Costa Rica, 27 de abril Costa Rica, 27 de abril –– 2 de mayo 20092 de mayo 2009
Hilda Ma. BolaHilda Ma. Bolañños Acuos Acuññaa
Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa
INCIENSA INCIENSA –– Costa RicaCosta Rica
.
Diagnóstico de laboratorio de vibrios
causantes de ETAs
..
DiagnDiagnóóstico de laboratorio de stico de laboratorio de vibriosvibrios
causantes de causantes de ETAsETAs
CaracterCaracteríísticas microbiolsticas microbiolóógicas gicas
Los miembros del gLos miembros del géénero nero VibrioVibrio son:son:
Bacilos Bacilos GramGram--negativos (0,5 a 0,8 x negativos (0,5 a 0,8 x
1,4 a 2,6 1,4 a 2,6 µµm)m)
MMóóviles por flagelos polaresviles por flagelos polares
Anaerobios facultativosAnaerobios facultativos
Oxidasa positivos Oxidasa positivos (excepto (excepto V. V. metschnikoviimetschnikovii))
Su metabolismo es fermentativoSu metabolismo es fermentativo
Miembros de la familia Miembros de la familia VibrionaceaeVibrionaceae((AeromonasAeromonas, , PlesiomonasPlesiomonas y Vibrioy Vibrio))
DiferenciaciDiferenciacióón entre el gn entre el géénero nero VibrioVibrio y otros y otros
GramGram--negativos oxidasa (+) negativos oxidasa (+)
--++--Gas de glucosaGas de glucosa
----++Prueba de cordPrueba de cordóónn
---- (+)(+)++Crecimiento en agar Crecimiento en agar TCBSTCBS
----++Crecimiento requiere o es Crecimiento requiere o es estimulado por iones estimulado por iones Na+Na+
--++++FermentaciFermentacióón de manitoln de manitol
++----FermentaciFermentacióón de inositoln de inositol
++++++FermentaciFermentacióón de glucosan de glucosa
PlesiomonasPlesiomonasAeromonasAeromonasVibrioVibrioPrueba bioquPrueba bioquíímicamica
VibriosVibrios de importancia clde importancia clíínicanica
++++++V. V. mimicusmimicus
++++V. V. alginolyticusalginolyticus
++++++++++V. V. vulnificusvulnificus
(+)(+)++++++V. V. parahaemolyticusparahaemolyticus
++++++++V. V. choleraecholerae no O1 no O1 (incluyendo O:139)(incluyendo O:139)
(+)(+)++++V. V. choleraecholerae O1O1
SepticemiaSepticemiaInfecciInfeccióón de n de
heridas, oheridas, oíídosdos
GastrointestinalGastrointestinal
PresentaciPresentacióón cln clíínicanicaEspecieEspecie
++: Presentaci++: Presentacióón mn máás coms comúún; +: otra presentacin; +: otra presentacióón cln clíínica; (+) presentacinica; (+) presentacióón poco usualn poco usual
Vibrio choleraeVibrio cholerae
V. V. choleraecholerae O1*O1*
•• 2 biotipos: Cl2 biotipos: Cláásicosico
El TorEl Tor
•• 3 3 serotiposserotipos: : InabaInaba
OgawaOgawa
HikojimaHikojima
V. V. choleraecholerae no O1no O1(> 200 (> 200 serogruposserogrupos):):
•• V. V. choleraecholerae O139 *O139 *
•• V. V. choleraecholerae no O1, no O1,
no O139no O139
* Cepas epid* Cepas epidéémicasmicas
75% infección asintomática*
2% enfermedad grave
5% enfermedad moderada
18% enfermedad leve
Espectro clEspectro clíínico del cnico del cóóleralera
* Portadores: personas que * Portadores: personas que queque no presentan sno presentan sííntomas pero pueden ntomas pero pueden
transmitir la enfermedad. Importantes en diseminacitransmitir la enfermedad. Importantes en diseminacióón de la enfermedad.n de la enfermedad.
RecolecciRecoleccióón y transporte den y transporte de
muestras fecalesmuestras fecales
•• En el perEn el perííodo agudo de la enfermedadodo agudo de la enfermedad
•• Antes de iniciar el tratamiento antibiAntes de iniciar el tratamiento antibióótico tico
•• Heces enteras o hisopado fecal en Cary Blair Heces enteras o hisopado fecal en Cary Blair (m(mááx. x.
