Date post: | 12-Jul-2015 |
Category: |
Health & Medicine |
Upload: | andrea-vazquez |
View: | 904 times |
Download: | 1 times |
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA; FACULTAD DE MEDICINA; LICENCIATURA EN
BIOMEDICINA; DHTIC; ANDREA JUDITH VÁZQUEZ HERNÁNDEZ – 201301958
APLICACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DEL DNA
RECOMBINANTE
Introducción
Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea ha sido el
desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas
dos disciplinas (muy relacionadas entre sí) se ha logrado manipular
genéticamente a los individuos con el fin de propiciarles nuevas
características.
El ADN recombinante es una forma de ADN artificial que se crea mediante la
combinación de dos o más secuencias que normalmente no ocurren al
mismo tiempo. La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible
investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente
de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos.
La Tecnología del DNA recombinante se origino ́ en los comienzos de
1970 por Peter Lobban, un estudiante graduado, con A. Dale Kaiser en el
Departamento de Bioquímica de la Universidad de Stanford, con el
descubrimiento de las endonucleasas de restricción, enzimas capaces de
realizar el clivaje especifico del DNA en fragmentos determinados.
La tecnología del DNA recombinante depende, en parte, de la
capacidad de cortar y unir segmentos de DNA por secuencias específicas de
bases. Utilizando esta metodología, se pueden transferir segmentos
particulares de DNA a virus o a bacterias para amplificarlos, aislarlos e
identificarlos. La utilización de esta tecnología ha conseguido importantes
avances en la cartografía de genes, en el diagnóstico de enfermedades, en la
producción comercial de productos génicos humanos y en la transferencia
de genes entre especies diferentes, tanto en plantas como en animales.
Es difícil exaltar el impacto que el surgimiento de las técnicas de DNA
recombinante ha tenido en la capacidad de generación de conocimiento y
en la capacidad de manipulación de organismos vivos. Vivimos una época
de acumulación de conocimientos sin precedente.
Por mucho que los logros de aplicación práctica se hayan quedado
cortos respecto a ciertas expectativas, nos encontramos cada día con más
productos y procesos biotecnológicos inimaginables hace un par de
décadas. El progreso paulatino observado en épocas pasadas, como por
ejemplo el mejoramiento de procesos de fermentación, o de cepas
productoras de antibióticos, de razas animales y variedades de plantas de
cultivos, están siendo suplantados por progresos cualitativamente diferentes,
que se hacen posibles por el nuevo conocimiento y herramientas de
manipulación. Hoy día hablamos de plantas y animales transgénicos,
expresión de proteínas humanas en bacterias, hongos y células de cultivo,
terapia génica, ingeniería de vías metabólicas, diagnóstico a partir de
cantidades minúsculas de material biológico, etc.
1. Tecnología del DNA recombinante en genética.
La posibilidad de
introducir secuencias
foráneas de DNA al genoma
de una célula, para que ésta
lo exprese como si fuera
suyo ha revolucionado el
estudio de la genética es muchos aspectos, ya que ha permitido entender
mejor cómo se dan los mecanismos de regulación y expresión génica, y por
la misma vía se han mejorado las técnicas de mapeo y cartografía de genes.
La construcción de genes artificiales tanto en procar iotas como en
eucariotas ha sido un punto de partida muy importante para comprender la
dinámica de la información genética en los sistemas vivos, ya que se ha visto
que los diferentes tipos celulares se diferencian en la expresión de un mismo
material genético, lo cual produce un resultado distinto cada vez. Esta
técnica también ha sido el medio para la detección y comprensión de varias
enfermedades genéticas. Esta técnica se está usando actualmente para la
cartografía de genes humanos, que dado el tamaño y la complejidad de este
genoma, es una tarea ardua y morosa si se la realiza con las técnicas
tradicionales de mapeo genético por medio de frecuencias de
recombinación, siendo además este método impreciso por la influencia de la
interferencia.
