:
Eficiencia de marcado celular In Vitro: La máxima eficiencia de marcado celular con
Tc-99m HMPAO fue 55% tras 30 minutos de incubación y el uso de DMEMs como
medio de incubación. La viabilidad celular sobrepasó el 90% tras el marcado.
Estudio Clínico: La eficiencia de marcado varió entre el 2.7% y el 22.5 % con una
media del 9.2%. Las células se retuvieron en la lesión tras la implantación
intralesional (Fig. 1). Cálculos de persistencia celular durante las primeras 24 h
sugieren que aproximadamente un 10% de las células implantadas estaban presentes a
las 24 horas.
La administración intravenosa resultó en una distribución de las células mayormente
en el pulmón, sin trazas detectable en la lesión. Por el contrario, una actividad
significativa se encontró en la lesión en 11/12 caballos tras la perfusión regional. (Fig.
1).
Discusión:
La baja eficiencia de marcado obtenida durante el ensayo clínico se debe
posiblemente al mayor período de tiempo que transcurrió entre la elución del Tc-99m
y el marcado con HMPAO, debido a que la distancia entre la radiofarmacia que surte
al Hospital de Referencia La Equina es mayor que en el caso del Royal Veterinary
College, donde se realizó el estudio In Vitro. Para el marcado celular el tiempo
transcurrido entra la elución y el marcado no debe sobrepasar las 2 horas, ya que el
decaimiento del Tc-99m interfiere con el marcado.
El número de células implantadas necesarias para obtener un efecto clínico no es
conocido. La mayor retención de células tras la administración se produce en el
tratamiento intralesional, indicando que esta es todavía la vía más efectiva para hacer
llegar un mayor número de células a la lesión. Sin embargo, durante las primeras 24 h
se pierden una elevada porción de estas células implantadas.
La perfusión regional parece una vía alternativa que promete aplicación clínica. No
cabe duda que se produce un efecto llamada por parte de la lesión a CMM que se
mantienen regionalmente durante 30 minutos. En aquellas lesiones que no cursan con
una imagen ecográfica con lesión central y definida o en lesiones de naturaleza difusa
como son las lesiones del origen del ligamento suspensor, la perfusión regional es una
vía alternativa viable. Es necesario investigar si en caso aun más agudos que los
estudiados en el presente proyecto y en lesiones crónicas también se ejerce este
“efecto llamada”.
La ausencia de actividad en la lesión tras la administración intravenosa podría estar
relacionada con una ausencia de atracción de la lesión a CMM, aunque la baja
eficiencia de marcado obtenida hace difícil sacar conclusiones.
References
1. Schnabel LV, Lynch ME, van der Meulen MC, Yeager AE, Kornatowski MA,
Nixon AJ. J Orthop Res. 2009 Oct;27(10):1392-8.
2. Nixon AJ, Dahlgren LA, Haupt JL, Yeager AE, Ward DL. Am J Vet Res.
2008 Jul;69(7):928-37.
3. Godwin EE, Young NJ, Dudhia J, Beamish I, Smith RKW. Equine Vet J.
2011:In press.
4. Guest DJ, Smith MR, Allen WR. Equine Vet J. 2008 Mar;40(2):178-81.
5. Guest DJ, Smith MR, Allen WR. Equine Vet J. 2010 Oct;42(7):636-42.
6. Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE. Equine Vet J. 2003
Jan;35(1):99-102.
Figura 1: Gammagrafía de una lesión del tendón flexor digital superficial en su
porción distal, a 22 cm distal hueso accesorio del carpo (imagen ultrasonográfica de la
lesión a la izquierda). Fueron realizadas a las 3 horas, 6 horas y 12 horas tras la
implantación intralesional (fila superior) y la perfusión regional intravenosa en la
vena palmar digital a nivel de la cuartilla (fila inferior). Nótese la actividad presente
en el tendón flexor digital superficial distal (flecha continua). La flecha discontinua
denota actividad persistente en los primeros momentos en los vasos sanguíneos.
Agradecimientos: Este proyecto ha sido parcialmente apoyado por la Consejería de
Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía. Agradecemos a IBA
Molecular Spain – Molypharma su apoyo logístico durante el proyecto. Este proyecto
no se podría haber llevado a buen término sin la ayuda de VetCell Bioscience en el
cultivo de las células madre mesenquimales.