Productos orgánicos producidos por fermentación

Aminoácidos

Biotecnología 2015

- Albanes Ezequiel

- Albanes Leonel

- Elizondo Exequiel

- Garcia Cristian

- Luffi Paulina

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AMINOÁCIDOS

Introducción:

Los aminoácidos son la base de todo proceso vital ya que son absolutamente necesarios en todos los procesos metabólicos.

Sus funciones más importantes son:

Transporte óptimo de nutrientes

La optimización del almacenamiento de todos los nutrientes (es decir, agua, grasas, carbohidratos, proteínas, minerales y vitaminas)

Forman parte de las proteínas

Actúan como neurotransmisores o como precursores de neurotransmisores (sustancias químicas que transportan información entre células nerviosas)

Ayudan a minerales y vitaminas a cumplir correctamente su función

Algunos son utilizados para aportar energía al tejido muscular

Se los utiliza también para tratar traumas, infecciones y deficiencias de minerales o vitaminas

Un aminoácido es una molécula orgánica  con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Los aminoácidos más frecuentes y de mayor interés son aquellos que forman parte de las proteínas. Dos aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el grupo amino de uno y el carboxilo del otro, liberándose una molécula de agua y formando un enlace amida que se denomina enlace peptídico; estos dos "residuos" de aminoácido forman un dipéptido. Si se une un tercer aminoácido se forma un tripéptido y así, sucesivamente, hasta formar un polipéptido. Esta reacción tiene lugar de manera natural dentro de las células, en los ribosomas.

Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son L-alfa-aminoácidos. Esto significa que el grupo amino está unido al carbono contiguo al grupo carboxilo (carbono alfa) o, dicho de otro modo, que tanto el carboxilo como el amino están unidos al mismo carbono; además, a este carbono alfa se unen un hidrogeno y una cadena (habitualmente denominada cadena lateral o radical R) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de cada uno de los diferentes aminoácidos. Existen cientos de radicales por lo que se conocen cientos de

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aminoácidos diferentes, pero sólo 20 forman parte de las proteínas y tienen codones específicos en el código genético.

La unión de varios aminoácidos da lugar a cadenas llamadas péptidos o polipéptidos, que se denominan proteínas cuando la cadena polipeptídica supera una cierta longitud (entre 50 y 100 residuos aminoácidos) o la masa molecular total supera las 5000 uma y, especialmente, cuando tienen una estructura tridimensional estable definida.

Muchas proteínas contienen aminoácidos modificados y partes no proteicas (grupos prostéticos).

Clasificación:

Existen muchas formas de clasificar los aminoácidos; las formas que se presentan a continuación son las más comunes.

- Según las propiedades de su cadena

- Según las propiedades de su cadena lateral:

- Neutros polares, polares o hidrófilos: serina (Ser, S), treonina (Thr, T), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), asparagina (Asn, N), tirosina (Tyr, Y) y glicina (Gly, G).

- Neutros no polares, apolares o hidrófobos: alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I), metionina (Met, M), prolina (Pro, P), fenilalanina (Phe, F) y triptófano (Trp, W).

- Con carga negativa, o ácidos: ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E).

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- Con carga positiva, o básicos: lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H).

- Aromáticos: fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptófano (Trp, W) (ya incluidos en los grupos neutros polares y neutros no polares).

- Según su relación con el organismo:

El 80% de estos nutrientes se producen en el hígado humano, son los llamados aminoácidos no esenciales, y el 20% restante debe proveerse a través de la dieta y reciben el nombre de aminoácidos esenciales.

Aminoácidos no esenciales: necesarios para el buen funcionamiento del organismo, tales como: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina.

Aminoácidos esenciales: estos deben ser ingeridos en la dieta, tales como: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.

Propiedades:

Ácido-básicas.

Comportamiento de cualquier aminoácido cuando se ioniza. Cualquier aminoácido puede comportarse como ácido y como base, por lo que se denominan sustancias anfóteras. Cuando una molécula presenta carga neta cero está en su punto isoeléctrico. Si un aminoácido tiene un punto isoeléctrico de 6,1 su carga neta será cero cuando el pH sea 6,1. Los aminoácidos y las proteínas se comportan como sustancias tampón.

Ópticas.

Todos los aminoácidos excepto la glicina tienen el carbono alfa asimétrico, lo que les confiere actividad óptica; esto es, sus disoluciones desvían el plano de polarización cuando un rayo de luz polarizada las atraviesa. Si el desvío del plano de polarización es hacia la derecha (en sentido horario), el compuesto se denomina dextrógiro, mientras que si se desvía a la izquierda (sentido antihorario) se denomina levógiro. Un aminoácido puede en principio existir en sus dos formas enantioméricas (una dextrógira y otra levógira), pero en la naturaleza lo habitual es encontrar sólo una de ellas. Estructuralmente, las dos posibles formas enantioméricas de cada aminoácido se denominan configuración D o L dependiendo de la orientación relativa en el espacio de los 4 grupos distintos unidos al carbono alfa. Todos los aminoacidos proteicos son L-aminoácidos, pero ello no significa que sean levógiros.

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Químicas.

Las que afectan al grupo carboxilo, como la descarboxilación. Las que afectan al grupo amino, como la desaminación. Las que afectan al grupo R.

Estructura:

La estructura general de un alfa-aminoácido se establece por la presencia de un carbono central (alfa) unido a un grupo carboxilo, un grupo amino, un hidrógeno y la cadena lateral:

"R" representa la cadena lateral, específica para cada aminoácido. Tanto el carboxilo como el amino son grupos funcionales susceptibles de ionización dependiendo de los cambios de pH, por eso ningún aminoácido en disolución se encuentra realmente en la forma representada en la figura, sino que se encuentra ionizado.

A pH bajo (ácido), los aminoácidos se encuentran mayoritariamente en su forma catiónica (con carga positiva), mientras que a pH alto (básico) se encuentran en su forma aniónica (con carga negativa). Para valores de pH intermedios, como los propios de los medios biológicos, los aminoácidos se encuentran habitualmente en una forma de ion dipolar o zwitterión (con un grupo catiónico y otro aniónico).

