Date post: | 02-Feb-2016 |
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Bases moleculares de la tolerancia a disolventes orgánicos en Pseudomonas
A. Segura, E. Duque, F. Junker, G. Mosqueda, A. Rojas,
P. Godoy, A. Hurtado, W. Teran, M. T. Gallegos and J.L. Ramos
CSIC-Estación Experimental del ZaidínGranadaESPAÑA
Los microorganismos tolerantes a disolventes orgánicos son útiles para:
Descontaminación de sitios muy contaminados
Biotransformaciones en sistemas de doble fase
Biosensores
*Inoue and Horikoshi, 1991, Nature 338, 264-266Pseudomonas putida, toluene tolerant
*Cruden et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58, 2723-2729P. putida , p-xylene tolerant
*Weber et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3502-3504P. putida, styrene tolerant
*Ramos et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 3911-3916P. putida, toluene tolerant and able to use toluene as the only carbon source
Cepas tolerantes a tolueno
*Pseudomonas putida DOT-T1E (aguas residuales)
*Pseudomonas putida MTB6 (suelo)
*Pseudomonas putida S12
Crecimiento de P. putida DOT-T1E in presencia de disolventes orgánicos a
Disolventes log PowCrecimiento (OD660)
n-Decanon-Octano
n-HeptanoPropilbenzeno
DietilphthalatoCiclohexano
Ethilbenzenop-xilenoEstirenoTolueno
1-HeptanolDimethilphthalato
BenzenoCloroformo
Butanol
5.64.54.13.63.33.23.13.13.02.52.42.32.02.0
0.8
>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>1.0>1.0<0.1<0.1<0.1
aCélulas cultivadas en medio LB en presencia de 1% (vol/vol) del disolvente
LB LB+tol(g)
+0.3% tol -0.3% tol-0.3% tol +0.3% tol
10-1 10-3
10-510-7
.... .... .. ...
... ... .... .. ..... ..... .
..
10-1 10-3
10-510-7
.... .... .. ...
... ... .... .. ..... ..... ..
.
10-1 10-3
10-510-7
.... .... .. ...
... ... .... .. ..... ..... .
.
10-1 10-3
10-510-7
.... .... .. ...... ..
. ..... ... .
200 40 600
5
10
Tiempo (min)
Log
UF
C
TOLERANTE
LB LB+tol(g)
+0.3% tol -0.3% tol-0.3% tol +0.3% tol
10-1 10-3
10-510-7
10-1 10-3
10-510-7
10-1 10-3
10-510-7
10-1 10-3
10-510-7
.... .... .. ...
... ... .... .. ..... ..... ..... .... .
. ...... ... .... .
. ..... ..... .
.... .... .. ...
... ... .... .. ..... ..... .
.
.
...
200 40 600
5
10
Tiempo (min)
Log
UF
C
SENSIBLE
200 40 600
5
10
Tiempo (min)
Log
UF
C
200 40 600
5
10
Tiempo (min)L
og U
FC
TOLERANTE SENSIBLE
¿Porqué son Pseudomonas DOT-T1E and MTB6 tolerantes a tolueno?
Barreras bioquímicas que implican el catabolismo de los compuestos Bombas de extrusión Barreras físicas que incrementan la rigidez de
membrana
¿Está el catabolismo de los disolventes orgánicos
implicado en la tolerancia?