La detección de enfermedades genéticas y otros problemas
relacionados se ha visto obstaculizada por la imprecisión de las técnicas
tradicionales de cartografía, pero hoy en día es posible efectuar estos
análisis con mayor precisión utilizando como marcadores a los RFLP
(polimorfismos de longitud fragmentos de restricción), los cuales se
producen por la acción de diferentes enzimas de restricción, y estos
fragmentos son altamente específicos y cualquier variación da la posibilidad
de detectar mutaciones, ya sean éstas de carácter mendeliano o no. Incluso
esta técnica puede ser empleada para el estudio del ligamiento de genes, ya
que si se construyen familias de RFLP en varias generaciones es posible
incluso detectar genes completamente ligados, lo que a veces no se puede
hacer con las técnicas tradicionales pues no se pueden diferenciar de los
genes no ligados.
2. Detección de enfermedades genéticas.
El diagnóstico de las enfermedades
hereditarias consiste en la detección de las
alteraciones o variaciones de la constitución
genética de un individuo que están directa o
indirectamente relacionadas con estados
patológicos. El diagnóstico basado en el estudio
del ADN ha experimentado un avance
considerable en el último decenio fruto de la
identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de
genes implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de
numerosas patologías genéticas puede ser abordado en los laboratorios de
genética molecular humana, tanto con una finalidad clínica como de
investigación básica.
Las estrategias para el diagnostico genético las podemos clasificar
como directas o indirectas en función de si se detecta o no el gen
implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnóstico identificando
en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en cuestión.
Desafortunadamente el número de enfermedades producidas por más de un
tipo de mutación en un mismo o diferentes genes supera a aquellas que son
consecuencia de una única mutación. Ello hace que el diagnóstico directo
presente en muchas ocasiones problemas prácticos.
La segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen
implicado, pues se fundamenta en el estudio de la herencia conjunta de
marcadores anónimos y el locus de la enfermedad estudiada. Para este fin,
es preciso que el marcador utilizado presente un fuerte ligamento con el
locus de interés, además de otras características que lo harán más o menos
adecuado para el diagnóstico.
El máximo nivel de precisión del diagnóstico directo se obtiene con la
secuenciación de los nucleótidos correspondientes al locus mutado, sin
embargo la aplicación de esta estrategia diagnóstica de forma generalizada
es por el momento inviable.
Por lo general el diagnostico directo de una mutación se realiza mediante el
estudio de los cambios que esta produce en la estructura primaria
(secuencia), en las propiedades fisicoquímicas de la molécula de ADN o bien
en los cambios que se presentan en el producto génico. Básicamente
podemos distinguir cuatro tipos de cambios o mutaciones del ADN:
Cambios de nucleótidos. Una base es substituida por otra distinta.
Existen dos tipos de cambios, las transversiones (una purina (A o G)
por una pirimidina (C o T) y las transiciones (una pirimidina por una
pirimidina o una purina por una purina),
Pequeñas deleciones o inserciones. Un número reducido de
nucleótidos se pierden o insertan, alterando la secuencia y tamaño de
la molécula de ADN,
Grandes reorganizaciones. Ganancias, pérdidas o reorganizaciones de
grandes fragmentos de ADN
Mutaciones dinámicas. Repetición inestable de trinucleótidos en
distintas regiones de un gen.
Los cambios de nucleótidos y las pequeñas deleciones o inserciones
alteran la estructura primaria del ADN y pueden dar lugar a variaciones del
tamaño de la molécula o bien, como veremos más adelante, pérdidas o
ganancias de dianas de restricción. Así ́ mismo la molécula mutada puede
presentar variaciones en sus propiedades fisicoquímicas que alteren su
movilidad electroforética o sus propiedades de apareamiento
complementario. Las grandes reorganizaciones y las mutaciones dinámicas
provocan generalmente variaciones en el tamaño de la molécula de ADN.
Finalmente, las mutaciones pueden ser detectadas en el producto génico
cuando estas dan lugar a mensajeros inestables o de tamaño distinto o bien
a proteínas truncadas.
3. Mutaciones direccionales.
Otra ventaja de la tecnología de DNA
recombinante es que abre la posibilidad de realizar
mutaciones direccionales, que a diferencia de las
mutaciones naturales, que ocurren de una manera
aleatoria, permiten analizar una característica en
particular, sin importar la complejidad o el comportamiento del organismo a
diferentes condiciones.