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Los 20 aminoácidos (AA):

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Producción de AA:

Los aminoácidos son componentes elementales de las proteínas. Pero además son precursores de gran cantidad de biomoléculas, entre ellas las bases nitrogenadas, el ión amonio, el grupo hemo necesario para formar las sales biliares, las clorofilas, o algunos antibióticos. De los 20 aminoácidos protéicos, existen una serie de ellos que los vertebrados (entre los que se encuentra el hombre) no pueden sintetizar, y tienen que ingerirlos en la dieta. Estos aminoácidos esenciales varían dependiendo de la especie. Sin embargo, los microorganismos son capaces de sintetizar todos los aminoácidos que necesitan para vivir.

El metabolismo de los microorganismos está regulado con gran precisión. Normalmente, éstos sintetizan cantidades de aminoácidos que son justo las necesarias para cubrir sus requerimientos nutricionales. Sin embargo, existen algunos microorganismos en la naturaleza, y algunas cepas mutantes, que poseen mecanismos defectuosos para la regulación de rutas de biosíntesis específicas y, como consecuencia de ello, excretan al medio exterior grandes cantidades de ciertos aminoácidos.

El interés en la producción de aminoácidos por parte de los microorganismos se debe a que son muy útiles en numerosas áreas. Aproximadamente el 66% de los aminoácidos producidos se utilizan en la industria de la alimentación; el 30% como aditivos de piensos; y el 4%

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restante en medicina y cosmética, así como material de partida en la industria química.

De todos los aminoácidos, el de mayor interés comercial y del que más toneladas al año se producen es el ácido glutámico, que se emplea para reforzar el sabor en el sector alimentario. El ácido aspártico y la fenilalanina se utilizan en la industria alimentaria, tanto humana como animal, en la alimentación humana se emplean, por ejemplo, como ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un importante constituyente de las bebidas refrescantes dietéticas y de otros alimentos que se venden como carentes de azúcar. La lisina, es un aminoácido esencial para los seres humanos y algunos animales de granja como aditivo alimentario, y la bacteria que la produce comercialmente es Brevibacterium flavum.

Tradicionalmente desde su descubrimiento químico y del conocimiento de los innumerables beneficios que estas moléculas aportan al hombre, su uso ha sido ampliamente difundido en:

La industria alimenticia: como complementos nutricionales, alimentos entéricos, aditivos y saborizantes.

La industria agropecuaria: complementos, mezclas y acondicionadores de nutrición animal.

La industria farmacéutica: en medicina nutricional, fármacos antifatiga y de recuperación hepática.

Otras industrias: inhibidores de corrosión, biopolímeros, antioxidantes y agentes quelantes.

Industria cosmética: como agentes acondicionadores, hidratantes, neutralizantes, para permanentes capilares, agentes surfactantes y como precursores biológicos.

A medida que se ha profundizado en el estudio de los aminoácidos, se han descubierto nuevas aplicaciones cosméticas y actualmente ya existen en la industria cosmética muchas patentes y artículos que dan a conocer su eficacia y beneficios en una gran variedad y tipos de formulaciones.

Métodos de obtención:

Existen principalmente tres métodos para la obtención de aminoácidos:

- Extracción de hidrolizados de proteínas: apenas se emplea debido a que, con este método, no se pueden atender las demandas del mercado ni con el máximo rendimiento. Este método se utiliza para obtener L-cisteína, L-cistina, L-leucina, L-asparragina y L-tirosina.

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- La síntesis química: da como resultado mezclas ópticamente inactivas que contienen las dos formas posibles de un aminoácido (L y D). La producción de glicocola, D,L-alanina, D,L-metionina y D,L-triptófano siempre implica síntesis química. La síntesis química es más barata que la producción microbiana pero el producto químico es la mezcla ópticamente inactiva de los isómeros D y L. La forma que interesa producir por su importancia bioquímica es, generalmente, la forma L y, para conseguirla sin que se encuentre en una mezcla con la forma D, es necesaria una fabricación por el tercer método.

- Producción microbiológica: puede realizarse mediante procesos fermentativos, o bien mediante la síntesis enzimática. La elección del procedimiento de producción de estas biomoléculas depende de diversos factores, como pueden ser el factor económico, el tamaño del mercado al que esté destinado el uso del aminoácido, la disponibilidad de los materiales de partida, o los aspectos medioambientales.

Obtención de AA por Hidrólisis:

Los aminoácidos se obtienen por hidrólisis de proteínas. La hidrólisis significa la ruptura de las proteínas en las unidades que las forman, es decir, los aminoácidos. Tras el proceso de hidrólisis se obtiene una mezcla compuesta mayoritariamente por aminoácidos libres, aunque también contiene en menor proporción pequeñas cadenas de aminoácidos (péptido de cadena corta). La planta únicamente puede utilizar los aminoácidos libres y dentro de éstos los que son de forma L.

Las proteínas empleadas para la obtención de aminoácidos pueden ser de origen vegetal o animal. Las más aconsejables para su empleo como fertilizantes son las de origen vegetal, ya que contienen los aminoácidos que emplean las plantas en las concentraciones usuales en ellas.

La hidrólisis del material proteico para su transformación en aminoácidos libres puede realizarse por medio de enzimas proteolíticas (hidrólisis enzimática) o por ataque con ácidos concentrados como ácido clorhídrico o sulfúrico (hidrólisis ácida). La hidrólisis enzimática se realiza en condiciones suaves (aproximadamente de 60 ºC de temperatura) por moléculas que selectivamente van rompiendo las cadenas de proteína y liberando aminoácidos. Por el contrario, la hidrólisis ácida se produce en condiciones extremas (T > 100º C y medio ácido concentrado), lo que provoca la destrucción de algunos aminoácidos esenciales como el triptófano (que está relacionado con la síntesis de una hormona: el ácido indol-acético) y la obtención de una mezcla de D y L aminoácidos, no siendo útiles los D-aminoácidos para la planta, como ya se dijo.

