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ev Lab Clin. 2013;6(1):10---17

Revista del Laboratorio Clínico

www.elsevier.es/LabClin

RIGINAL

nálisis de la composición de ácido araquidónico y ácidos grasosmega-3 en plasma, membrana eritrocitaria y células inmunitariase pacientes con cirrosis�

aura Chamorro Lópeza, Javier Martínez Gonzálezb, Ana María García Canoa,ebeca Busto Duránc,e, Agustín Albillos Martínezb,d,e y Óscar Pastor Rojoa,e,∗

Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, EspanaServicio de Gastroenterología, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, EspanaServicio de Bioquímica-Investigación, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, EspanaDepartamento de Medicina, Universidad de Alcalá de Henares, Madrid, EspanaInstituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRyCIS), Madrid, Espana

ecibido el 29 de febrero de 2012; aceptado el 28 de mayo de 2012isponible en Internet el 24 de julio de 2012

PALABRAS CLAVEÁcido araquidónico;Ácidos grasos;Cirrosis;Cromatografíade gases

ResumenIntroducción y objetivo: La participación de mediadores lipídicos derivados del ácido araqui-dónico (AA) en la lesión hepatocelular de la cirrosis y su modulación por ácidos grasos omega-3como los ácidos docosahexaenoico (DHA) y eicosapentaenoico (EPA) es un tema de interés cre-ciente. El contenido de AA, EPA y DHA puede ser importante para explicar, entre otras funciones,el tono vasoconstrictor del hígado y la capacidad funcional (fagocitosis, producción de ROS)de las células inmunitarias observada en la cirrosis. El objetivo del trabajo fue estudiar lasalteraciones en la composición de AA, DHA y EPA en plasma, membrana eritrocitaria y célu-las inmunitarias de sangre periférica en pacientes con cirrosis y establecer su relación con eldeterioro de la función hepática.Pacientes y métodos: Se analizó la composición de ácidos grasos de 42 pacientes con cirrosisclasificados según Child-Pugh y 10 controles sanos en plasma, membrana eritrocitaria y célulasmononucleares (PMBC) y polimorfonucleares (PMN) de sangre periférica por cromatografía degases con detección por masas.Resultados y conclusiones: 1) Los cirróticos presentan un descenso significativo en los porcen-tajes de AA, EPA y DHA en plasma y un descenso significativo de AA en membrana eritrocitaria.2) El contenido de AA en plasma y en membrana eritrocitaria correlaciona con el deterioro

en la función hepática (según Child-Pugh) y no depende de un deficitario aporte nutricional.3) La composición en AA y DHA está alterada en los PBMC de cirróticos, lo que pudiera tenerimportancia en la funcionalidad de las células inmunitarias de estos enfermos.© 2012 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

� Este trabajo corresponde a una comunicación científica presentada y premiada con accésit en el V Congreso Nacional del Laboratoriolínico celebrado en Málaga del 9 al 11 de noviembre de 2011.∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: opastor@ono.com (Ó. Pastor Rojo).

888-4008/$ – see front matter © 2012 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.labcli.2012.05.004

Análisis de ácido araquidónico y acidos grasos omega-3 en cirrosis 11

KEYWORDSArachidonic acid;Fatty acids;Cirrhosis;Gas chromatography

Analysis of composition of arachidonic acid and fatty acids omega-3 in plasma,erythrocyte membrane and immune cells in patients with cirrhosis

AbstractIntroduction and objetive: The involvement of lipid mediators derived from arachidonic acid(AA) in cirrhosis hepatocellular injury and its modulation by omega-3 fatty acids, such as doco-sahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) is a topic of growing interest. The contentof AA, EPA and DHA may be important to explain, among other things, the vasoconstrictor toneof liver and functional capacity (phagocytosis, ROS production) of immune cells observed incirrhosis. The objective was to study alterations in the composition of AA, DHA and EPA inplasma, erythrocyte membranes and peripheral blood immune cells in patients with cirrhosisand determine their relationship with liver function impairment.Patients and methods: We analyzed the fatty acid composition of 42 patients with cirrhosisusing the Child-Pugh classification, and 10 healthy controls in plasma, erythrocyte membraneand mononuclear cells (PBMCs) and polymorphonuclear (PMN) from peripheral blood using gaschromatography with mass detection.Results and conclusions: 1) Patients with cirrhosis showed significant decreases in the percen-tages of AA in plasma and erythrocyte membrane, as well as EPA and DHA in plasma. 2) AAcontent in plasma and erythrocyte membrane correlates with impaired liver function (Childscale) and it does not depend on a nutritional deficit. 3) AA and DHA composition varies alsoin PBMC (lymphocytes and monocytes) of cirrhosis, which may affect immune function of thesecells.