Además la posibilidad de realizar mutaciones dirigidas reduce al máximo el
sesgo que representan sobre los resultados las mutaciones adicionales no
detectables que se puedan dar en el proceso de inducción de mutagénesis
por técnicas físico–químicas.
4. Cromosomas artificiales.
La producción de cromosomas artificiales ha abierto las puertas a un
campo antes poco comprendido por los científicos: la regulación de la
expresión genética. Hasta hace algunos años todavía no se tenía claro el
proceso o los procesos por los cuales una sola célula inicial daba lugar a
diferentes tipos celulares, y cómo un mismo genoma podía codificar
diferentes proteínas en cada uno de estos tipos celulares. La introducción de
cromosomas artificiales en estos distintos tipos celulares ha llevado a
comprender y evidenciar el mecanismo de regulación de esta expresión, y
estos aplicación ha sido también un importante punto de partida para
verificar la existencia y comprender el funcionamiento de las secuencias de
regulación de genes y los mecanismos por los cuales actúan los
interruptores moleculares. Estos estudios también han ayudado de cierta
manera a comprender mejor el funcionamiento de varias enzimas
relacionadas con la replicación y reparación de ácidos nucleicos, como la
enzimas de restricción y las polimerasas.
5. Producción de sustancias útiles y medicinas.
Esta es una de las primeras aplicaciones que se encontró para la
tecnología del DNA recombinante en el campo de la medicina. La
producción de proteínas, enzimas, vitaminas y ácidos nucleicos por medio de
bacterias mutantes ha permitido la obtención de estas sustancias en grandes
cantidades a precios mucho más bajos, haciéndolas más accesibles al
público.
El ejemplo clásico de esto y una de las mayores producciones
bacterianas por DNA recombinante es la producción de insulina en cepas de
E. coli modificadas. La insulina es una hormona de carácter proteico que se
sintetiza en los islotes de Langerhans en el páncreas de los mamíferos, la
cual se encarga de regular los niveles de azúcares en el organismo mediante
un complejo sistema de cascadas enzimáticas. La diabetes es una
enfermedad que afecta a millones de personas en el mundo, y produce una
deficiencia en la síntesis de esta proteína, por lo cual a los enfermos de
diabetes se les debe administrar una dosis diaria de insulina. Hasta hace
algunos años esta insulina se extraía de otros mamíferos y su costo era
elevado, pero la tecnología de DNA recombinante permitió introducir el gen
que la codifica en el genoma de E. coli, la cual produce esta proteína como
si fuese propia, incluso se ha visto que en algunos cultivos ésta llega a
constituir un 40% de la carga proteica total de la célula. Entonces, un cultivo
celular de reducido costo puede producir una gran cantidad de insulina,
haciéndola más accesible para los enfermos que padecen diabetes.
6. Detección y tratamiento de enfermedades genéticas.
Las técnicas de clonación selectiva de DNA, entre las que se incluye el
DNA recombinante, permiten el estudio de muchas enfermedades genéticas.
El aislamiento y clonaje de un determinado gen responsable de una
enfermedad genética provee información importante para diseñar estrategias
de mitigación del mal o incluso puede dar las luces para la producción de
una cura. Dos de las enfermedades genéticas que se han estudiado
mediante la técnica de RFLP son la neurofibromatosis y el síndrome de
Marfan.
La neurofibromatosis afecta a 1 de cada 3000 individuos y produce
una variedad de defectos en el sistema nervioso, que son responsables en
gran medida de los problemas de aprendizaje y de la aparición de tumores
benignos en el cerebro. Esta enfermedad se produce por un alelo
autosómico y es de carácter recesivo. La cartografía de este gen por los
métodos tradicionales resulta una tarea prácticamente imposible, puesto que
el estudio de las familias de genes relacionadas con este mal representaría
una cartografía completa de los 22 cromosomas humanos, puesto que
tienen una elevada tasa de mutación espontánea.
