Date post: | 20-Jul-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | adolfo-miravet |
View: | 30 times |
Download: | 0 times |
Joana Azevedo e Victor Freitas REQUIMTE/ Laboratório Associado Química Verde Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
[email protected] [email protected]
25 Marzo 2015
MIGRACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DEL CORCHO AL VINO
Evidencias!
Disoluciones de vino modelo
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Algunos meses después
Color amarillo pálido
Hipótesis
¿Hay una migración de los compuestos del corcho al vino?
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Esto es bueno o malo?
Hipótesis
¿Qué tipo de compuestos migran?
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Corcho
Constituyentes
estructurales
Suberina
Lignina
Polisacáridos
Constituyentes no estructurales
Inorgánicos
Extractables
ceras
Pequeñas moléculas
Compuestos fenólicos
Compuestos Fenólicos INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Compuestos Fenólicos
Color (antocianons y
flavanoles)
Astringentes y amargos
anticancerígenicos
antioxidantes
Taninos
Taninos hidrolizables
Ácido Galico Ácido Elágico
Taninos Condensados
Caracterización de los compuestos fenólicos del corcho INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Fraccionamiento mediante cromatografía de baja presión
(Toyopearl ®, 250 x 25 mm d. i.,eluyente: MeOH; flujo: 0.8 mL.min-1)
Maceración hidroalcóholica del corcho
(12% EtOH; 5.0 gL-1 ácido tartarico; pH 3.2)
Purificación y aislamiento mediante HPLC-DAD semi-preparativa
Caracterización mediante HPLC-DAD/ESI-MS y RMN
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Fraccionamiento del extracto de corcho (Toyopearl®)
Cromatograma :
Ácidos Fenólicos y Aldeidos (A, B, C y D)
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
COOH
OH
OH
CH
CH COOH
OH
CH
CH
MeO
COH
Gallic acid Protocatechuic acid
Conyferaldehyde
Cafeic Acid
OH
COH
MeO
Vanilin
Derivados Ácido Elagico y Gálico (F, G y H)
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
m/z 301
OH
OH
OH
OH
COOH
COOH
OH O
OH
OH
OHHOOC
m/z 505
O
OO
OOH
OH
OH
OOH
OH
OHHOOC
m/z 469
Ellagic Acid Valoneic Acid Valoneic Acid Dilactone
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.
Identificación por LC ESI/MS
Identificación de los compuestos del corcho
Identificación de los compuestos del corcho INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Taninos elágicos (H, I, J, K, L y M)
Identification by LC ESI/MS
OH
OH
OH
O
OO
OH
O
OH
O
HH
OHOH
OH
O
OH
OHOH
O
OH
OHOH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
OH
O
HH
OHOH
OH
OOH
OH
OH
O
OH
OHOH
O
OHOH
OH
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
OH
O
HH
m/z 633 (HHDP-galoyl-glucose)
m/z 783 (diHHDP-glucose)
m/z 785 (HHDP-digaloyl-glucose)
OHOH
OH
O
OH
OHOH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
O
O
HH
m/z 935 (diHHDP-galoyl-glucose)
OHOH
OH
O
OH
OHOH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
O
O
HH
OH
OH
OH
O
m/z 937 (HHDP-trigaloyl-glucose)
O
HO OH
OHOHOHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
O O
O
OO
O
R1OO
O
R2
m/z 933 (Castalagin/ vescalagin)
Fracionamiento extracto del Corcho (Toyopearl®) –
Chromatogram :
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.