Pub

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© 2012 AEBM, AEFA y SEQC.

Introducción

El hígado es el órgano fundamental en la regulación delmetabolismo lipídico y en la síntesis de ácidos grasospoliinsaturados (PUFA). El ácido araquidónico (AA, C20:4n-6) es un PUFA de la serie omega-6 que se sintetizaen el organismo a partir del ácido linoleico (AL, C18:2n-6). El AA participa como metabolito esencial precursorde la síntesis de eicosanoides1. Su principal reservoriofuncional es la membrana celular donde se incorpora atriglicéridos, ésteres de colesterol y mayoritariamente aglicerofosfolípidos2,3. En respuesta a diferentes estímulos,el AA es liberado al citosol por la fosfolipasa A2

4 y rápida-mente metabolizado por ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2) ylipooxigenasas (5-LOX, 12-LOX, 15-LOX)5,6 produciendo múl-tiples eicosanoides como prostaglandinas, prostaciclinas,tromboxanos, y leucotrienos que participan en la respuestainflamatoria, la agregación plaquetaria y la regulación deltono vasoconstrictor en función del tejido y tipo celular7,8.

Los principales PUFA de la serie omega-3 son el ácidoeicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3) y el ácido docosahexa-noico (DHA, C22:6 n-3). Se sintetizan de forma limitada enel organismo a partir del �-linolénico (ALA, C18:3 n-3). Aligual que el AA pueden ser almacenados en los glicerofosfo-lípidos de las membranas celulares y su importancia radicaen que pueden competir con el AA por enzimas metabólicoscomunes modulando la producción de eicosanoides9.

El deterioro en la función hepática producida en lacirrosis se ha relacionado con cambios en el perfil de ácidosgrasos en plasma y en membrana del eritrocito10,11, conaumentos en la composición de ácidos grasos saturados

y descensos en monoinsaturados, y principalmente, condescensos en el contenido de AA12.

En la figura 1 se representan los posibles efectos media-dos por el AA, y modulados por los PUFA n-3, en hígado,

cenm

lished by Elsevier España, S.L. All rights reserved.

inón, plaquetas y células del sistema inmunológico. Laiodisponibilidad de AA en estos tejidos se asocia conl aumento del tono vasoconstrictor en hígado y rinón,sí como con la disfunción inmunitaria y los defectos ena coagulación observados en la cirrosis. Existen muchosstudios que relacionan la producción de eicosanoides conatologías presentes en la cirrosis. Algunos autores hanelacionado la cirrosis con un estado hipercatabólico queumenta la síntesis hepática de eicosanoides proinflamato-ios y vasoconstrictores13. Otros, relacionan déficits de AAon descensos en la producción renal de prostaglandinasasodilatadoras en el síndrome hepatorrenal14.

Por otra parte, están en revisión las alteraciones en laemostasia primaria, agregación plaquetaria y la coagula-ión de los pacientes cirróticos15,16. En las plaquetas, el AAs precursor de eicosanoides proagregantes, como el trom-oxano A2 que es sintetizado por acción de la COX-1, y desoprostanos que son generados por oxidación no enzimáticael AA por especies reactivas de oxígeno (ROS) liberadas pora actividad NADPH-oxidasa plaquetaria.

Así mismo, la cirrosis también se asocia con un fra-aso en la capacidad fagocitaria del sistema inmunitario yetículo-endotelial hepático. Los cirróticos presentan mayoriesgo a padecer infecciones bacterianas. En células del sis-ema inmunitario a partir del AA se produce leucotrieno B4LTB4), un potente quimioatrayente, inductor de adhesiónelular y de la liberación de enzimas hidrolíticos17 y ques esencial para la activación de NADPH-oxidasa citosólicael neutrófilo y la liberación de ROS18. Resulta plausibleue anomalías en ácidos grasos puedan influir en la dis-unción de las células inmunitarias observada en pacientes

irróticos19---21. El sistema retículo-endotelial está encargadon último término del aclaramiento de bacterias y antíge-os como el lipopolisacárido bacteriano (LPS) mediante losacrófagos residentes o las células Kuppfer. Estas células

12 L. Chamorro López et al

Vasoconstricción hepática

Disfunción inmunitaria

AA = ácido araquidónico; DHA = ácido docosaheaenoico. EPA = ácido eicosapentaenoico