7. Terapia génica.
El rastreo y caracterización de los genes que producen las
enfermedades genéticas desde un principio tuvo la finalidad de ofrecer un
tratamiento a estas enfermedades, de esto surge el concepto de terapia
génica, la cual consiste en transferir alelos normales a un individuo enfermo
para eliminar su problema. Ya se han hecho varios experimentos en ratones
y otros animales, en los cuales se ha logrado exitosamente restaurar el
funcionamiento normal de un alelo por la inserción de la cadena correcta
mediante un vector. El que hayan resultado exitosos los ensayos realizados
en ratones abre la mente a creer que en unos años más este tipo de terapia
pueda ser usada para curar las cientos de enfermedades genéticas de los
humanos.
La terapia génica tiene ya una cierta historia, en un principio se
aplicaba en humanos, inoculando al organismo dosis significativas de la
proteína faltante o defectuosa, por ejemplo, se administraban fuertes dosis
de insulina a enfermos de diabetes, con la finalidad de que una elevada
concentración de la proteína funcional restaure la secuencia genética.
Desafortunadamente este tipo de terapia génica no tuvo éxito, y los estudios
derivados a investigar el o los mecanismos necesarios para el reemplazo de
una secuencia defectuosa por una normal, mediante el uso de vectores y
técnicas de DNA recombinante.
Este proceso todavía está en fase experimental y aún no hay datos
sobre ensayos exitosos en humanos, todas las prueba realizadas se han
hecho en invertebrados como Drosophila y en mamíferos pequeños como
Mus musculus. Si bien el proyecto genoma ya ha dado una versión
preliminar de la secuencia de los 23 cromosomas humanos, y las técnicas de
transferencia de genes están cada día más avanzadas, todavía resulta difícil
aislar genes específicos sanos en humanos, y más difícil aún el implantarlos
en el sitio correcto, en un organismo enfermo. El tamaño y la complejidad
del genoma hacen de ésta una ardua tarea.
8. Aplicaciones forenses.
La tecnología de DNA recombinante ha pasado a ser un fuerte aliado de la
medicina forense y la investigación criminal. Características genéticas
específicas están siendo usadas como pruebas contundentes en cientos de
juicios hoy en día, puesto que basta una célula de donde se pueda aislar
DNA para identificar a una persona, con menos de un 1% de error. Esta
técnica se viene usando desde hace algunos años para pruebas de
paternidad, problemas de inmigración (para determinar razas) y como una
huella molecular para identificar criminales. No obstante, estos
procedimientos han levantado fuertes críticas éticas, ya que en algunos
casos estos resultados llevan a discriminaciones raciales y a problemas
familiares.
Actualmente se usan los minisatélites o VNTR (secuencias muy repetitivas en
tandeo) como huellas moleculares, puesto que al ser éstas altamente
variables, la combinación de los distintos satélites y la posición de cada uno
es una característica única de cada persona, la cual no se puede modificar,
ocultar o borrar.
9. Plantas y vacunas transgénicas.
Otra de las aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante en las
plantas es la producción de plantas transgénicas con vacunas. Las formas
tradicionales de producción de vacunas son la utilización de capas
inactivadas o atenuadas de la bacteria o virus. La tecnología del DNA
recombinante ha permitido el desarrollo de vacunas genéticas o también
llamadas vacunas de subunidad, en las que se producen grandes cantidades
de una proteína de superficie del virus o la bacteria contra la cual se desea
hacer la vacuna, y esta proteína va a generar los anticuerpos necesarios para
hacer frente a la enfermedad.
La aplicación de esta técnica de biotecnología funciona así: se aísla el
fragmento de DNA que codifica la proteína de superficie que irá a constituir
la vacuna de subunidad, se utiliza como vector el plásmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens y se produce una planta recombinante a partir
del callo formado, una vez desarrolladas las plantas, éstas expresarán el
antígeno contra la enfermedad. De esta manera se producen grandes
cantidades de vacuna a costos reducidos, y la administración de la misma se
hace más fácil, puesto que estos vegetales podrían ser comercializados para
su consumo normal, luego de una certificación previa de los efectos
colaterales que pueda tener el consumo de estas plantas alteradas
genéticamente. Esta técnica se ha aplicado con éxito en la producción de
antígenos para la hepatitis B en plantas de tabaco.