5 d5 díías)as) a temperatura ambientea temperatura ambiente ((no refrigerarno refrigerar))
•• Es ideal procesar la muestra dentro de 2 a 4 horas Es ideal procesar la muestra dentro de 2 a 4 horas
despudespuéés de recolectadas de recolectada
•• Normas de bioseguridadNormas de bioseguridad
FlujogramaFlujograma de aislamiento de de aislamiento de vibriosvibrios
a partir de materia fecala partir de materia fecal
APAAPA
Agar TCBS / TSAAgar TCBS / TSA
Muestra de materia fecal Muestra de materia fecal
V. cholerae O1, O139 o no O1 no O139
35- 37º C x 6-8 hs
35 - 37º C x 18-24 hs
KIA KIA –– LIA LIA -- indol indol -- estrestríía TSAa TSA
35 -37º C x 18-24 hs
Pruebas bioquPruebas bioquíímicas micas
complementariascomplementariasOxidasa, cordOxidasa, cordóónn
SerotipificaciSerotipificacióón O1 y O139n O1 y O139
Crecimiento de Crecimiento de vibriosvibrios en agar TCBSen agar TCBS
Sacarosa (-)V. mimicus
V. parahaemolyticus
Sacarosa (-)V. mimicus
V. parahaemolyticus
Agar TCBSAgar TCBS
Sacarosa (+)V. cholerae
Sacarosa (+)V. cholerae
DiferenciaciDiferenciacióón bioqun bioquíímica de mica de vibriosvibrios
causantes de causantes de ETAsETAs
--++----FermFerm. arabinosa. arabinosa
------++FermFerm. sacarosa. sacarosa
++------FermFerm. lactosa. lactosa
SSRRSSSSSens O129 Sens O129 (10 (10 µµgg))
SSSSSSSSSens O129 Sens O129 (150 (150 µµgg))
++++----CrecCrec. 8% . 8% NaClNaCl
++++++++CrecCrec. 1% . 1% NaClNaCl
----++++CrecCrec. 0% . 0% NaClNaCl
VerdesVerdesVerdesVerdesVerdesVerdesAmarillasAmarillasColonias en TCBSColonias en TCBS
V. V.
vulnificusvulnificusV. V.
parahaemolyticusparahaemolyticusV. V.
mimicusmimicusV. V.
choleraecholeraeCaracterCaracteríísticastica
AglutinaciAglutinacióón:n: organismo (antorganismo (antíígeno) + suero inmune (anticuerpo)geno) + suero inmune (anticuerpo)
SerotipificaciSerotipificacióón de n de Vibrio Vibrio choleraecholerae
•• Cultivo fresco Cultivo fresco (18(18--24 horas)24 horas)
•• Control de aglutinaciControl de aglutinacióónn
•• Seguir especificaciones de Seguir especificaciones de
fabricantes de antisuerosfabricantes de antisueros
Si el antisuero contiene Si el antisuero contiene aglutininasaglutininas contra la bacteria se produce rcontra la bacteria se produce ráápidamente una pidamente una
aglutinaciaglutinacióón fuerte, firme y granularn fuerte, firme y granular
Cepa con Cepa con caractcaract BQ de BQ de V. V. choleraecholerae en ABHI o ATSen ABHI o ATS
Aglutinar en SS Aglutinar en SS 0.85%0.85%
Cepa rugosaCepa rugosa++
--
Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero polypoly O1O1
++V. V. choleraecholerae O1O1
--
V. cholerae no O1Aglutinar con Aglutinar con antisuero O139antisuero O139
++V. V. choleraecholerae O139O139
--
V. V. choleraecholerae no O1, no O139no O1, no O139
11
DeterminaciDeterminacióón de factores de n de factores de virulencia (PCR)virulencia (PCR)
Pasajes en ASPasajes en AS
SerotipificaciSerotipificacióón de n de Vibrio Vibrio choleraecholerae
NOTIFICAR *NOTIFICAR *
SerotipificaciSerotipificacióón de n de V. V. choleraecholerae O1O1
Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero InabaInaba
++
--
Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero OgawaOgawa
++V. V. choleraecholerae O1 O1 OgawaOgawa
11
V. V. choleraecholerae O1 O1 InabaInaba NOTIFICAR * NOTIFICAR *
NOTIFICAR *NOTIFICAR *
DeterminaciDeterminacióón de factores de n de factores de virulencia (PCR) y PSAvirulencia (PCR) y PSA
Si aglutina con Si aglutina con InabaInaba y y OgawaOgawa corresponde al serotipo corresponde al serotipo HikojimaHikojima (el aislamiento se debe (el aislamiento se debe referir a un Centro de Referencia Internacional para su confirmareferir a un Centro de Referencia Internacional para su confirmacicióón)n)
RSI: Cólera por V. cholerae O1, O139: NOTIFICACION INTERNACIONAL
DiferenciaciDiferenciacióón de los biotipos den de los biotipos de
V. V. choleraecholerae O1O1
++--HemHemóólisis en agar sangre de carnerolisis en agar sangre de carnero
++--Lisis por bacteriLisis por bacterióófago El Tor 5fago El Tor 5
--++Lisis por bacteriLisis por bacterióófago clfago cláásico IVsico IV
--++Zona de inhibiciZona de inhibicióón alrededor del disco n alrededor del disco
de de polimixinapolimixina B (50U)B (50U)
++--VogesVoges ProskauerProskauer (+ 1% (+ 1% NaClNaCl))
El TorEl TorClCláásicosico
BiotipoBiotipoEnsayoEnsayo
DesempeDesempeñño del o del CholeraCholera--SMART en el SMART en el
diagndiagnóóstico rstico ráápido del cpido del cóólera en Costa Ricalera en Costa Rica
BolaBolaññosos H, H, etet al. 200al. 2004. Desempe4. Desempeñño de los sistemas o de los sistemas CholeraCholera--SMART y SMART y PathogenPathogen DetectionDetection KitKit en el en el
diagndiagnóóstico del cstico del cóólera. Rev. lera. Rev. PanamPanam. Salud P. Salud Púública 16:233blica 16:233--241.241.