Omega-3

Ác. Araquidónico

COOH

CH3

(EPA, DHA)PMN,PMBCplaquetas

Defectos en la agregación

LTC4PGI2

PGE2

TXA2LTB4

PGE2

LTD4

PGI2

Vasoconstricción renal

Figura 1 Efectos mediados por el AA en células y tejidos en la cirrosis. El AA es metabolizado por la vía de la COX y LOX endiferentes eicosanoides dependiendo del tejido: CysLT (LTC4, LTD4), prostaciclinas (PGI2), prostaglandinas (PGE2), tromboxanos(TXA2) y leucotrienos (LTB4). La biodisponibilidad de AA en estos tejidos se asocia con el aumento del tono vasoconstrictor en hígadoy rinón, así como a la disfunción inmunitaria y a los defectos en la coagulación observados en la cirrosis. Los ácidos grasos omega-3(

cceqrlplbLfpcl

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RBptcllS1tds

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EPA y DHA) y sus metabolitos contrarrestan la acción del AA.

uando entran en contacto con el LPS producen cisteinil leu-otrienos (CysLT) que contribuyen al tono vasoconstrictorn el hígado cirrótico, como lo demuestra recientemente,ue el tratamiento con Montelukast®, antagonista de loseceptores de CysLT, reduce la hipertensión portal en mode-os animales22. Otras sustancias como el LTB4 y diversasrostaciclinas (PGE2, PGD2, PGF2, PGI2) relacionadas con laiberación de TNF-�, óxido nítrico y ROS en el hígado13 tam-ién son liberadas por los macrófagos en contacto con elPS bacteriano. Aunque la célula de mayor trascendenciauncional sea el macrófago hepático, la evidente dificultadara su estudio en humanos, ha fomentado el estudio deélulas mononucleadas (PMBC) como modelo para examinara función del macrófago en la cirrosis.

bjetivo

l objetivo de este trabajo fue estudiar la composición deA, DHA y EPA en células mononucleadas «Peripheral Mono-uclear Blood Cells» (monocitos y linfocitos, PMBC) y Célulasolimorfonucleadas «Polymorphonuclear Blood Cells» (gra-ulocitos, PMN) de sangre periférica en pacientes conirrosis. La composición de las células, se correlacionó cona obtenida en el plasma, reflejo del metabolismo hepático,

en la membrana eritrocitaria, marcador del estado glo-

al de ácidos grasos en el organismo23. Posteriormente, seelacionó la composición de estos ácidos grasos con el gradoe deterioro de la función hepática de los pacientes conirrosis.

mee

aterial y métodos

ealizado en la Sección de Cromatografía del Servicio deioquímica Clínica del Hospital Ramón y Cajal durante uneriodo de 2 anos y con la colaboración del Servicio de Gas-roenterología, se seleccionaron un total de 42 pacienteson cirrosis descompensada de diferentes etiologías (alcohó-ica, virus hepatitis B y C) y diferentes grados de deterioro dea función hepática clasificados según la escala Child-Pugh.e incluyeron 4 pacientes Child A, 19 pacientes Child B y9 pacientes Child C. Todos los pacientes con cirrosis mos-raban un buen estado nutricional y presentaban un índicee masa corporal (IMC) superior a 18,5 kg/m2. Además, seeleccionaron 10 controles sanos.

Se obtuvieron para controles y pacientes 4 tipos de mues-ras: plasma, membranas eritrocitarias, PMBC y células PMN.

Obtención de plasma y membranas eritrocitarias: se par-ió de 3-5 mL de sangre anticoagulada con EDTA-K3 que seentrifugó a 3.000 rpm durante 15 min y se separó la faseuperior correspondiente al plasma. Las membranas eritro-itarias se obtuvieron tras un lavado con PBS y posteriorisado por choque osmótico con agua destilada fría. El lisadoe centrifugó a 20.000 g durante 20 min obteniéndose elellet correspondiente a las membranas de eritrocitos quee disolvió en PBS y se almacenó a -80 ◦C para su posteriorrocesamiento.