Por tanto, puede afirmarse que los aminoácidos procedentes de la hidrólisis enzimática de proteínas de origen vegetal (soya, girasol, etc.) constituyen un fertilizante equilibrado para las plantas al contener todos

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los aminoácidos necesarios para las plantas y en las proporciones adecuadas.

Biotecnología en la obtención de AA:

Características de la fermentación en gran escala

En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aeróbica como anaeróbicamente, es decir tanto si es o no bioquímicamente una fermentación.

De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento.

El fermentador puede variar de tamaño de la escala pequeña de laboratorio (5

-10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensiones dependen del tipo de proceso y de cómo opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más grandes que los que operan en forma continua o semicontinua.

Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase principales, para procesos anaeróbicos y para procesos aeróbicos. Los fermentadores anaeróbicos requieren poco equipo especial, excepto para la remoción del calor generado durante la fermentación, en tanto que los fermentadores aeróbicos requieren equipo mucho más elaborado para asegurar la correcta mezcla y aireación.

Construcción de un fermentador aeróbico

Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es prácticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro del cual se han ajustado varios tubos y válvulas. Tiene una cubierta externa de enfriamiento, a través de la cual se hace pasar vapor o agua de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio de calor a través de la cubierta es insuficiente de modo que hay que adaptar

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serpentines internos a través de los cuales se pasa vapor o agua de enfriamiento.

En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireación ya que la transferencia de oxígeno del gas al líquido es un proceso muy difícil porque el oxígeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran población microbiana tiene una tremenda demanda de oxígeno para el cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la adecuada aireación: un dispositivo de aireación llamado difusor, y un dispositivo de agitación llamado impulsor. Para lograr una mezcla más eficiente se utilizan deflectores.

El microbiólogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente compleja dinámica de los fluidos en los fermentadores para diseñar y operar de un modo eficiente los mismos

Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador industrial; c) interior de un fermentador industrial.

Control y monitoreo del proceso

Debido a los altos costos de producción, los fermentadores industriales están cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la producción del producto , sino que se deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efectúa.

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Los factores ambientales controlados más frecuentes son: la concentración de oxígeno, pH, masa celular, temperatura y concentración del producto. También hay que controlar la formación de espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos o en el control de varios factores ambientales.

La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata. Las computadoras también pueden graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una representación visual del progreso de la fermentación. Las computadoras permiten también almacenar los datos para poder analizarlos. Las computadoras permiten un control inmediato del proceso a través de la modificación de los parámetros ambientales a medida que la fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos indeseables.

Ácido Glutámico

El Ácido Glutámico es el principal neurotransmisor excitador del Sistema Nervioso Central en el ser humano. Este ayuda a potenciar las actividades relacionadas con el aprendizaje, memorización y plasticidad neuronal durante el desarrollo del cerebro humano, por estas propiedades el ácido glutámico es incluido en la formulación de medicamentos y en suplementos vitamínicos destinados a estimular la memorización. El Glutamato Monosódico (GMS), es la sal sódica del ácido glutámico, se utiliza como aditivo en la industria alimenticia por contar con la propiedad de intensificar el sabor natural de los alimentos y por tener un bajo contenido de sodio comparado con la sal común (NaCl), convirtiéndolo en una opción para las dietas hiposódicas.

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Introducción.

A principios del siglo veinte, el profesor Kikunae Ikeda, de la Universidad Imperial de Tokio, reflexionaba sobre el sabor de las comidas: “Existe un sabor que es común a los espárragos, los tomates, el queso y la carne, pero que no es ninguno de los sabores conocidos de dulce, ácido, amargo y salado”. En 1907, inició sus experimentos para identificar cuál era el origen de este sabor distinto. Sabía que estaba presente en el “caldo” elaborado a partir del kombu (un tipo de alga), que se encuentra en la cocina japonesa tradicional. Comenzó con una cantidad muy grande de caldo de kombu y logró extraer cristales de ácido glutámico (o glutamato). Ikeda observó que el glutamato tenía un sabor diferenciado y le puso por nombre “umami”, decidió elaborar un sazonador usando su recién aislado glutamato. Para ser usado como sazonador, el glutamato debía tener algunas de las mismas características que se encuentran, por ejemplo, en el azúcar y la sal; es decir debía ser fácilmente soluble en agua, pero sin absorber la humedad ni solidificarse. También observó que el glutamato monosódico tenía buenas propiedades de conservación y un fuerte sabor umami sabroso. Resultó ser un sazonador ideal. Debido a que el glutamato monosódico carece de olor y de textura propia, se puede usar en muchos platillos, en los que potencia de manera natural el sabor original de los alimentos. El GMS o glutamato de monosodio, es la sal sódica del ácido glutámico. Se vende como una sustancia en cristales finos de color blanco, similar en apariencia a la sal o el azúcar. No tiene un gusto distintivo propio, se cree que estimula a los receptores de glutamato en la lengua para aumentar los sabores parecidos a los de la carne.

Los investigadores japoneses iniciaron el desarrollo del proceso de fermentación por medio de síntesis química obtuvieron Ácido L-glutámico y D- glutámico. La forma “L” es la más compatible con la bioquímica humana ya que metabólicamente, el ácido L-glutámico es prácticamente equivalente en forma libre o combinada, ya que las proteínas se destruyen en el aparato digestivo, produciendo los aminoácidos individuales, que son los que se absorben. El ácido L- glutámico se considera el aminoácido de mayor consumo a nivel mundial.

Usos Comerciales

El ácido glutámico es uno de los aminoácidos más abundantes en la naturaleza, forma parte de la composición de muchos alimentos ricos en

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proteínas tales como el queso, carne, pescado, leche y algunos vegetales. Los alimentos ricos en glutamato han sido utilizados como resaltadores del sabor alrededor del mundo desde hace más de 1000 años atrás.