Hay cepas tolerantes que no los degradan
Ver si mutantes que no degradan los disolventes y
son igual de tolerantes que la cepa silvestre
CH3
ISPTOL
ISPTOL
(todC1C2)FerredoxinTOL
FerredoxinTOL
(todB)ReductaseTOL
ReductaseTOL
(todA)
NAD+
NADH+H+
O2
CH3
OH
OH
H
H
toluene
cis-toluene dihydrodiol
NAD+
(todD)NADH+H+
CH3
OH
OH
3-Methylcatechol
O2 (todE)
Ring fission
X F C1 C2 B A TSIGED H
Time (minutes)
Log
CF
U
TodC1 mutant
tod
CC118pir pUTkan-phoA DOT-T1E
phoA kamR
Benzoato/Kan/Azules
KanR PhoA
SphI SphI
SphI SphI SphI SphI
SphI SphI
SphI
SphI
SphI SphI
SphISphI SphI
SphI
KanR
SphISphI
SphI
SphI
KanR
NotI SphINotI SphINotIMarcaje con DIG
Crecimiento en presencia de disolventes orgánicos
NingunoEtilbenzenolog Pow 3.5
Octanollog Pow 2.8
Toluenolog Pow 2.5
Silvestre + + + + + + + + + + + +
DOT-T1E-18 + + + + + + + + + --
DOT-T1E42 + + + + + + + + + --
DOT-T1E109 + + + + + + + + + --
¿Porqué son Pseudomonas DOT-T1E and MTB6 tolerantes a tolueno?Barreras bioquímicas que implican el
catabolismo de los compuestos
Otros factores
Barreras físicas que aumentan la rigidez de la
membrana
Bombas de extrusión
Bombas de eflujo
¿Es la tolerancia a disolventes un proceso
dependiente de energía?
*El rendimiento de cultivos crecidos en tolueno
es un 30% del obtenido en ausencia de tolueno
*Cuanto mayor es la polaridad del disolventemenor es el rendimiento del cultivo
Incorporación de 1,2,4-[14C]-triclorobenzeno
en membranas celulares de P. putida cells
Condiciones 14C/mg proteína celular
No-tratadas 20.000
Tratadas con FCCP 300.000
Incorporación de 1,2,4-[14C]-triclorobenzeno en
membranas celulares of P. putida
Condiciones
de cultivo
14C/mg proteína celular
Silvestre DOT-T1E18
LB
LB+ tolueno
66.000
59.000
301.000
124.000
DOT-T1E-18
ttgR ttgA ttgB ttgC
Pertenecen a la familia de las RND (resistencia, nodulación, división
celular)
TtgB tiene una alta homología con MexB de Pseudomonas aeruginosa
La bomba está formada por tres componentes
TtgB
TtgC
TtgA
membrana
externa
Espacio periplásmico
membranainterna
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
?
NH2COOH
A B C
D
Citoplasma
TtgC TolC
ttgR ttgA ttgB ttgC
9
5
10 20 40 40200
log
UF
C m
l-1
Tiempo (min)
X F C1 C2 B A TSIGED H
todS todT ttgF ttgE ttgD
1 Kb
1 Kb
ttgD ttgE ttgF
ttgD ttgE´ ttgE ttgF
1
1
2
2 ttgF´ttgEttgD ttgE
ttgD ttgE´ ´ttgE ttgF
ttgD ttgE´ ´ttgE ttgF
´ttgE´ ´ttgE
ttgF ttgFE´ ´ttgE
14020 00
Cél
ula
s vi
able
(lo
g U
FC
ml-1
)
Tiempo (min)
9
5
DOT-T1E DOT-T1E-1
DOT-T1E-18 DOT-T1E-82
20 40
5
9
1
genDNA
5´ 3´ATG Stop
Inductor
RNAP32
P32
P32
P32
P32
P32
X F C1 C2 B A TSIGED H
todS todT ttgF ttgE ttgD
1 Kb
1 Kb
0
DOT-T1E-82
20 40Cél
ula
s vi
able
s (l
og U