Aislamiento de células mononucleares (PMBC) y poli-orfonuleares (PMN): el aislamiento se realizó utilizando

l método descrito por Boyum et al.24. El método se basan la diferente flotabilidad de cada tipo celular en un

Análisis de ácido araquidónico y acidos grasos omega-3 en cirros

Monocitos

Linfocitos

Basófilos

Neutrófilos

Eosinófilos

Eritrocitos

1.060 1.070 1.080 1.090 1.100 Densidad

Mononucleares Polimorfonucleares

Figura 2 Poblaciones celulares en función de su densidad. Lascélulas mononucleares (monocitos y linfocitos, PMBC) tienen

ehmdPlea

dyszp2bl

ddLeddSmtdmm

menor densidad que las polimorfonucleares (granulocitos, PMN)y los eritrocitos.

gradiente de desidad como se indica en la figura 2. La san-

gre anticoagulada con heparina (8 mL) se diluyó con PBS y sedepositó sobre el mismo volumen de Lymphoprep (densidad1,077 g/mL, Axis-Shield). Tras centrifugación a 1.900 rpmdurante 40 min, los PMBC se aislaron de la interfase. Para

02it

Ficoll

Lymphoprep

Sangre totaldiluida

Centrifugado

Sd

Hdy

Gep

Figura 3 Aislamiento de PMBC mediante gradiente de Lymphopcentrifuga. Los linfocitos y monocitos (PMBC) se aislan en la interfgranulocitos (PMN) y eritrocitos. A la derecha se muestran las gráfic

is 13

l aislamiento de los PMN se descartó el plasma y el Lymp-oprep. Se procedió a eliminar los eritrocitos contaminantesediante sedimentación con dextrano al 6% y con solucióne lisis. Aislados ambos tipos celulares, se resuspendieron enBS y se comprobó su viabilidad, integridad y efectividad dea separación mediante un hemocitómetro como se muestran la figura 3. Posteriormente se lisaron las células en KOHl 10% y se almacenaron a -80 ◦C hasta su procesamiento.

Extracción de lípidos: para proceder al análisis de áci-os grasos en las muestras de células inmunitarias (PMBC

PMN) previamente se realizó una extracción de lípidosegún el método de Folch25. La extracción se realizó utili-ando 2 mL de clorormo/metanol (2:1) y 500 �L de muestraara mantener una proporción 1:4 y se mantuvo durante

horas en cámara fría. En las muestras de plasma y mem-rana eritrocitaria no fue necesario realizar extracciónipídica.

Análisis de AA, EPA y DHA por cromatografía de gases yetección por espectroscopía de masas: el análisis de áci-os grasos se realizó basándonos en el método descrito porepage y Roy26. Se partió de 100 �L de muestra (plasma,xtracto de membrana eritrocitaria, o extractos lipídicose las células inmunitarias), a los que se anadieron 50 �Le patrón interno (C17:0 y C23:0, 40 �g/mL cada uno).eguidamente se transesterifican con cloruro de acetilo enetanol (1,75 mL de metanol y 100 �L de cloruro de ace-

ilo por muestra) durante 18 horas a 50 ◦C. Los metilésterese los ácidos grasos (FAME) obtenidos se analizaron por cro-atografía de gases con detección por espectrometría deasas. La columna empleada fue una HP-INNOWAX® (30 m,

,25 �M, 0,1 mm). La temperatura del inyector se fijó a50 ◦C y las muestras se inyectaron en modo splitless. Senyectó 1 �L de muestra en los PMN y PMBC y 0,2 �L de mues-ra para el plasma. El horno del cromatógrafo de gases operó

ueroiluido

Mono poly I

Linfos

Monocitos

PMBC

PMN

Granulocitos

90 lo

bula

ridad

0º - Tamaño

0º - Tamaño

90 lo

bula

ridad

aloe linfocitos monocitos

ranulocitosritrocitoslaquetas...

rep. Se deposita la sangre diluida sobre el Lymphoprep y sease entre plasma y Lymphoprep. La fase inferior contiene losas de citometría procedentes del aislamiento de PMBC y PMN.

1 L. Chamorro López et al

as1cotc(Dcr

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AA, 20:4 ω-6

EPA, 20:5 ω-3

DHA, 22:6 ω-3

Figura 4 Cromatograma de ácidos grasos de membrana eri-trocitaria. Se muestra una inyección representativa con lacomposición total de ácidos grasos en la membrana eritrocita-ria de uno de los pacientes estudiados. Se indica con flechasls

ccsTedteAm

4

una temperatura inicial de 50 ◦C hasta 200 ◦C a 25 ◦C/min,eguidamente se incrementó la temperatura hasta 230 ◦C a,5 ◦C/min y se mantuvo durante 8 min. El tiempo total deada inyección fue de 35 min. El espectrómetro de masasperó en modo SIM (selective ion monitoring), con un dwellime de 25 msec. Se seleccionó un ión cuantificador y 3 ionesualificadores (cuant, q1, q2, q3) para C17:0, C23:0 y C20:074, 55, 87, 143), para AA y EPA (79, 180, 150, 108) y paraHA (79, 166, 150, 108). La estabilidad del tiempo de reten-ión se fijó utilizando bloqueo del tiempo de retención (RTL)especto al pico del ácido araquídico (C20:0).