•• Evaluar el desempeEvaluar el desempeñño de dos pruebas ro de dos pruebas ráápidas utilizadas en pidas utilizadas en
Costa Rica para el diagnCosta Rica para el diagnóóstico del cstico del cóólera en comparacilera en comparacióón n
con el cultivo tradicionalcon el cultivo tradicional
•• Evaluar la utilidad del anEvaluar la utilidad del anáálisis de la motilidad lisis de la motilidad ““al frescoal fresco””, ,
como tamizaje para priorizar el uso de las pruebas rcomo tamizaje para priorizar el uso de las pruebas ráápidaspidas
•• Proponer una estrategia para el uso de estas pruebasProponer una estrategia para el uso de estas pruebas
Materiales y mMateriales y méétodostodos
Se procesaron 237 especSe procesaron 237 especíímenes fecales:menes fecales:
PathogenPathogen DetectionDetection KitKitTMTM
SMARTSMARTTMTM
Cultivo Cultivo ((““standard de orostandard de oro””))
Sensibilidad analSensibilidad analíítica del SMARTtica del SMART
0
2
4
6
8
10
12
0 6 12 18 24 30 36 42 48 Horas Horas
log
log
10
10u
f cu
f c/m
l/m
l
•• AltaAlta
•• MedianaMediana
•• BajaBaja
(l(lííquidas, agua de arroz)quidas, agua de arroz)
((semisemi--formadas, moco y sangre)formadas, moco y sangre)
(h. rectales o muestras post(h. rectales o muestras post--antibiantibióótico)tico)
ResultadoResultado
SMART-D SMART-6 SMART-18Motilidad Motilidad Motilidad
Cultivo-D Cultivo APA-6 Cultivo APA-18
AnAnáálisislisis de la motilidadde la motilidad
Sospechosa Sospechosa 65 (47%)65 (47%)
NoNo sospechosasospechosa73 (53%)73 (53%)
Todas negativas Todas negativas
por por V. V. choleraecholerae y y
otros otros vibriosvibrios
V. V. choleraecholerae O1 O1
V. V. choleraecholerae no O1 no O1
V. V. mimicusmimicus, otros, otros
ObservaciObservacióón n
de motilidad de motilidad (n = 138)(n = 138)
ConclusionesConclusiones
�� Las prueba rLas prueba ráápida de SMART mostrpida de SMART mostróó un desempeun desempeñño excelente o excelente (100% (100%
especificidad y 100% sensibilidad)especificidad y 100% sensibilidad) al establecer el diagnal establecer el diagnóóstico de stico de V. V. choleraecholerae
O1 en todas las muestras de heces que fueron positivas por cultiO1 en todas las muestras de heces que fueron positivas por cultivo, vo,
en un tiempo menor.en un tiempo menor.
�� Estas pruebas, utilizadas en conjunto con la observaciEstas pruebas, utilizadas en conjunto con la observacióón de la n de la
motilidad de la muestra, constituyen un recurso accesible para smotilidad de la muestra, constituyen un recurso accesible para ser er
utilizado en la vigilancia del cutilizado en la vigilancia del cóólera, alera, aúún en pan en paííses en vses en víías de as de
desarrollo. desarrollo.
Muchas graciasMuchas gracias