Una de las razones por la cual el GMS se ha hecho tan popular es por su propiedad de armonizar los diferentes sabores que encontramos en nuestros 28 alimentos como ningún otro ingrediente lo ha hecho. El efecto del sabor del GMS es reconocido internacionalmente como quinto sabor básico y ha sido clasificado como potenciador de sabor (sustancias que a las concentraciones que se utilizan normalmente en los alimentos no aportan un sabor propio, sino que potencian el de los otros componentes presentes). Además influye en la sensación de “cuerpo”, en el paladar y en la viscosidad, ya que aumenta en ambas el grado de sabor, un buen ejemplo es el de sopas y salsas.

Hoy en día, esta propiedad resaltadora del sabor del GMS hace que éste sea producido no sólo para su consumo directo en los diferentes hogares del mundo, sino también para su uso como insumo en la gran industria de alimentos, siendo muchas veces indispensable en la fabricación de una variedad de productos que consumimos diariamente.

El ácido glutámico usado en aplicaciones farmacéuticas, es el resultado de un sofisticado proceso de producción, y tiene un grado de pureza considerablemente superior al del ácido glutámico usado a granel en la producción del GMS

Producción de Ácido Glutámico.

Síntesis química

El acrilonitrilo se forma catalíticamente con CO/H2 y en presencia de [Co(CO)4]2, para dar un aldehído que mediante la reacción de Strecker, en presencia de ácido cianhídrico y amoniaco, se transforma en el dinitrilo del ácido glutámico. En medio básico se obtiene la mezcla racémica del ácido glutámico, que contiene los isómeros D y L:

H2C=CH-CN OHC-CH2-CH2-CN NC-CH(NH2)-CH2-CH2-CN ácido D,L-Glutámico

La separación de la mezcla racémica se consigue favoreciendo la cristalización de ácido L-glutámico a partir de la disolución sobresaturada de la mezcla de isómeros mediante siembra con el derivado L.

Extracción de tejidos vegetales

En 1909, Saburosuke Suzuki and Ikeda llevaron a cabo por primera vez la producción industrial de L-glutamato monosódico (MSG). El primer proceso de producción industrial consistió en la extracción de glutamato a partir de proteínas vegetales, las cuales eran tratadas con ácido hidroclorídrico para romper los enlaces peptídicos. El ácido L-glutámico era entonces aislado

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desde este material y purificado como MSG. Esta producción inicial de MSG estaba limitada debido a los problemas técnicos que presentaba el método para ser desarrollado a gran escala.

La proteína vegetal hidrolizada (PVH) es fuente de glutamato procesado en la que hay concentraciones altas de dicho compuesto. Las proteínas hidrolizadas que se utilizan para realzar el sabor se preparan utilizando ácidos o enzimas que permiten digerir químicamente la harina de soja, el gluten de trigo, las cepas comestibles de levadura, etc. Este proceso, que consiste en hervir productos vegetales en un recipiente lleno de ácido sulfúrico durante varias horas, para luego neutralizar el ácido con sosa cáustica, descompone las proteínas en sus aminoácidos constituyentes. Así se obtiene un fango de color marrón que se recoge y se deja secar. El producto final es un polvo marrón con altas concentraciones de glutamato. Además, igual que el glutamato obtenido por fermentación, la PVH contiene las mismas sustancias cancerígenas que este tipo de glutamato, así como las formas D y L de esta sustancia (Sano C., 2009).

Mejoras en la producción del ácido glutámico no aparecieron hasta los años 50s. Una de estas mejoras consistía en la síntesis química directa, que fue utilizada para la producción de MSG desde 1962 hasta 1973.

Por fermentación

El ácido glutámico se fabrica predominantemente por procedimientos microbianos, aunque también es producido químicamente. Los investigadores japoneses iniciaron el desarrollo del proceso de fermentación directa debido a que el ácido D, L- glutámico que se forma por síntesis química es una mezcla racémica y únicamente la forma L es activa y posee la propiedad de potenciar los sabores.

El método de fermentación directa utiliza diferentes fuentes de carbono (glucosa, fructosa, melazas, hidrolizados de almidón, n-alcanos, etanol, glicerol, acetato, propionato); nitrógeno (urea, sales amoníacas, líquido de macerado de maíz o harina de soya); sales inorgánicas de calcio, de potasio y de magnesio; así como iones fosfato y sulfato; además cantidades mínimas de magnesio, hierro, manganeso, zinc, cobalto y biotina.

En el proceso de fermentación, se obtiene ácido glutámico crudo bajo condiciones estrictamente controladas, a partir de un microorganismo, en un sustrato al cual se le ha adicionado nitrógeno y varios nutrientes.

Muchos almidones naturales se utilizan como sustrato para la fermentación, entre ellos se encuentran: tapioca y melazas de caña de azúcar. El ácido glutámico crudo se filtra, purifica y por neutralización se convierte en glutamato monosódico. Después de una purificación adicional, cristalización y secado, el glutamato tiene forma de cristales blancos listos para ser empacados y utilizados.

Cepas de producción.

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A partir de estudios sobre 2000 microorganismos en diferentes medios, se encontró que el ácido L-glutámico es producido por una amplia variedad de bacterias, estreptomicetos, levaduras y hongos. Los ensayos realizados con el aislamiento de Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicum) dieron una mayor producción de ácido glutámico. Otras cepas industrialmente importantes pertenecen a los géneros: Corynebacterium, Brevibacterium, Micobacterium y Arthrobacter.

Morfológicamente estas cepas son generalmente bacterias Gram. (+), no esporulantes e inmóviles. Además todos los productores de ácido glutámico requieren de biotina y crecen o muestran poca actividad de glutamato deshidrogenasa.