FC
ml-1
)
Tiempo (min)
1
5
9
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
14020 00
Cél
ula
s vi
able
s (l
og U
FC
ml-1
)
Tiempo (min)
9
5
DOT-T1E DOT-T1E-1
DOT-T1E-18 DOT-T1E-28
20 40
5
9
1
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
A C G T -tol +tol
Crecimiento en LB+tol (g)
Tiempo (horas)
log
D.O
660
0,1
0,01
1
10
0 5 1510 20 25
Sustratos TtgABC TtgDEF TtgGHI
Tolueno
Estireno
m-xileno
Propilbenceno
Etilbenceno
Tetraciclina
Ampicilina
Cloramfenicol
Gentamicina
Nalidixíco
Carbenicilina
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
Cél
ula
s vi
able
s (l
og U
FC
ml-1
)
Tiempo (min)
9
5
DOT-T1E DOT-T1E-1
40200
DOT-T1E-18 DOT-T1E-28
40200 4020040200
TtgABC TtgDEF TtgGHISilvestre
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
ttgT ttgD ttgE
ttgF
ttgR ttgA ttgB
ttgC
A G T C 1 2 3 4
A C G T -tol +tol
ttgR ttgA ttgB
ttgC
TTGCATGAGGATCCTCGGGTCGCTGGAGCAGGGAGACGCTCAAGAGTAATGGAA
GAGATCTTGATCTGGAAAAAATGCTATCCGGTGGATAAATAGCTTGCTAAGGAA
TATACTTACATTCATGGTTGTTTGTAAATACTGCTGGGTGGTACTCAGGTACAG
CCTCAGCGCTTGATTAGCTTATCCGAGAGGCCCCGGCAGAGGTGCCCCCGGAGC
GTTCCCCGCACGCGCTGCGCGTTCGGGCCAGATGAGGTTGTACTGCCATGGTC
ttgAttgR
C
1
55
109
163
217
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
165bp220bp
SU
PE
RV
IVE
NC
IA (
log
UC
F/m
l)
TIEMPO (min)
8
6
4
2 DOT-T1E
DOT-T1E-18
DOT-T1E-13
DOT-T1E-15
8
6
4
2
Susceptibilidad a antibióticos
Genotipo Cb Cm Nal
DOT-T1E Silvestre 128 64
DOT-T1E-18 ttgB::Tn5 16 32
DOT-T1E-13 ttgR::Km 1024 256
512
Tc
4
8 0,24
256 16
MIC (g ml-1)
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
m-RNA
c-DNA
Transcripción reversa
PCR
A C G T -tol +tol
V-G G-H H-I Controles negativosV-W
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
A
TtgG
C T A CG G T+ +--
TtgV
ttgV ttgG ttgH ttgIttgW
8
6
4
2
SU
PE
RV
IVE
NC
IA (
log
CF
U/m
l)
TIEMPO (min)
DOT-T1E
D8
6
4
2
B
0 30 60 0 30 60
C
TtgV-
TtgW- TtgVW-
ttgHttgVttgG
ttgI
ttgW
aphA
Kam
Kam
DOT-T1E
TtgV-
TtgW-
TtgVW-
Wt PS52 PS61 PS62 0
1000
2000
PttgG
0
1000
2000
PttgV
Wt PS52 PS61 PS62 ttgW- ttgV- ttgvW- ttgW- ttgV- ttgvW-
Un
idad
es M
iller
24293645
66
20
14,2
A
2429
3645
20
14,2
B 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8
0,50 5 50 0,5 5 50 500 ng DNA no marcado
Específico Inespecífico
nM TtgV50 1501000
TtgV
DNasa
GCGTCAAGAGTATCACATAA
g His-TtgV 0
4.0Frag
men
t Abu
ndan
ce
Strain 0.1% toluene N.I. I
0.3% toluene N.I. I
Toluene tolerance
P. putida DOT-T1E 1 1 10-4-10-5 0,5-1 H
P. putida MTB6 1 1 10-4-10-5 10-1 H
P. putida S12 1 1 10-6 10-2-10-3 M/H
P. putida MTB5 10-4 1 <10-8 10-6 M
P. putida SMO116 10-4-10-5 10-1 <10-8 <10-8 M
P. putida F1 10-4 10-3 <10-8 10-7 M
P. putida 43 10-3-10-4 10-5-10-
6
<10-8 <10-8 M