Compuestos fenólicos identificados en corcho INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Postulated Compounds Compound number [M-H]- m/z MS2 ions (m/z) MS3 ions (m/z)* l máx (nm) Fraction
Protocatechuic aldehyde 1 137 109 - 280; 310 I Vanillin 2 151 136 108 279; 308 I Protocatechuic acid 3 153 109 - 259; 293 I Gallic acid 4 169 125 97 270 I Conyferaldehyde 5 177 162 133; 120; 106 289; 340 I Caffeic acid 6 179 - - 322 I Ferulic acid 7 193 149 134 319 I Ellagic acid 8 301 257; 229 - 250; 373 I, II Ellagic acid-pentose 9 433 301 257; 229 253; 373 I Ellagic acid-deoxyhexose 10 447 301 257; 229 253; 373 I Ellagic acid-hexose 11 463 301 257; 229 253; 373 I Valoneic acid dilactone 12 469 425 407; 301 253; 373 II HHDP-glucose 13 481 301 257; 229 262; 379 I Valoneic acid 14 505 313 - 253; 370 II Dehydrated tergallic-C- glucoside 15 613 593; 523; 493 465; 301; 299 253; 373 II
HHDP-galloyl-glucose 16 633 463; 301 257; 229; 185 262 III
Trigalloy-glucose 17 635 483; 465 421; 313; 169 277 II Di-HHDP-glucose 18 783 481; 301 257; 229 271 III; IV HHDP-digalloyl-glucose 19 785 633; 483; 301 257; 229 271 III; IV
Tetragalloyl-glucose 20 787 635; 617 573; 465; 403 274 III Castalagin / Vescalagin 21 933 915; 631 613; 569 247 VII; VIII Di-HHDP-galloyl-glucose 22 935 633; 873; 783 571; 329; 299 271 VI
Trigalloyl-HHDP-glucose 23 937 785; 767; 635; 465 301 277 VIII
Pentagalloyl-glucose 24 939 787; 769 617; 599; 447 279 V
Mongolicain A / B 25 1175 873; 855; 721; 677 829; 785; 767 267 VIII
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.
Propiedades Antioxidantes INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrilhidrazyl) como radical libre. Los compuestos analizados reaccionan
con DPPH e inducen la disminución de la absorbancia medida a 515 nm.
FRAP (Ferric Reducing Power Assay). Los compuesto analizados reaccionan con FRAP e inducen el
aumento de la absorbancia a 593 nm
DPPH. + AH DPPH-H + A.
Propiedades Antioxidantes INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES Todos los compuestos individuales (a 10 mM) mostraron un poder reductor y la capacidad
de estabilizar los radicales libres
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.
Propiedades Biológicas – Efecto antiproliferativo (ensayo SRB) INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Lineas de céulas cancerígenas (1,5 x 105 cells/mL):
- MCF-7, Células cancerígenas mamarias
- CaCo-2 and HT-29, Células cancerígenas del colon
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.
Parada de la incubación:
TCA 50 % , 1 h at 4ºC
Tinción: SRB (0.4 %, 1 % acetic acid)
Lectura Abs a 490 nm: Triz buffer (10 mM, pH 8.15, 30’)
Células (proteina)
24 h, 37 ºC, 5 % CO2
Concentración de los polifenonles
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
MCF-7
0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0
0
30
60
90
120 di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Concentração (mM)
% C
on
tro
lo (
Ab
s 4
92
nm
)
MCF-7
0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0
0
30
60
90
120 di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Concentração (mM)
% I
nib
içã
o (
Ab
s 4
92
nm
)
Caco-2
0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0
30
60
90
120
Concentração (mM)
% C
on
tro
lo (
Ab
s 4
92
nm
)
HT-29
0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0
30
60
90
120
Concentração (mM)
% C
on
tro
lo (
Ab
s 4
92
nm
)
Todos los compuestos individuales fueron capaces de inhibir la proliferación de las tres líneas de células
cancerígenas estudiadas a las dos concentraciones más altas
Propiedades Biológicas – Efecto Antiproliferativo (ensayo SRB)
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.
MCF-7
0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0
0
30
60
90
120 di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Concentração (mM)
% I
nib
içã
o (
Ab
s 4
92
nm
)
Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
¿Hay una migración de los compuestos del
corcho hacia el vino?
¿En qué cantidad?
¿Estas cantidades influyen en la calidad del
vino?
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo
Disoluciones de vino modelo almacenadas durante 36 meses a 30º C
Diferentes tipos de corcho:
FT- Corcho Natural “flor” con superficie tratada
TT- Corcho Natural “Third” con superficie tratada
La migración de los compuestos fue seguida por
HPLC-DAD/ESI-MS
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
Perfil representativo de HPLC de los compuestos fenólicos que migran desde las disoluciones de vino modelo después de 18 meses de almacenamiento.
Después de 9 meses los compuestos presentes en mayor
cantidad eran: ácido gálico, ácido protocatéquico, aldeido
protocatéquico y vainillina.
Entre 18 y 27 meses de almacenamiento, se detectaron
compuestos más complejos como taninos hidrolizables.