Todavía falta hacer una gran cantidad de estudios en esta área, pero
las perspectivas actuales muestran una interesante potencialidad a la
producción de vacunas de subunidad en plantas transgénicas, ya que esto
abriría la posibilidad de prevención de muchas enfermedades mortales, para
las cuales no se conocen vacunas tradicionales, y además deja abierta la
posibilidad de una vacunación por medio de los alimentos.
10. Producción de animales transgénicos mediante DNA recombinante.
Si bien la aplicación de la tecnología
de DNA recombinante para la producción de
animales transgénicos se viene realizando desde hace algunos años en los
principales centros de investigación científica del mundo, todavía se levanta
polémica acerca de la ética y la manipulación genética de animales, y más
aún de humanos.
Numerosos estudios realizados en animales transgénicos han
permitido entender mejor la evolución de los sistemas de regulación génica,
la mayor parte de estos estudios se han hecho en Drosophila melanogaster
y ratones de laboratorio. Dichos experimentos han sido un importante
respaldo para las investigaciones que trataron y todavía tratan de dilucidar
por completo el funcionamiento de las regiones de control de los genes, y el
cómo operan los promotores y los inhibidores de genes, y el papel que
éstos tienen en la diferenciación celular y la producción diferencial de
proteínas de acuerdo a lo que se denominó un subprograma de vida.
11. La tecnología de DNA recombinante y el ambiente: bioremediación.
Los problemas de contaminación actualmente están recibiendo gran
atención por parte de las autoridades ambientales en el mundo entero. Si
bien los problemas de contaminación no se pueden revertir, en la actualidad
existe otra alternativa: la bioremediación. Bioremediación se define como el
proceso de descontaminación mediante la inducción de bacterias capaces de
degradar las sustancias contaminantes. Si bien esta técnica tiene apenas 10
años de antigüedad e investigación, hoy en día son muchas las aplicaciones
que se le da. Se emplea bioremediación para la degradación de petróleo, de
metales pesados, de insecticidas e incluso para combatir radiación.
La bioremediación puede aplicarse usando bacterias silvestres que
tengan la capacidad de degradar el contaminante con el que se está
tratando, sin embargo, en muchos casos se deben construir bacterias –
mediante técnicas de DNA recombinante– para la remediación de un
contaminante determinado.
Si bien se conocen cerca de 70 géneros de bacterias silvestres que
pueden ser usadas para bioremediación, la producción de bacter ias
modificadas va ganando terreno e importancia día a día. Numerosos
estudios ha utilizado bacterias modificadas genéticamente para la
descontaminación de ambientes, con un impacto mínimo a largo plazo,
puesto que al ser éstos descontaminadotes agentes biológicos, reducen y
controlan su población luego de cumplir su función, y viven en los
ambientes junto con el resto de la microflora.
12. DNA recombinante en la industria.
En la actualidad existen muchas aplicaciones industriales para la
tecnología de DNA recombinante. Los productos que se generan a partir de
organismos recombinantes son muchos y tienen diferentes finalidades, que
van desde la industria vitícola hasta la producción de medicamentos.
El microorganismo protagonista en la industria por DNA recombinante
es la levadura Saccharomyces cerevisiae, que al ser un organismo eucariota
simple del cual se tiene ya un gran conocimiento, se facilita la producción de
sustancias mediante su maquinaria biosintética. Actualmente se usan cepas
de levadura modificadas para la producción a gran escala de taumatina y
quimosina. La taumatina es una proteína de origen vegetal, unas 200 veces
más dulce que la sacarosa y es usada comercialmente en edulcorantes y
como aditivo para muchos alimentos. La quimosina, también conocida como
renina, es una proteína que se utiliza en grandes cantidades para la
producción de queso.
El primer fármaco con licencia clínica producido por ingeniería genética fue
la insulina humana. La insulina consiste en dos cadenas de aminoácidos (A y
B) unidas por dos puentes disulfuro. La insulina procede de un péptido
original (proinsulina) que, con la acción con proteasas específicas, pierde un
segmento intermedio de su secuencia (segmento C).
