Date post: | 26-Jun-2015 |
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Dos métodos para la purificación a gran escala de la colina acetiltransferasa recombinante humana
Colina AcetiltransferasaCataliza la
transferencia de un grupo acetilo desde el acetil-CoA hacia la colina para formar el neurotransmisor Acetilcolina
Deficiencia de ChAT
Desordenes neurológicos y psiquiátricos:
Alzheimer Esquizofrenia Otros desordenes
neuromusculares.
Expresión Génica del Chat
Transcripción 6mARN 1Chat Sitio adicional M-Chat Proteína 83 kDa
70 kDa Traducción S-Chat Proteína 74 kDa
¿Por qué obtener ChAT?La baja abundancia natural de ChAT en
tejidos y las dificultades en la obtención de la ChAT pura estable han disminuyendo el progreso en su caracterización biofísica.
Dificultades de obtencion del ChatLa ChAT Humana fue purificada en un
principio de placenta y cerebro , utilizando cromatografía de intercambio iónico y de afinidad con una producción final de menos de 1 mg. , estos valores no permitieron el progreso en el análisis estructural donde grandes cantidades de proteína altamente purificada son necesarias.
Primeros Trabajos Se ha utilizado cromatografía de inmuno
afinidad para purificar ChAT nativa. Se ha expresado también ChAT humana marcada con His-6 tanto en E. coli como en células high-5, lamentablemente la cantidad purificada de la forma anterior no fue suficiente para cristalización y estudios estructurales.
La sobre expresión de la proteína unida al marcador afin his-6 facilita la purificación de ChAT , con actividad enzimática comparable con la de la enzima nativa purificada desde el tejido, sin embargo el marcador de afinidad con la enzima a través de un ligando flexible y puede interferir con la cristalización y la remoción del marcador es problemática dada la sensibilidad de ChAT a la proteólisis.
Experimentos previos usando enteroquinasas para el clivaje de un marcador His6 desde la ChAT resulta en una gran degradación de la proteína. Por tanto un sistema de expresión para la ChAT humana debería, idealmente usar proteasa no exógena para remoción el marcador de afinidad o una proteasa muy especifica.
Dos Métodos El Chat es fusionado a un dominio ligador de
quitina vía un enlazador auto-empalmante que permite la liberación de Chat sin el empleo de proteasas.
El Chat es fusionada a una hexahistidina (His6) marcada en el extremo N-terminal con un enlazador que incorpora un sitio de clivaje para la proteasa TEV
Materiales y Métodos
Construcción de los vectores pTYB12-ChAT, pProEX-ChAT, y pProEX- ∆ 615ChAT
El sistema IMPACT-CN fue usado para fusionar ChAT de 70 KDa a un dominio ligador de quitina (CBD) con un elemento modificado de inteina auto-empalmante.
pTYB12-ChATcADN
Sitios de Restricción NdeI y XhoI
PCR con primers P1 y P2
Purificado en Gel y ligado a pTYB12
E. Coli XL1 Blue
Secuenciación
Producto FinalSecuencia Terminal ala – gly - his
pProEX-ChATel sistema de expresión procariótico pProEX-
HT fue usado para fusionar ChAT de 70 Kda a un His6-tag con un sitio de clivaje para la proteasa TEV para un clivaje eficiente y especifico.
pProEX-ChATcADN
Sitios de Restricción EheI y NdeI
PCR con primers P3 y P4
Celulas XL1 - Blue
Secuenciación
Clonó con pProEX-HT
Producto FinalSecuencia Terminal gly
pProEX- ∆ 615ChATEl pPreoEX-Chat fue usado como molde para
la construccion de ChAT ∆ 615
pProEX- ChATPCR con primers P3 y P5
Producto ligado a pCR- BLUNT II-TOPO
Transformadas en células competentes
PCR
Producto fue sacado por los sitiosEheI y BamHI, purificación en gel
Ligado con vector pProEX-HT
Plásmido resultante fue transformado en celulasDH5- α y fué secuenciado