P. putida JLR11 10-3-10-4 10-4-10-
5
<10-8 <10-8 M
P. putida 2440 10-5 10-6 <10-8 <10-8 S
P. putida OUS82 10-5 10-5 <10-8 <10-8 S
P. mendocina KR1 10-6 10-8 <10-8 <10-8 S
P. aeruginosa SSS1 10-7 10-7 <10-8 <10-8 S
P. aeruginosa 7NSK2 10-6 10-7 <10-8 <10-8 S
P. aeruginosa PAO1162 1 10-4 <10-8 <10-8 M
P. aeruginosa 1162RK 1 10-2 <10-8 <10-8 M
P. fluorescens PF11 1 10-1 10-7 10-7 M
P. fluorescens EEZ23 10-6 10-6 <10-8 <10-8 S
P. stutzeri 10-6 10-4 <10-8 <10-8 S
P. syringae pv. syringae
10-5 10-5 <10-8 <10-8 S
Strains Tolerance ttgABC ttgDEF ttgGHI
P. putida DOT-T1E H +
+ +
P. putida MTB6 H +
+
+
P. putida S12 H + - +
P. putida F1 M + +
-
P. putida MTB5 M + +
-
P. putida SMO116 M + +
-
P. putida 43 M + -
-
P. putida JLR11 M + -
-
P. putida 2440 S + -
-
P. putida OUS82 S + -
-
Reparación de membranas
Composición de los grupos de cabeza de los fosfolípidos
de P. putida DOT-T1E en ausencia y presencia
de disolventes orgánicos
Disolvente orgánico PE PG CLPE
PG+CL
Ninguno 78 10 12 3.5
Tolueno (1% vol/vol) 65 9 26 1.8
Proporción de lípidos insaturados Cis/transde Pseudomonas creciendo enausencia y presencia de 0.5%
(vol/vol) de disolventes orgánicos
None
Heptane
Ethylbenzene
m-Xylene
Toluene
7.5
3.0
1.0
0.9
1.0
Cis/trans
Disolventes
Ácidos grasos
saturados isómero-cis isómero-trans
C14:0C16:1 cisC16:1 transC16:0C17:ciclopropanoC18:2 cis cisC18:1 cis olC18:1 cis vaC18:1 trans vaC18:0
cis/transsaturado/insaturado
LB LB +1%(v/v) tolueno
1.035.45.1
35.01.11.04.0
24.30.0
0.95
11.10.62
1.025.314.333.31.01.03.0
20.03.90.9
2.550.45
actctimetH
182bp
5´-CATAGGAACTACCTTACCTGGTCGGGCGAATATCAGAAGGTGCCGAATCATAACAAA
GCTGCGCGGTTTTTAGGCATGTCGCCCATTTGCATGAAAACTGCTCATGTTG
GGCGGGTGGAGGCAGCGCAAGGCACCCAGGACGACCAGGCAACAAATCGTGA
TGGCTTTCAAGAACCAGGACTTTCCGCACATG-3´
194bp
5´-TGATCGGGTTGGCTGACCTTTCCGAGTACCTTGCGGTCGGAATGGGTG
GGTGGTCTTGATCGATTGCAAAGGGGGCTGCTTTGCAGCCCTTCGCGG
GTGAACCCGCTCCTACAACAGGTACGGCGCTGCTCTGAAGGCTGGCGC
TGGCCTCTGCACTCGATACGGGCCTCAATGCACCGCCAAGCGCAGGGT
ATTCCATG-´3
BglII BglIISphI SphI2.9 kbp 2.4 kbp1.6 kbp
6.9 kbp
BglII BglIIBamHIBamHI BglII
0,57kbp
KpnI
0,8 kbp 1,5 kbp 1,6 kbp
ctiT1
N-terminal region
ctiT1
N-terminal region
DOT-T1E-P4
Ácido grasoCondiciones de crecimiento
LB LB más heptano
C14:0
C16:1,9 cis
C16:1,9 trans
C16:0
C17:ciclopropano
C18:2
C18:1,9 cis ol
C18:1,11 cis vac
C18:1,11 trans vac
C18:0
2
5
0
44
27
1
1
16
0
2
1
10
0
46
4
1
3
26
0
8
0 2 4 6 8 10 12
0.2
0.4
0.6
0.8
Tiempo (horas)
Tur
bide
z (O
D 6
60nm
)
metH ctiT1 phoA
SacI KpnI BamHI HindIIIA
B
0
1
2
2 4 6 8 100
4
8
12
Tu
rbid
ez (
OD
660
nm)
Tiempo (horas)
mp
NP
/min
/Tu
rbid
ez (
OD
660
nm)
TIEMPO (min)
8
6
4
2
SU
PE
RV
IVE
NC
IA (
log
UF
C/m