La concentración de AA, EPA y DHA se obtuvo trasntegración de las senales correspondientes a los iones cuan-ificadores para estas sustancias e interpolación del valore las áreas sobre las curvas de calibración a 6 niveles100 �g, 50 �g, 25 �g, 12,5 �g, 6,25 �g y 3.125 �g) cons-ruidas a partir de un patrón de concentración conocidaGLC-462, NuCheck-INC) empleando el método del patrónnterno. La composición porcentual de AA, EPA y DHA enada muestra se realizó dividiendo la concentración de cadacido graso por la concentración de ácidos grasos totales enada muestra.

esultados

n la figura 4 se muestra un cromatograma como inyecciónepresentativa con la composición total de ácidos grasos enembrana eritrocitaria de uno de los pacientes estudiados.

e indican mediante flechas los picos correspondientes aA, EPA y DHA. Cromatogramas similares se obtuvieron paralasma, PMBC y PMN.

Los resultados de nuestro estudio ponen de manifiesto laresencia de anomalías en la composición de ácidos grasosn el plasma y en la membrana eritrocitaria de pacientes con

irrosis descompensada. La tabla 1 muestra los resultados deomposición porcentual obtenidos de AA, DHA y EPA en lasuestras de plasma, membrana eritrocitaria y células inmu-

itarias (PMBC y PMN) en controles y en pacientes cirróticos

sScá

Tabla 1 Composición porcentual de AA, EPA Y DHA en contromedia porcentual ± desviación estándar (n.◦ de muestras). Se dest

Control Child A

AAPlasma (%) 8,52 ± 1,6 (10) 7,21 ± 3,13 (4)

Eritrocito (%) 18,31 ± 2,79 (9) 15,14 ± 1,31 (4)

PMN (%) 6,53 ± 1,39 (9) 4,2 ± 3,27 (2)

PMBC (%) 10,34 ± 2,92 (9) 4,77 ± (2)

EPAPlasma (%) 0,53 ± 0,69 (10) 0,31 ± 0,13 (4)

Eritrocito (%) 0,31 ± 0,13 (9) 0,34 ± 0,16 (4)

PMN (%) 0,07 ± 0,1 (9) 0,08 ± 0,05 (2)

PMBC (%) 0,13 ± 0,2 (9) 0,07 ± (2)

DHAPlasma (%) 2,02 ± 0,71 (10) 1,45 ± 0,73 (4)

Eritrocito (%) 5,39 ± 0,88 (9) 5,29 ± 1,15 (4)

PMN (%) 0,53 ± 0,14 (9) 0,94 ± 0,58 (2)

PMBC (%) 0,96 ± 0,29 (9) 1,01 ± (2)

AA: ácido araquidónico; DHA: ácido docosahexaenoico; EPA: ácido eico

os picos correspondientes a AA, EPA y DHA. Cromatogramasimilares se obtuvieron en las muestras de plasma, PMBC y PMN.

lasificados según Child-Pugh. Los resultados se expresanomo la media ± la desviación estándar y entre paréntesise indica el número de muestras analizadas en cada caso.ambién se muestra el grado de significación obtenido trasl análisis ANOVA. Se marcan en negrita los resultados esta-ísticamente significativos. Como puede observarse en laabla 1, en cirróticos se evidencia un descenso significativon la composición porcentual de AA, DHA y EPA en plasma.sí mismo, se aprecia un descenso significativo de AA enembrana eritrocitaria y además se observaron diferencias

ignificativas en la composición de AA y DHA en las PMBC.

in embargo, para los granulocitos (PMN) no observamosambios significativos en la composición porcentual de estoscidos grasos.

les y pacientes cirróticos. Los resultados se expresan comoacan los resultados estadísticamente significativos

Child B Child C Anova

5,23 ± 1,62 (17) 4,72 ± 1,4 (19) 0,00015,05 ± 3,09 (19) 14,58 ± 2,93 (15) 0,0235,51 ± 2,25 (14) 4,82 ± 1,62 (10) 0,059

11,35 ± 3,67 (14) 7,2 ± 3,62 (10) 0,026

0,31 ± 0,29 (17) 0,28 ± 0,3 (19) 0,0420,32 ± 0,14 (19) 0,33 ± 0,13 (15) NS0,09 ± 0,05 (14) 0,08 ± 0,03 (10) NS0,13 ± 0,09 (14) 0,08 ± 0,04 (10) NS

1,52 ± 0,55 (17) 1,29 ± 0,48 (19) 0,0224,92 ± 1 (19) 5,23 ± 0,94 (15) NS1,36 ± 1,02 (14) 0,96 ± 0,31 (10) NS1,98 ± 0,86 (14) 1,4 ± 0,72 (10) 0,015

sapentaenoico; NS: no significativo.