Biosíntesis de Ácido Glutámico

La glucosa es una fuente de Carbono, esta es degradada por los microorganismos productores de Ácido Glutámico a fragmentos de C3 y C2 a través de la vía de Embeden-Meyerhof-Parnas (EMP), el ciclo de la pentosa fosfato y los fragmentos canalizados al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La vía EMP es más frecuente en las condiciones de producción de Ácido Glutámico.

El precursor clave del Ácido Glutámico es el ∞-cetoglutarato que se forma en el ciclo de TCA vía citrato e isocitrato y por aminación reductiva con iones NH4+ libres, se convierte en ácido L-glutámico. Esta última etapa es catalizada por la NADPH2 requerida, en esta etapa de la reacción, el NADPH2 es proporcionado por la oxidación descarboxilativa previa del isocitrato a ∞-cetoglutarato mediante la enzima isocitrato deshidrogenasa. El NADPH2 posteriormente es regenerado por la aminación reductiva de ∞-cetoglutarato:

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La cepa utilizada comercialmente para la producción de ácido glutámico tiene un bloqueo en la ∞-cetoglutaratodeshidrogenasa. En ausencia de iones NH4+ se acumula ∞-cetoglutarato debido a la interrupción del ciclo del TCA. Por lo tanto se requieren secuencias anapleróticas eficientes para proporcionar al ciclo del TCA, los intermediarios que se requieren para todas las demás reacciones de la célula. Se llevaron a cabo estudios sobre la vía de biosíntesis del ácido glutámico utilizando compuestos marcados durante la formación de este en presencia de CO2. Se marca radiactivamente el grupo ∞-carboxilasa y el malato dependiente de NADPH2 implicadas en el proceso de fijación de CO2. La enzima málica cataliza la carboxilación del piruvato a málico.

Estas secuencias anapleróticas completan el ciclo del TCA con ácidos di carboxílicos C4. El malato es transformado vía oxalacetato a citrato e isocitrato, los cuales sirven como etapas preliminares a la formación de Ácido Glutámico a partir de glucosa o acetato como fuente de Carbono de la siguiente manera:

C6H12O6 + NH3 + 1 ½ O2 C 5 H9O4N + CO2 + 3H2O

3C2H4O2 + NH3 + 1 ½ O2 C 5H9O4N + CO2 + 3H2O

1 mol de Ácido Glutámico se produce a partir de 1 mol de glucosa o de 3 moles de acetato.

Experimentos con células en reposo han mostrado que la velocidad de conversión real es entre 50 – 70% molar. Parte del descenso en el rendimiento se debe a la reversibilidad de la reacción de la enzima málica y a la descarboxilación del oxalato a CO2.

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Efecto de la permeabilidad en la producción de Ácido Glutámico

La producción y secreción de cantidades excesivas de ácido glutámico dependen de la permeabilidad de la célula, por ello las cepas de uso comercial para la producción de ácido glutámico son seleccionadas a través de los siguientes mecanismos:

Mediante deficiencia de biotina. Deficiencia de ácido oleico en auxótrofos para ácido oleico. Por adición de ácidos grasos saturados (C16-C18) o derivados

de los mismos. Mediante la adición de penicilina.

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Deficiencia de glicerol en auxótrofos (organismos que solamente se desarrollan en un determinado sustrato), de glicerol.

Todas las cepas productoras del ácido glutámico tienen un requerimiento de biotina para crecer. La biotina es una coenzima esencial en la síntesis de los ácidos grasos.

Durante el crecimiento con glucosa, los microorganismos súper-productores acumulan intracelularmente glutamato, hasta 25 35 μg de ácido L- glutámico/mg peso seco. Por medio de la regulación por retroalimentación o retroinhibición, se bloquea la síntesis de glutamato, salvo que se modifique la permeabilidad de la célula y de esta manera se facilita la salida del aminoácido al exterior de la célula. La modificación de la permeabilidad, se consigue con una deficiencia en el bloqueo biosintético de la biotina. Una deficiencia en biotina origina cambios en la composición lipídica de la membrana debido al papel que desempeña la biotina en la síntesis de ácidos grasos. Los niveles de biotina que se requieren para el medio son críticos a la hora de obtener una buena producción de ácido L- glutámico. Las concentraciones que se usan oscilan entre 1-5 μg/L de biotina, por ello una concentración mayor de 5 μg/L produce un aumento en la síntesis de ácido oleico, lo cual se manifiesta en un contenido mayor en fosfolípidos en la membrana celular. Las células con alto contenido en fosfolípidos son incapaces de excretar ácido glutámico. La permeabilidad también se puede alterar por la adición de penicilina durante la fase logarítmica de crecimiento, lo que favorece significativamente la secreción de ácido L-glutámico, incluso en presencia de biotina. La penicilina se adiciona a las fermentaciones en medios que contienen grandes cantidades de biotina. La utilización de penicilina o ácidos grasos saturados hace posible el uso comercial de medios de cultivo baratos, como melazas de azúcar de caña o de remolacha, que de otra manera no podrían ser utilizados debido a su alto contenido en biotina.

El descubrimiento de la importancia de la permeabilidad celular en la producción de ácido glutámico ha hecho posible realizar algunos enfoques racionales a la producción industrial de este importante aminoácido.

Condiciones de Fabricación.

Los factores que afectan la fermentación del ácido glutámico son:

Fuentes de Carbono: En la fermentación de ácido glutámico pueden ser utilizados una amplia variedad de carbohidratos. Entre los monosacáridos que se utilizan se encuentran: glucosa y sacarosa; fructosa, maltosa, ribosa, xilosa y las fuentes de carbohidratos no refinados; las melazas de caña de azúcar y de remolacha son las más importantes; así como los hidrolizados de almidón.

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Fuentes de Nitrógeno: Se utilizan las sales amoniacales, y el amonio en estado gaseoso o en solución acuosa. El amonio desempeña un papel importante en la producción industrial del ácido glutámico. La alimentación con amonio permite el control del pH y elimina el problema de la toxicidad del mismo, para ello se utiliza con mucha secuencia la urea.