l)
DOT-T1E DOT-T1E-109
213-222
YTSGSSGVLKYTGGTTGVAKE. coli
P. putida. DOT-T1E
ATP/AMPbinding site 1
ATP/AMP binding site 2
352-357
GYGAGEGYGLTE
NGWLHTGDIAVMDEEGFLRIVDRKKDGYYLTGDLATVDEQGYVFIVDRKK
E. coli
P. putida DOT-T1E
Fatty Acid binding site (FACS signature motif)
TtgJ
434-458
1 565
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
30 90 120
Time (min)
13C
600
1000
2000
3000
4000
30 90 120
Time (min)
13C
60
BA
LB+Tolueno
LB
Silvestre PtgA:lacZ 50 70
PtgD:lacZ 0 5
PtgG:lacZ 400 1000
DOT-T1E-109 PtgA:lacZ 50 70
PtgD:lacZ 225 1600
Cepa Fusion
Unidades Miller
PtgG:lacZ 1100 3750
Sin tolueno Con tolueno
rpfG lysS
rpfA rpfB rpfF
rpfC rpfH prfB rpfD recJ rpfE greA
enoyl-CoA hydratase
rpfA: aconitase
rpfB: long chain fatty acyl CoA ligase
rpfF:
rpfC/rpfG:
rpfH: putative regulator
“two component” sensor regulator pair
Physiological/environmentalinfluences
Lipid biosynthetic orcatabolic pool
Fatty acyl CoA
RpfF
RpfB
FA-X
XGeneregulation
DSFX ?
Funciones inesperadas
1.-Reparación de membranas
2.- Implicación de los flagelos
(c)
(d)
1 2 3 1 2 3
1 2 3240 bp
1
220 bp
240 bp
(c)
(d)
1 2 3
240 bp
325 bp325 bp
240 bp
1 2 3
DOT-T1E DOT-T1E-42
1 2 3240 bp
1
220 bp
2 3
240 bp
DOT-T1E DOT-T1E-PS23
fliK fliL fliM fliN fliO fliP fliR flhBfliQ
1Kb
fliK fliL fliM fliN fliO fliP fliR flhBfliQ(a)
1Kb
orf563
DOT-T1E
DOT-T1E-42
DOT-T1E-PS23
+ + + + +
+
+
+
+
-
+
+
+
+
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
(b) fliK-fliL fliL-fliM fliN-fliO fliO-fliPfliM-fliN fliP-fliQ fliQ-fliR fliR-flhB
+ + + + +
+
+
+
+
-
+
+
+
+
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
+
+
+
(b)-
-
-
BamHI BamHI
8
6
4
2S
UP
ER
VIV
EN
CIA
(lo
g U
FC
/ml)
TIEMPO (min)
A B
D8
6
4
2
C
DOT-T1E
0 30 60 0 30 60
FliP-
FlhB-FliL-
log
CF
U
10
5
00 20 40 60
DOT-T1E (wild-type)
time (minutes)
KT2440
DOT-T1E
16 hs. 48 hs.
1M A E S E S G Q D K T E D P T D KATG GCA GAA AGC GAG AGC GGT CAG GAC AAG ACA GAA GAC CCC ACC GAC AAA
18R K R D A R E K G E I A R S K E LCGC AAG CGC GAT GCG CGT GAA AAA GGA GAG ATT GCC CGT TCA AAA GAG CTG
Q V H C OPA35 CAG GTG CAT TGT TGAN T V V L T L G G A G A L L T F GAAC ACC GTC GTA TTG ACC CTG GGG GGG GCA GGT GCA TTG TTG ACA TTC GGC G R C I V D I R GGC AGG TGC ATT GTT GAC ATT CGG
52G H L A E T L L T L M R M N F S LGGG CAT CTG GCC GAG ACC TTG CTG ACA TTG ATG CGC ATG AAT TTT AGC CTCR A S G R D L A D I D A H E F AMBCGG GCA TCT GGC CGA GAC CTT GCT GAC ATT GAT GCG CAT GAA TTT TAG
69T R D V I V D E R A M G A F L L AACC CGG GAT GTG ATC GTC GAC GAG CGG GCA ATG GGC GCT TTC TTG CTG GCG
86 ... .... 392S ... ... ... G OCHTCT ... ... GGG TAA
LB solid--LB liq. 0,3%tolLB solid--LB liq.l
LB soft--LB liq. 0.3%tolLB soft--LB liq.
