“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD
ALIMENTARIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAUNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE INGENIERÍA INDUSTRIAL
Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial
PRACTICA DE LABORATORIO Nº 02
TEMA : MEDICION DE CRECIMIENTO MICROBIANO
CURSO : BIOTECNOLOGIA
DOCENTE : JORGE BERMEJO BENITES
ALUMNOS : ANCAJIMA CHERO JOSE CRISANTO CARDOZA YANCARLO
ELERA ERAZO JORDIN LOPEZ RAMIREZ EDGAR QUILLILLI AZURIN ALEX
GUERRA GALDO LEO BALLONA SHEYLA
CICLO : I- 2013
PIURA PERU 2010
PRACTICA Nº 02“MEDICION DE CRECIMIENTO MICROBIANO”
I.- INTRODUCCION:
La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas
por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los
diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los
mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos,
y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente
documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes
mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la
utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis de las
ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
Podemos definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento
ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un
aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En
organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del
individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que
ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que
la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce
en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y escala poblacional.
Objetivo General:
Conocer los distintos métodos directos e indirectos utilizados para determinar el
crecimiento bacteriano.
Objetivo específico:
Determinar el número de levaduras viables en la preparación de inóculos para
bebidas alcohólicas y durante el proceso de fermentación.
II.- FUNDAMENTO TEORICO
II.1.- METODOS DIRECTOS
Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas
(técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de
contadores de partículas).
a) Cuantificación del número de células
Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este
número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede
usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las
características higiénicas generales del alimento.
Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubación (mesofilos, psicrófilos) los microorganismos analizados
serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de
anaerobios totales.
b) Contaje de células viables:
Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente
disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de
muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el llenado
de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies
del vidrio, incluyendo pipetas.
Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al
realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios
mínimos sin fuente de carbono).
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley, Petroff-Hausser y la de Neubauer.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque
la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.
Fig. Cámara de recuento de Petroff-Hausser
Fig. Cámara de recuento de Neubauer
Limitaciones:
•Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.
•No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas
al microscopio.
•No distinguen células vivas de muertas.
c) Contaje en placa
En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en
un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de
lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original
sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una
colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias
visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota
utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.
Precauciones:
o Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas
de cada dilución.
o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución
o Contar las placas donde existan entre 30 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y
esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células),
el recuento se refiere no a “células viables reales sino a unidades formadoras de colonias
(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre
todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el
número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más
individuos que estaban juntos al ser sembrados en placa.
II.2.- METODOS INDIRECTOS
Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos
permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos.
a) Determinación del peso húmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación
de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes
de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede
ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de
líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para
ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía
depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del
empaquetamiento, etc.
b) Determinación del peso seco
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una
suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de
bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra
seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.
El aumento de volumen con la humedad tiene un límite. Este va creciendo hasta que la
célula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de saturación de la
pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las especies en cálculos técnicos. A
partir de éste valor el volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el
volumen de las células no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el
valor del 30 % es un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su
punto de saturación de la pared celular.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es
difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1
mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
III.- MATERIALES:
- 1.5 litros de suero leche
- Cámara de Neubauer
- 1 bombilla acuática
- Microscopio
- Cocina eléctrica
- Pipeta volumétrica
- Azul de metileno
IV.- PROCEDIMIENTO:
IV.1.- Contaje de células viables
Homogenizar el suero de leche y luego Pasteurizarlo a 90°C por 2 minutos.
Enfriarlo hasta una temperatura de 40 °C con agua fría
Verter el suero de leche al biorreactor
En un vaso precipitado tomar 10-20ml de suero de leche del reactor en
funcionamiento.
Aspirar el suero de leche con la pipeta para glóbulos blancos hasta la marca
0.5 y limpiar cualquier exceso con algodón o papel filtro.
Llenar la pipeta con la solución de azul de metileno hasta la marca 11. La
dilución es de 1/20. Todos estos pasos de diluir y medir deben ser realizados
con el máximo de exactitud. Taponar con los dedos, los extremos de la
pipeta y mezclar el contenido muy cuidadosamente.
Descartar las primeras gotas del suero de leche antes de llenar la cámara que
debe estar perfectamente limpia y seca.
Poner en contacto una gota, en el borde del cubreobjetos que se ha colocado
sobre la cámara de manera que el líquido difunda por debajo, llenando la
cámara.
Colocar la cámara bajo el microscopio y localizar el campo con pequeño
aumento, pasando después a un mayor aumento (40X). Contar las células en
los 4 cuadrados de 1mm2 de las esquinas y luego sumarlos.
Repetir todo el procedimiento después de 24 horas de incubación y
determinar el incremento del número de bacterias.
Calcular el número promedio de bacterias.
Las dimensiones de la cámara y el grado de dilución, constituyen las bases del
cálculo. Como las bacterias se han contado en cuatro mm cuadrados, la altura de la
cámara es de 0.1 mm, el grado de dilución es 1/20; para el cálculo del número de
bacterias/mm3 se efectuará la siguiente operación:
(N/4)(20x10)
Donde
N: número de bacterias contadas en los 4 mm2.
Observaciones:
Las observaciones en el microscopio fueron las siguientes a 40X:
PRIMER CONTEO: (viernes 9:00 am)
3er Cuadrante 2do Cuadrante (2276/4) (20x10)=113800 bacterias/mm3
4to Cuadrante 1er Cuadrante
SEGUNDO CONTEO: (Lunes 10:00 am)
2083 2071 (8279/4) (20x10)= 413 950 bacterias/mm3
2065 2060
TERCER CONTEO (Martes 9:10 am)
2524 2465 (9991/4) (20x10) = 499550 bacterias/mm3
35 52 47 31
43 49 45 38
38 36 27 49
31 34 52 54
31 45 63 55
33 39 58 38
44 34 54 57
49 47 48 32
- - - -- - -- -
- - -
- -- -
-- -
- - - -- - - -- - - -- - - -
- - - -- - - -- - - -- - - -
2492 2510
V.- DISCUSION
Transcurrieron algo más de 73 horas para realizar el conteo de células luego de la primera anotación, notándose en la segunda toma de resultados que la población de bacterias se triplico.
VI.- CONCLUSIONES
Se pudo conocer que el cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, peso húmedo) Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación.
El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías.
VI.- RECOMENDACIONES
El recuento debe hacerse tan pronto como sea posible después de realizada la dilución y si esto no es posible, debe agitarse nuevamente antes del recuento ya que las bacterias tienden a decantar dentro de la pipeta.
La cámara de Neubauer debe estar completamente limpia, seca y sin ninguna alteración en la estructura que pueda afectar nuestros resultados.
VII.- BIBLIOGRAFÍA
http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm
http://www.uib.es/depart/dba/microcore/
VII.- ANEXOS
Pasteurizado de la muestra (suero de leche)
Reactor en funcionamiento, de donde se tomará la muestra
Toma de muestra para llevar a la cámara de Neubauer