Factores de Crecimiento: La concentración óptima de biotina depende de la fuente de carbono utilizada por ejemplo, en medios con el 10% de glucosa la concentración es de 5 μg/L, y en medios menores que el 10% de concentración de glucosa es menor la concentración de biotina.

Suministro de Oxígeno: La concentración de oxígeno debe ser balanceada, ya que cuando hay deficiencia de este se produce secreción de lactato y succinato; mientras que el exceso de oxígeno en presencia de una baja concentración de amonio conduce a la inhibición de crecimiento y producción de α–cetoglutaratos. En ambos casos los rendimientos de ácido glutámico son mínimos.

Proceso de Producción.

El proceso de producción de glutamato monosódico comienza con una fermentación semilla que tiene como objetivo generar biomasa de Corynebacterium Glutamicum para inocular posteriormente a los reactores de producción. El ácido glutámico se produce a partir de una fermentación y posteriormente se lleva a cabo el proceso de separación. La separación de la masa celular del ácido glutámico en solución es el primer paso para aislar los cristales de ácido glutámico, los cuales se encuentran en solución en el caldo de cultivo, para ello se hace una microfiltración, que retiene partículas de 0.1 a 10 μm. Se usan membranas fabricadas en polipropileno las cuales son resistentes y se trabajan a presiones de 0.5 a 5 kg/cm2, de esta manera se obtiene el filtrado que contiene ácido glutámico. Posteriormente esta solución se hace pasar por una columna de adsorción con el objetivo de eliminar olores y coloración. En etapas siguientes se reduce el volumen de trabajo con un evaporador, que al mismo tiempo concentra el ácido glutámico para facilitar las etapas de separación subsiguientes. La solución que contiene al ácido glutámico se neutraliza con hidróxido de sodio concentrado (NaOH 0.3N) para formar la sal cristalina de glutamato monosódico. La última parte de la purificación involucra una filtración de los cristales de glutamato monosódico para ser enviados a un secador de túnel con una humedad del 15% para salir de esta etapa con una humedad del0.04% aproximadamente. Posteriormente se realiza una reducción del tamaño de partícula (0.2-0.4mm) en un tamiz. Finalmente se dispone el glutamato en una tolva para el empacado

L-Lisina.

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La Lisina es un aminoácido esencial básico que junto con la arginina se encuentra cargado positivamente a pH neutro. Su símbolo es K en código de una letra y Lys en el de tres letras. Es un elemento esencial para la construcción de todas las proteínas en el organismo. Desempeña un papel esencial en la absorción del calcio, en la construcción de las proteínas musculares, en la recuperación de las intervenciones quirúrgicas o de las lesiones deportivas y, en la producción de hormonas, enzimas y anticuerpos.

Existen dos rutas para la biosíntesis de este aminoácido:

1.- La primera se lleva a cabo en bacterias y plantas superiores, a través del ácido diaminopimélico.

2.- La segunda en la mayor parte de los hongos superiores, mediante el ácido a-aminoadípico.

Biosíntesis de Lisina.

Como aminoácido esencial, la lisina no se sintetiza en el organismo de los animales y, por consiguiente, éstos deben ingerirlo como lisina o como proteínas que contengan lisina. Existen dos rutas conocidas para la biosíntesis de este aminoácido:

La primera se lleva a cabo en bacterias y plantas superiores, a través del ácido diaminopimélico. Esta síntesis biológica es la que se utiliza para producir industrialmente lisina.

La segunda en la mayor parte de hongos superiores, mediante el ácido α-aminoadípico.

En las plantas y en los microorganismos la lisina se sintetiza a partir de ácido aspártico, que se convierte en primer lugar en β-aspartil-semialdehído. La ciclización genera dihidropicolinato, que se reduce a Δ1-piperidina-2,6-dicarboxylato. La apertura del anillo de este heterociclo genera una serie de derivados del ácido pimélico, que finalmente generará lisina. Algunas de las enzimas que participan en esta biosíntesis son las siguientes: Aspartokinasa, β-aspartato semialdehído deshidrogenasa, dihidropicolinato sintasa, δ-1-piperidina-2,6-dicarboxilato deshidrogenasa,

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N-succinil-2-amino-6ketopimelato sintasa, Succinil diaminopimelato aminotransferasa, Succinil diaminopimelato desuccinilasa, Diaminopimelato epimerasa, Diaminopimelato descarboxilasa.

La lisina se metaboliza en los mamíferos para dar acetil-CoA, a través de una transaminación inicial con α-cetoglutarato. La degradación bacteriana de la lisina da como resultado cadaverina (una diamina biogénica que se obtiene por la descomposición del aminoácido lisina), a través de un proceso de descarboxilación.

Síntesis biológica en hongos superiores

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Producción de lisina usando Corynebacterium glutamicum

Se produce comercialmente utilizando bacterias Gram positivas como Brevibacterium flavum, que fue la primera en utilizarse pero fue desplazada por Corynebacterium glutamicum, siendo esta última la que da mayores concentraciones finales.

La vía del ácido diaminopimélico parte con la condensación aldólica entre el piruvato y el aldehido-aspártico para formar intermediarios cíclicos como el ácido tetrahidropicolínico, este último se activa con succinil-SCoA para formar el ácido N-Succinil-L, L- α ,ε-Diaminopimélico. En la siguiente reacción se libera el ácido succínico formando ahora el ácido L,L-α,ε- Diaminopimélico, que después de una isomerización y eliminación de CO2 produce Lisina.

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Medio de cultivo

El medio de cultivo debe ser aerobio, sobre un medio nutriente que comprende fuentes de carbono, nitrógeno, sales minerales y estimulantes del crecimiento.

Como fuentes de carbono se usan carbohidratos, principalmente melazas de la industria azucarera, siendo también útil el uso de ácido acético, etanol e hidrocarburos. Se añade al medio en forma de sales inorgánicas la cantidad requerida de nitrógeno, fósforo y potasio.