10
5
00 20 40 60
Log
CF
U
Time (minutes)
DOT-T1E (2 days)
Time (minutes)
10
5
00 20 40 60
Log
CF
U
DOT-T1E (1 day)
LB--LB
LB--0,3%tol
LB(g)--LB(g)
LB(g)--0,3%tol
10
5
00 20 40 60
Time (minutes)
Log
CF
U
DOT-T1E
10Gs (truncated protein)
11Gs (protein + 1aa)
LB--LB liq. 0,3%tolLB--LB liql
LB--LB liq. 0.3%tolLB--LB liq.
10Gs
11Gs
10
5
00 20 40 60
Log
CF
U
Time (minutes)
FlhB-
FlhB-
Motility Toluene tolerance
DOT-T1E
DOT-T1E
pMCS5-flhB2440
pMCS5-flhBT1E
+ -
--
pMCS5-flhB2440
pMCS5-flhBT1E
+ -
--
ATGGCAGAAAGCGAGAGCGGTCAGGACAAGACAGAAGACCCCACCGAAAAGCGCAAGCGCGACGCCCGCGATGGCAGAAAGCGAGAGCGGTCAGGACAAGACAGAAGACCCCACCGACAAACGCAAGCGCGATGCGCGTG
AGAAGGGCGAGGTCGCCCGCTCCAAGGAGCTGAACAGGGTGGCGGTGACCCTGGCGGGTGCCGGTGGCCTAAAAAGGAGAGATTGCCCGTTCAAAAGAGCTGAACACCGTCGTATTGACCCTGGGGGGGGCAGGTGCATT
CCTGGCGTTCGGCGGCCACGTGGCCGAGACATTGCTTGTTGACATTCGGCGGGCATCTGGCCGAGACCTTGCTG
KT-2440 MAESESGQDK TEDPTEKRKR DAREKGEVAR SKELNTVAVT LAGAGGLLAFMAESESGQDK TEDPTDKRKR DAREKGEIAR SKELNTVVLT LGGAGALLTF
GGHVAETLLA LMRMNFSLTR DIIVDERAMG AFLLASGKMA IWAVQPVLILGGHLAETLLT LMRMNFSLTR DVIVDERAMG AFLLASGKMA IWAVQPVLGL
LFVVSFVAPI ALSGFLFSGS LLQPKFSRMN PLSGIKRMFS MQALTELLKALFVLALIGPV ALGGFLFSGS LLQPKFSRMS PLSGIKRMFS LNSVTELLKA
LAKFFVILVV AVVVLSGDRQ ALLSIANEPL EQAIIHSLQV VGWSALWMSAVAKFFVILVV ALVVLSHDRQ ALLAIANEPL EQAIIHAVQV VGWSALWMAA
GLLLIAAADV PFQLYQTHKK MKMTKQEVRD EYKDSEGKPE VKQRIRQLQRGLLLIAAVDV PFQLWQTQQK LKMTKQEVRD EYKDSEGKPE VKQRIRQLQR
EVSQRRMMAA VPDADVIITN PTHYAVALQY DPEKGGAAPL LLAKGSDFMAEASQRRMMAA VPDADVIITN PTHYAVALQY DPEKGGVAPL LLAKGTDFIA
LKIREIGVEH NIQILESPAL ARAIYYSTEL EQEIPAGLYL AVAQVLAYVFLKIREIGVEH KVQILESPAL ARAIYYSTEI EQEIPAGLYL AVAQVLAYVF
QIRQYRAGKG KRPEPLKDDL PIPPDLRRDSQIRQYRSGKG KRPEPLKDDL PIPPDLRRDS
DOT-T1E