Análisis de ácido araquidónico y acidos grasos omega-3 en cirrosis 15

10,0

A B

C

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Plasma

P = 0,001 P = 0,004

P = 0,01

P = 0,4P = 0,02

Membrana eritrocito

PMBC

20,0

16,0

12,0

8,0

8,0

6,0

Áci

do a

raqu

idón

ico

(%)

Áci

do a

raqu

idón

ico

(%)

Áci

do a

raqu

idón

ico

(%)

4,0

6,0

2,0

8,0

4,0

Control Child A Child B Child C Control Child A Child B Child C

Control Child A Child B Child C

Figura 5 Composición porcentual de AA, en plasma, membrana eritrocitaria y células mononucleadas (PMBC). Se representanlos box-plot de la composición porcentual (%) de AA en controles y cirróticos clasificados según la escala Child. Los valores de

ras e

ytcvaestdcdsorción de grasas asociados al descenso en la producción de

significación (P) corresponden a las comparaciones bivariadas t

Los resultados correspondientes al AA en plasma, mem-brana eritrocitaria y PMBC se representan en las gráficasblox-pot en la figura 5. Se muestran los valores de signifi-cación (p) correspondientes a las comparaciones bivariadastras el ANOVA. Si comparamos los resultados en controles concirróticos Child C, se obtuvo una p = 0,001 en plasma, p = 0,04en membrana de eritrocito y una p= 0,01 en PMBC. Se puedeobservar, por tanto, como el descenso de AA va siendo másacusado en aquellos pacientes con mayor deterioro de lafunción hepática.

Discusión

Los resultados obtenidos en nuestro estudio ponen de mani-fiesto descensos en la composición de ácidos grasos (AA, DHA

áev

l ANOVA.

EPA) en el plasma y además de AA en la membrana eritroci-aria de pacientes con cirrosis descompensada. Estos datosorroboran los resultados obtenidos por Cabré et al.12. Sonarias las razones que han sido argumentadas en los últimosnos para explicar este descenso. Por un lado, los cirróticosspecialmente aquellos de etiología alcohólica, suelen pre-entar deficiencias nutricionales11. En un estudio en pacien-es con hepatopatía crónica se observaron carencias en laieta que reducían la disponibilidad de ácidos grasos esen-iales precursores como AL17. En otros estudios, el descensoe ácidos grasos se relacionaría con problemas de malab-

cidos biliares27-29 o también al déficit en las actividadesnzimáticas (elongasa y desaturasa) necesarias para la con-ersión de AL en AA que en animales cirróticos han resultado

1

ddar

onbdynahedmEtr

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1

2

3

C

L

B

1

1

1

1

1

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1

1

1

6

eficitarias30. Además, el intento de normalizar el balancee ácidos grasos en enfermos con cirrosis avanzada mediantedministración intravenosa de preparados ricos en precurso-es como AL y ALA no ha obtenido resultados satisfactorios31.

En nuestro estudio, el déficit de AA y ácidos grasosbtenido, no parece deberse a la existencia de un aporteutricional deficitario ya que se incluyeron pacientes conuen estado nutricional (IMC > 18,5 kg/m2) y con cirrosis deiferentes etiologías (tanto etílica como por virus hepatitis B

C) por lo que podemos deducir que la deficiencia nutricio-al no parece ser la causa del déficit sino que se encuentrasociada a la funcionalidad hepática de estos enfermos. Deecho, nuestros resultados demuestran que el déficit de AAn plasma y en membrana eritrocitaria correlaciona con eleterioro de la función hepática y que esta deficiencia esás acusada en enfermos con mayor deterioro de la misma.

n un estudio anterior, en una serie de 101 pacientes cirró-icos se demostró que concentraciones de AA disminuidaselacionaba con la supervivencia de los enfermos12.

Los resultados obtenidos en las células inmunitariasuestran una disminución significativa en la composicióne AA en las PMBC de los pacientes cirróticos. Puesto que nos descartable que la presencia de un déficit de AA en estasélulas afecte a la producción de LTB4, la capacidad fagoci-aria de las mismas pudiera verse afectada. De hecho, haystudios que han demostrado que los monocitos de pacientesirróticos presentan una capacidad fagocitaria disminuida32.tros estudios, asocian una capacidad de producción de ROSn neutrófilos alterada en los cirróticos, reduciendo su capa-idad de respuesta frente a bacterias33. En nuestro estudioo hemos encontrado diferencias significativas en la compo-ición de ácidos grasos en los granulocitos (PMN) estudiados.