Para la fermentación la composición del medio de cultivo debe estar en los siguientes valores:

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-Melazas conteniendo 50% de azúcar (13% agentes reductores): 250g/L

-Extracto de maíz o de levadura: 40g/L

-Sulfato de amonio: 25g/L

-Fosfato de potasio monosustituido(KH2PO4): 5g/L

-fosfato de potasio disustituido(K2HPO4): 5g/L

-Antiespuma: 1g/L

-pH: 7-7,2

-Material de inoculación: 5% en volumen

-Temperatura: 32°C

-p02: 20% saturación total

-Se fermenta hasta concentración de agentes reductores de 0,5%

-El contenido de biomasa final es de 20g/L

Aumento del rendimiento aumentando retroinhibición

La síntesis de lisina, como la de otros aminoácidos se encuentra estrictamente regulada. Para poder obtener los aminoácidos en forma económica es necesario obtener cepas sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno general de inhibición por retroalimentación. En la vía bioquímica que conduce desde el aspartato a la lisina, esta última puede inhibir por retroalimentación la actividad de la enzima aspartatoquinasa. La sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la S-aminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por selección positiva, producen una modificación de la aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas mutantes pueden producir hasta 50 g de lisina por litro en fermentadores industriales.

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Recuperación, purificación y acondicionamiento de Lisina

La forma habitual de recuperar la lisina se basa en: separarlas las células del caldo, intercambio en resinas iónicas y cristalización como clorhidrato de l-lisina.

Para separar la biomasa se transporta a una centrifuga y luego se acidifica el medio con ácido sulfúrico para reducir la viscosidad del medio. El medio acidificado se transporta a un intercambiador iónico para separar la L-lisina de los otros aminoácidos agregándole hidróxido de amonio como eluyente. Las impurezas como los iones de amonio, potasio, calcio, sodio y manganeso son concentrados con un evaporador. El medio purificado pasa a un tanque de almacenamiento donde se agrega ácido clorhídrico y luego neutralizado. Se transporta al cristalizador de donde se obtiene L-lisina-HCl. El producto cristalizado aún posee humedad así que se la transporta a un equipo de filtración y luego a una cámara de secado donde se obtiene L-lisina con menos del 1% de humedad lista para empaque. 

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L-Triptófano

Es un aminoácido no polar, aromático neutro, al igual que la tirosina y la fenilalanina. Se obtiene mediante fermentación a partir de substratos de glucosa o indol y otros hidratos de carbono. La riqueza del producto comercial es del 98% con un equivalente en proteína bruta del 85%. La síntesis química se realiza a partir del éster acetaminomalónico y de la fenilhidracina pero esta reacción produce DL-Trp, de menor disponibilidad en monogástricos y por tanto, de escaso uso en alimentación animal.

El grupo R del triptófano tiene una estructura heterocíclica llamada indol.

Propiedades y características esenciales

Como aminoácido esencial ayuda a que el organismo elabore sus propias proteínas.

El triptófano es esencial para que el cerebro segregue la Serotonina que es un neurotransmisor cerebral.

Favorece el sueño ya que la Serotonina es precursora de hormona Melatonina vital para regular el ciclo diario de vigilia-sueño.

En algunos casos se observa un efecto antidepresivo debido a la Serotonina.

El efecto tranquilizante de la Serotonina actúa con un efecto antiansiedad o ansiolítico.

El triptófano es muy útil en problemas de obesidad donde el componente ansioso sea muy importante (por ejemplo en Bulímias) El Triptófano ayuda a que la Serotonina controle el apetito evitando así la típica ansiedad por la comida, sobre todo en aquellas personas que no pueden dejar de comer todo el día.

Al actuar sobre el estrés nos puede ayudar "de rebote" a controlar los niveles de insulina ya que esta hormona acusa, en gran manera, el estado de nuestro sistema nervioso.

En casos de agresividad debido a tensión nerviosa por ansiedad.

Ayuda a la formación de vitamina B3 o Niacina. De hecho con cada 60 miligramos de triptófano a partir de la dieta nuestro cuerpo elabora 1 mg. de Niacina (vitamina soluble en agua, actúa en el metabolismo celular como grupo prostético de coenzimas o precursora de ellas).

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Altamente estable. Masa molecular: 204.23 Formula molecular: C11H12N2O2 Nombre químico: Ácido 2 -Amino -3 indolilpropiónico Densidad a granel: 0.35 – 0.45 Kg/L Aspecto: polvo blanco. Olor: inodoro. Sabor levemente característico. Solubilidad en agua: 1.06 g/100 g de agua a 20°C No inflamable. Medio de extinción: Agua.

Aplicaciones

Este aminoácido se está empezando a utilizar para la reducción del dolor. Las variedades de dolor que pueden responder son ciertos dolores de cabeza, dental y el dolor asociado con el cáncer. La base orgánica para este efecto del triptófano sobre el dolor se establece en los núcleos del rafe. Los núcleos magno, pálido, oscuro, dorsal y tegmental son las principales estructuras serotoninérgicas del cerebro, por tanto, depende de la serotonina y de su precursor el triptófano para su funcionamiento óptimo.

Desde hace muchos años se descubrió que el tiempo para conciliar el sueño se puede reducir en forma importante administrando en forma oral el triptófano. La reducción en la latencia para dormir es un hecho importante a dosis de un gramo de triptófano.

La depresión es una enfermedad muy común en nuestros días. El triptófano es especialmente efectivo en la depresión agitada. Los antidepresivos tales como la imipramina y la nortriptilina trabajan al inhibir la recaptación de monoaminas. Es decir, prolonga la vida de la serotonina, la dopamina, etc. Aún pequeñas dosis de triptófano pueden a veces elevar en forma importante los niveles de triptófano en sangre.