Para conseguir insulina humana en bacterias se desarrollaron dos métodos:
Método 1: Se sintetizaron químicamente dos cadenas de ADN con las
secuencias correspondientes a las cadenas A y B, gracias al conocimiento del
código genético. Además se incorporó un codón para la metionina al
principio y otro codón de fin de mensaje al final de cada cadena. Cada
cadena sintética se insertó en un vector de expresión, unida a la secuencia
codificante de la b-galactosidasa. Los plásmidos recombinantes se
introdujeron en E. coli, expresándose las proteínas de fusión b-galactosidasa-
(metionina)-insulina. Tras purificar las proteínas de fusión y tratando con
bromuro de cianógeno, que rompe los enlaces peptídicos tras los residuos
de metionina, se obtienen las dos cadenas de la insulina separadas.
Convenientemente tratadas con un agente formador de puentes disulfuro se
unen las dos cadenas formando la insulina madura.
Método 2: Se obtuvo por clonación celular el ADNc de la proinsulina y se le
añadió un triplete sintético para la metionina. La secuencia se insertó en un
vector de expresión fusionado con la b-galactosidasa. Tras la expresión y
eliminación de la parte b-galactosidasa, la proinsulina adopta
espontáneamente su conformación tridimensional nativa y, finalmente, se
digiere enzimáticamente el segmento C para originar la insulina madura.
Discusión y conclusión
En la actualidad existen muchas aplicaciones industriales para la tecnología
de DNA recombinante. Los productos que se generan a partir de organismos
recombinantes son muchos y tienen diferentes finalidades, que van desde la
industria vitícola hasta la producción de medicamentos.
El microorganismo protagonista en la industria por DNA recombinante es la
levadura Saccharomyces cerevisiae, que al ser un organismo eucariota simple
del cual se tiene ya un gran conocimiento, se facilita la producción de
sustancias mediante su maquinaria biosintética. Actualmente se usan cepas
de levadura modificadas para la producción a gran escala de taumatina y
quimosina (Smith & Wood 1998). La taumatina es una proteína de origen
vegetal, unas 200 veces más dulce que la sacarosa y es usada
comercialmente en edulcorantes y como aditivo para muchos alimentos. La
quimosina, también conocida como renina, es una proteína que se utiliza en
grandes cantidades para la producción de queso.
Bibliografía
1. Serrato, P. (31-Octubre-2012) “Principios de la tecnología del DNA
recombinante”. Recuperado el día 22 de Junio del 2014 de:
http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&
cd=2&sqi=2&ved=0CCAQFjAB&url=http%3A%2F%2Fsiladin.cch-
oriente.unam.mx%2Fcoord_area_cienc_exp%2Fbiologia%2Fpracticas_pe
dro_serrato%2FBio-I_Lecturas%2FB-1%2520Super-
Lecturas%2F45%2520DNA%2520RECOMBINANTE.docx&ei=JqmnU56q
NsTQsQSZg4BY&usg=AFQjCNFDLngvtmLHBxCbMaT9RRUreqs2FQ&bv
m=bv.69411363,d.cWc
2. Amgen (2014) “Biotecnología”. Recuperado el día 22 de junio del 2014
de:
http://www.amgen.es/doc3.php?op=profesionales_medicos2&ap=biote
cnologia&sub=bio4
3. Berg, P., Boyer, H., Cohen S. (Febrero 2008) Tecnología del DNA
recombinante. Recuperado el día 22 de junio del 2014 de:
http://botanik2.files.wordpress.com/2008/02/capitulo-28.pdf
4. Goyanes M. (S/F) ADN Recombinante. Recuperado el día 22 de junio
del 2014 de:
http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r73849.PDF
5. Agolti, G.; Brandan, N.; Campos, R.; Codutti, A.; Vera, C. (2007)
Tecnología del DNA recombinante. Recuperado el día 24 de junio del
2014 de: http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/dnarec07.pdf
6. Fibla, J. (octubre, 2001) El diagnostico de las enfermedades
hereditarias. Recuperado el día 24 de junio del 2014 de:
http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/GenClin/content/recursos
_classe_(pdf)/revisionsPDF/DiagGenet.pdf