Otro resultado a considerar es la alteración en la com-osición de DHA en las PMBC en los pacientes cirróticos. Sebserva una tendencia a que los cirróticos presenten unaayor composición de DHA que los controles pero no sabe-os cuál es la causa, aunque parece que pueda influir en la

espuesta inmunitaria.Los omega-3 están encargados de aumentar la producción

e mediadores antiinflamatorios (protectinas y resolvinas)ue reducen el estrés oxidativo y el dano necroinflamato-io en el hígado34. La suplementación de ácidos grasos en lairrosis ha renovado su interés35 y podría ser de relevancia,or tanto, valorar el efecto que sobre los pacientes cirró-icos y sobre las células del sistema inmunitario pudieranjercer futuras intervenciones en el aporte de ácidos grasosmega-3 en pacientes con hepatopatía crónica.

Las conclusiones más relevantes de nuestro estudio son:

) Los cirróticos presentan un descenso significativo en losporcentajes de AA, EPA y DHA en plasma y un descensosignificativo de AA en membrana eritrocitaria.

) El contenido de AA en plasma y en membrana eritrocita-ria correlaciona con el deterioro en la función hepática(según Child-Pugh) y no depende de un deficitario aporte

nutricional.

) La composición en AA y DHA está alterada en los PBMCde cirróticos, lo que pudiera tener importancia en la fun-cionalidad de las células inmunitarias de estos enfermos.

1

L. Chamorro López et al

onflicto de intereses

os autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

ibliografía

1. Buczynski MW, Dumlao DS, Dennis EA. Thematic Review Series:Proteomics. An integrated omics analysis of eicosanoid biology.J Lipid Res. 2009;50:1015---38.

2. Quehenberger O, Dennis EA. The human plasma lipidome. N EnglJ Med. 2011;365:1812---23.

3. Christie WW. Lipid Analysis - third edition. Bridgwater: The OilyPress; 2003. Chapter 1.

4. Burke JE, Dennis EA. Phospholipase A2 structure/function,mechanism, and signaling. Journal of lipid research. 2009;50Suppl.:S237---42.

5. Haeggström JZ, Funk CD. Lipoxygenase and leukotriene path-ways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem Rev.2011;111:5866---98.

6. Rouzer CA, Marnett LJ. Cyclooxygenases: structural and func-tional insights. Journal of lipid research. 2009;50 Suppl.

7. De Caterina R. n-3 fatty acids in cardiovascular disease. N EnglJ Med. 2011;364:2439---50.

8. Serhan CN, Savill J. Resolution of inflammation: the beginningprograms the end. Nat Immunol. 2005;6:1191---7.

9. Simopoulos AP. Essential PUFAs in health and chronic disease.Am J Clin Nutr. 1999;70:S560---9.

0. Johnson SB, Gordon E, McClain C, Low G, Holman RT. Abnormalpolyunsaturated fatty acid patterns of serum lipids in alcoholismand cirrhosis: arachidonic acid deficiency in cirrhosis. Proc NatlAcad Sci U S A. 1985;82:1815---8.

1. Sarin SK, Dhingra N, Bansal A, Malhotra S, Guptan RC. Die-tary and nutritional abnormalities in alcoholic liver disease: acomparison with chronic alcoholics without liver disease. Am JGastroenterol. 1997;92:777---83.

2. Cabré E, Abad-Lacruz A, Núnez MC, González-Huix F,Fernández-Banares F, Gïl A, et al. The relationship of plasmapolyunsaturated fatty acid deficiency with survival in advan-ced liver cirrhosis: multivariate analysis. Am J Gastroenterol.1993;88:718---22.

3. Clària J, Horrillo R, Martínez-Clemente M, Morán-Salvador E,Titos E, González-Périz A, et al. Basic mechanisms ofhepatocellular injury. Role of inflammatory lipid mediators.Gastroenterología y hepatología. 2008;31:682---92.

4. Rimola A, Ginés P, Arroyo V, Camps J, Pérez-Ayuso RM,Quintero E, et al. Urinary excretion of 6-keto-prostaglandin F1alpha, thromboxane B2 and prostaglandin E2 in cirrhosis withascites. Relationship to functional renal failure (hepatorenalsyndrome). J Hepatol. 1986;3:111---7.