También se ha relacionado los niveles de triptófano con el suicidio ya que varios estudios han demostrado niveles bajos de serotonina en el líquido cefalorraquídeo en los pacientes suicidas. Para el tratamiento de la manía, hay autores que consideran que el triptófano es tan efectivo como el litio y aún más efectivo que la clorpromazina. El triptófano puede estimular la aldosterona, la renina y el cortisol. Los pacientes con uremia necesitan más triptófano por la baja absorción. Los pacientes urémicos y los hipertensos se pueden beneficiar de los complementos de triptófano.

La administración de triptófano se ha asociado con una reducción del apetito en los pacientes deprimidos. Los complementos de triptófano pueden inhibir la gluconeogénesis, elevar el azúcar sanguíneo, aumentar el aporte de glucosa al cerebro y disminuir el apetito. Por eso, puede ser útil como terapia adjunta de la hipoglucemia.

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Obtención

Química.

El proceso químico por el cual se obtiene este aminoácido desde el punto de vista industrial resulta antieconómico, pues si bien se logra obtener el producto final, el coste de fabricación es muy elevado.

Se obtiene de la reacción de caseína y pancreatina, realizándose ésta en un medio alcalino, preferentemente con carbonato sódico, a 37°C, con una duración aproximada de 12 días, durante los cuales se agita la mezcla con alguna periodicidad. Una vez finalizada esta reacción se enfría la masa en cámara fría y se filtra. El líquido obtenido se acidifica y se hace reaccionar con sulfato mercúrico obteniéndose un precipitado que contiene triptófano.

Bioteecnológica

A nivel biotecnológico, se puede realizar por diversas formas y/o con la utilización de variados microorganismos tales como:

La fermentación de un gen derivado de la bacteria Escherichia Coli.

Producción por la transformación de un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium o Brevibacterium.

Fermentacion de variedades mutantes tales como: Corynebacterium glutamicum.

Conversión fermentativa de etapas intermedias

Se utilizan como fuentes de carbono hidrolizado de almidon o melazas, y la alimentación de azúcar/solución de NH4NO3 y antranilato comienza una vez que ha crecido el cultivo.

Procesos enzimáticos para l-tritófano

Los métodos incluyen o bien la hidrólisis esteroespecífica de compuestos de hidantoina derivados por síntesis química o la bioconversión de intermediarios. En la técnica de la hidantoinasa se utiliza una enzima de Flavobacterium aminogenes que hidroliza D, L triptófano hidantoina. Esta cepa tiene una capacidad reducida de degradación de Triptófano y la enzima se induce por adicion de D, L- triptófano hidantoina al medio. Se obtiene un 100% de conversión de la hidantoina a triptófano (material de partida 5% D, L-Triptófano hidatoina; 40º C, 100 horas), el triptófano formado se elimina de la mezcla de reacción por formación de un complejo con inosina.

El proceso comercial mas ampliamente utilizado es la técnica de la triptofanasa que implica la conversión de indol utilizando Protues rettgeri. La mezcla de reacción contiene por litro de solución de cultivo, 60 g de indol (disuelto en 100 mide metanol) 80 g de piruvato sódico, 80 g de acetato amónico, 0.01 g de fosfato de piridoxal y 1 g de sulfato sódico.

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Después de incubación a 34ºC durante 48 horas se producen 75 g de triptófano. Por precipitación del triptófano con inosina según se forma, el rendimiento puede ser incluso mas alto (83.3 g/l), lo que resulta en una eficiencia de conversión molar del 96%.

Otro proceso implica el uso de la enzima triptófano sintetasa que transforma indol y L-serina en L-Triptófano. En un cultivo mixto de E. coli y Pseudomonas putida que utiliza D, L-serina como material de partida la racemizacion de la forma D del Triptófano

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EJEMPLO DE UN DISEÑO DE EXPERIMENTOS

Utilizamos una matriz de Taguchi de cuatro variables con dos niveles de concentración para la producción de lisina por Corynebacterium glutamicum.

El medio de cultivo para la producción de L-lisina debe contener los siguientes valores de referencia para cada compuesto que integra el medio de cultivo.

COMPOSICIÓN DE REFERENCIA [g/L]Azucares reductores 250Extracto de levadura 40(NH4)2SO4 25KH2PO4 5K2HPO4 5Antiespuma 1pH 7-7,2Temperatura 32°C

En base a estos valores se eligen cuatro componentes con un nivel denominado “bajo” identificado con el número 1 en la matriz y uno denominado “alto” identificado con el número 2 en la matriz y combinando las posibilidades se realizan experimentos para obtener lisina con el método biológico descripto.

Compuesto Referencia

Bajo (1) Alto (2)

KH2PO4 5 [g/L] 2,5[g/L] 10[g/L]K2HPO4 5[g/L] 2,5[g/L] 10[g/L](NH4)2SO4 25[g/L] 15[g/L] 35[g/L]Temperatura 32°C 26°C 38°C

Concentración de L-lisina final en cada experimento:

Experimento

(NH4)2SO4

KH2PO4

K2HPO4

Temperatura

L-lisina [g/L]

1 1 1 1 12 2 1 1 13 1 2 1 14 2 2 1 15 1 1 2 16 2 1 2 17 1 2 2 18 2 2 2 19 1 1 1 210 2 1 1 211 1 2 1 212 2 2 1 213 1 1 2 2

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14 2 1 2 215 1 2 2 216 2 2 2 2

Buscamos mediante los experimentos optimizar la producción de L-lisina.

Bibliografía

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- http://www.portaley.com/biotecnologia/

- http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2010/05/05/los- microorganismos-como-factorias-produccion-de-aminoacidos/

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- http://mitecnologico.com/Main/ AminoacidosEstructuraFuncionClasificacinPropiedades

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- http://www.intrakam.com.mx/inf_tec.asp

- https://prezi.com/6ysauel_06d6/universidad-nacional-autnoma-de- honduras/

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- “PROPUESTA DE CINÉTICA DE FERMENTACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUTÁMICO” TRABAJO DE GRADUACIÓN - UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA – 2006

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- Ullmann's Enc. of Industrial Chemistry

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