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES El contenido de estos compuestos no es suficiente para influir en la calidad sensorial del vino. Sin embargo, pueden tener un papel importante en reacciones redox.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de
vino modelo
27 months
Gallic
acid
Protocatec
huic ac
id
Castal
agin/ve
scala
gin
Protocatec
huic Aldeh
yde
Dehyd
rated
tercg
allic-
c-gluco
se
Valoneic
Acid
Ferulic
Acid
Cafeic
Acid
Di-HHDP-G
alloylg
lucose
Vanilin
Mongolicain
Valoneic
Acid-dila
ctone
Ellagic
Acid Hex
ose
Sinapic
Acid
Ellagic
Acid Pen
tose
Ellagic
Acid-deo
xyhex
ose
Ellagic
Acid0.00.10.20.3
2
4
6
8
10
Natural Cork "Flor" w ith surface treatment
Natural Cork "Third" w ith surface treatment
*
Gal
lic A
cid
Equi
vale
nts
(mg/
L)
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo
La diferencia en la migración de compuestos a lo largo del tiempo puede reforzar su importancia en el envejcimiento del vino
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
0 5 10 15 20 25 300
2
4
6
8
10
12
14***
Natural Cork "Third" w ith surf
Natural Cork "Flor" w ith surfa
MonthsTo
tal p
heno
lics
conc
entr
atio
n (m
g/l)
galli
c ac
id e
q.
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGARDECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Propiedades Antioxidantes – disoluciones vino modelo
Todas las disoluciones de vino modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales
libres (DPPH) y poder reductor (FRAP)
Esta capacidad aumentó considerablemente con los niveles de compuestos fenólicos totales.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
DPPH
FT TT0
2
4
6
8
109 months
18 months
27 monthsm
M T
rolo
x Eq
uiva
lent
s
FRAP
FT TT0
2
4
6
8
109 months
18 months
27 months
**
mM
Tro
lox
Equi
vale
nts
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Actividad antiproliferativa utilizando 2 líneas celulares de cancerígenas: MKN-28 and MCF-7
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
IC50* ± SEM
27 months MKN-28 MCF-7
TT 14.80 ± 0.43 14.44 ± 0.18
FT 14.49 ± 0.70 15.16 ± 0.37
Las disoluciones de vino modelo fueron capaces de inhibir la proliferación de las
dos líneas de células de cancer evaluadas
Stopincuba on:TCA50%,1hat4ºC
Stain:SRB(0.4%,1%ace cacid)
ReadAbsat490nm:Trizbuffer(10mM,pH8.15,30’)
Cells(protein)
24h,37ºC,5%CO2
PolyphenolConcentra ons
IC50, compound concentration (in μM) causing an inhibition by 50 % of cell growth.
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Estudios de Transporte Transepitelial
30’ 60’ 120’
Apical 0’
Caco-2 cell line
HPLC-DAD UV-Vis Spectra
MS MS, MS2 e MS3
Disoluciones de vino modelo
Apical 120’
Apical
Basolateral
12-well polycarbonate transwell, 0,4-µm, 21 days
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIEMENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Estudios de Transporte Transepitelial
El transporte de los compuestos totales a través de células Caco-2 aumentó 20-30%
indempendientemente del tiempo de almacenamiento.
(los tres principales compuestos detectados en la cara basolateral fueron el ácido galico acid, el ácido
protocatéquico y el aldeido protocatéquico. Otros compuestos se encontraron en forma de contenido traza)
No se detectaron diferencias entre los corchos “Flor” y “Third”.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
Basolateral
30 60120 30 60
120
0
20
40
60
80
100
120FT
TT
Incubation Time (min)
Tran
spor
t eff
icie
ncy
(%)
Apical
0120 0
120
0
20
40
60
80
100
120FT
TT
Incubation Time (min)
Tran
spor
t eff
icie
ncy
(%)
Wine model solution
Apical
Basolateral
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Conclusiones
La liberación de los compuestos del corcho al vino aumenta con el tiempo
Todas las disoluciones modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales
libres (DPPH) y poder reductor (FRAP).
La baja complejidad de la matriz fenólica parece facilitar su absorción y
biaoactividad
Hipótesis: Los tapones de corcho pueden reforzar las propiedades fisico-
químicas y biológicas del vino debido a la migración de los compuestos
fenólicos del corcho hacia el vino durante el período de almacenamiento.
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS
DATOS PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE COMPUESTOS
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Agradecimientos
“ O Vinho é o melhor lugar para se encontrar com os amigos”
Carlos Arruda