5. Tripodi A, Mannucci PM. The coagulopathy of chronic liverdisease. N Engl J Med. 2011;365:147---56.

6. Violi F, Basili S, Raparelli V, Chowdary P, Gatt A, BurroughsAK. Patients with liver cirrhosis suffer from primary hae-mostatic defects? Fact or fiction? J Hepatol. 2011;55:1415---27.

7. Flamand L, Tremblay MJ, Borgeat P. Leukotriene B4 triggersthe in vitro and in vivo release of potent antimicro-bial agents. J Immunol (Baltimore, Md: 1950). 2007;178:8036---45.

8. Hii CS, Ferrante A. Regulation of the NADPH oxidase activity andanti-microbial function of neutrophils by arachidonic acid. ArchImmunol Ther Exp (Warsz). 2007;55:99---110.

9. Munoz L, Albillos A, Nieto M, Reyes E, Lledó L, Monserrat J, et al.Mesenteric Th1 polarization and monocyte TNF-alpha produc-tion: First steps to systemic inflammation in rats with cirrhosis.Hepatology. 2005;42:411---9.

irros

2

2

3

3

3

3

Análisis de ácido araquidónico y acidos grasos omega-3 en c

20. Xing T, Li L, Cao H, Huang J. Altered immune function ofmonocytes in different stages of patients with acute on chronicliver failure. Clin Exp Immunol. 2007;147:184---8.

21. Albillos A, Hera Ad Ade L, Reyes E, Monserrat J, Munoz L,Nieto M, et al. Tumour necrosis factor-alpha expression byactivated monocytes and altered T-cell homeostasis in asciticalcoholic cirrhosis: amelioration with norfloxacin. J Hepatol.2004;40:624---31.

22. Steib CJ, Bilzer M, op den Winkel M, Pfeiler S, Hartmann AC,Hennenberg M, et al. Treatment with the leukotriene inhibi-tor montelukast for 10 days attenuates portal hypertensionin rat liver cirrhosis. Hepatology (Baltimore, Md). 2010;51:2086---96.

23. Harris WS. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease: acase for omega-3 index as a new risk factor. Pharmacol Res.2007;55:217---23.

24. Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytesfrom human blood. Isolation of monuclear cells by one cen-trifugation, ando f granulocytes by combining centrifugationand sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl.1968;97:77---89.

25. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for theisolation and purification of total lipides from animal tissues.J Biol Chem. 1957;226:497---509.

26. Lepage G, Roy CC. Direct transesterification of all classes oflipids in a one-step reaction. J Lipid Res. 1986;27:114---20.

27. Jimenez G. Sindromes de malabsorción, fisipatología. Arch Gas-troenterol. 1975;2:135---59.

3

3

is 17

8. Cabré E, Hernández-Pérez JM, Fluvià L, Pastor C, Corominas A,Gassull MA. Absorption and transport of dietary long-chain fattyacids in cirrhosis: a stable-isotope-tracing study. Am J Clin Nutr.2005;81:692---701.

9. Nakamura MT, Tang AB, Villanueva J, Halsted CH, Phinney SD.Selective reduction of delta 6 and delta 5 desaturase activitiesbut not delta 9 desaturase in micropigs chronically fed ethanol.J Clin Invest. 1994;93:450---4.

0. Duerksen DR, Nehra V, Palombo JD, Ahmad A, Bistrian BR. Essen-tial fatty acid deficiencies in patients with chronic liver diseaseare not reversed by short-term intravenous lipid supplementa-tion. Dig Dis Sci. 1999;44:1342---8.

1. Mookerjee RP, Stadlbauer V, Lidder S, Wright GA, Hodges SJ,Davies NA, et al. Neutrophil dysfunction in alcoholic hepatitissuperimposed on cirrhosis is reversible and predicts the out-come. Hepatology (Baltimore, Md). 2007;46:831---40.

2. Tritto G, Bechlis Z, Stadlbauer V, Davies N, Francés R, Shah N,et al. Evidence of neutrophil functional defect despite inflam-mation in stable cirrhosis. J Hepatol. 2011;55:574---81.

3. González-Périz A, Planagumà A, Gronert K, Miquel R,López-Parra M, Titos E, et al. Docosahexaenoic acid (DHA)blunts liver injury by conversion to protective lipid media-tors: protectin D1 and 17S-hydroxy-DHA. The FASEB journal.2006;20:2537.

4. Lee S, Gura KM, Puder M. Omega-3 fatty acids and liver disease.Hepatology (Baltimore, Md). 2007;45:841---5.

5. El-Badry AMM, Graf R, Clavien PAA. Omega 3 - Omega 6: Whatis right for the liver? J Hepatol. 2007;47:718---25.