Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
LIC. JULIO DE LARA ISASSI Coord. Sistemas Escolares P r e s e n t e .
Por medio de la presente se hace constar que el alumno, cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servic’io Social.
NOMBRE: VELAZQUEZ MANZANARES MIGUEL
MATRICULA: 86238224
LICENCIATURA: BiologIa Experimental
Estudio espectypopic?+de los lazo 111 con. C a , M g y Mn en condiciones ácidas para utiliza.rlo en el diagnóstico biofisicoquimico de -- cuerpos de agua alterados.
om le’os de antipiri- f+ p J PROYECTO:
Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan a los tres días del m e s de marzo de mil novecientos noventa y dos.
“CASA ABIERT AL TIEMPO” (--le e -
JRP/msb
UNIDAD IZTAPALAPA Av Miclioacán y La Purisiiiia. Col Vicentina, Irtapalapa. D F. C P 09340 Te1 686-03-7i
- /---
mi \ UNIDAD IZTAPALAPA 1
Casa abierta al tieiripo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA 11 de febrero de 1992
M. en C. Beatrlz A. Silva Torres Secretaria Académica División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Mtra. Silva Torres:
Por este conducto nos permitimos hacer de su conocimiento que, con fecha del 26 de enero de los corrientes, el alumno Miguel Velázquez Manzanares (86238224) ha concluido satisfactoriamente con las actividades correspondientes al Servicio Social requerido para obtener el título de Biólogo Experimental que otorga nuestra H. Casa de Estudios.
El alumno Velázquez Manzanares realizó del 26 de julio de 1991 al 26 de enero de 1992, de manera excepcional, sus labores de investigación del DiasnÓstico biofisicoauimico en el proyecto Modelo B i o f i s i c o q u í m i c o d e l Efecto d e l’a Acidez d e l M e d i o en Trucha (Salmo a a i r d n e r i ) . Su C o r r e l a c i ó n con l a Producc ión en e l Centro P i s c í c o l a “ E l Zarco” dentro de los laboratorios de Bioquimica y Biofisica, del Depto. de Ciencias de la Salud, de la U.A.M.I., y en las instalaciones del Centro piscícola “El Zarco”, D.F., bajo la asesoría de l o s profesores Raúl Alva (Garcia y Blanca Estela Rivera Bermeo, del Depto. de Ciencias de la Salud.
Los resultados obtenidos, así como las metas alcanzadas durante el trabajo desarrollado por el alumno Velázquez Manzanares se detallan en el Reporte de Investigación titulado ESTUDIO ESPECTROSCOPICO DE LOS COMPLEJOS DE ANTIPIRILAZO I11 CON Ca2+,, Mg2+ Y Mn2+ EN CONDICIONES ACIDAS, PARA UTILIZARLO EN EL DIAGNOSTICO BIOFISICOQUIMICO DE CUERPOS DE AGUA ALTERADOS, revisado y aprobado por los que suscriben, asesores del Proyecto.
Sin más por el momento, agradezco su atención a la presente y aprovecho para enviarle un cordial saludo,
A t e n t a m e n t e ,
M. en C. R García Profesor Ashciado D, TC
Bi Pr ociado D, TC
UNIDAD IZTA PA LAPA Av Michoacán y La Piirísiii ia. Col Vicentiiia. Ir tapalapa. O F C F’ 09340 Te1 686-01-21!
Casa abierta al tiempo
U NIVERSIDAD AUTO NO MA METROPOLITANA ALUMNO: Velázquez Manzanares Miguel.
MATRICULA: 86238224.
TELEFONO: 7-02-40-55.
CLAVE :
LUGAR DE TRABAJO: Laboratorios de Bioquimica y Biofísica ( S - 251 y 5-253) del Area de Investigación Básica del Depto. de Ciencias de la Salud de l<a Div. de C. B. S. y en las instalaciones del Centro piscícola "El Zarcott, D. F.
FECHA DE INICIO: 26 de Julio de 1991.
FECHA DE TERMINACION: 26 de enero de 1992.
UNIDAD: Iztapalapa
DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud
LICENCIATURA: Biología Experimental
NOMBRE DEL PROYECTO: vtMODELO BIOFISICOQUIMICO DEL EFECTO DE LA ACIDEZ DEL MEDIO EN TRUCHA (Salmo sairdneri). SU CORRELACION CON LA PRODUCCION EN EL CENTRO PISCICOLA "EL ZARCO".
ASESOR: M. EN C. Raúl Alva Garcia, Profr. Asociado D, TC y Biol. Blanca E. Rivera Bermeo, Profr. Asociado D, TC, Departamento de Ciencias de la Salud
HORAS SEMANA: 20.
TITULO: "ESTUDIO ESPECT OSCOPICO DE $ y S COMPLEJOS DE EN CONDICIONES ANTIPIRILAZO I11 CON Ca , Mg2+ Y Mn
ACIDAS, PARA UTILIZARLO EN EL DIAGNOSTICO BIOFISICOQUIMICO DE CUERPOS DE AGUA ALTERADOS".
9+
SESOR
UN1 DAD IZTA PA LA PA Av Michoacán y La Purisi i i ia. Col Vicei i t i i ia, Irtapalapa, U F C P 09340 Te¡ 686-03 2 2
PRESXNTACION.
¿Cómo saber algo acerca de las moléculas cuando estas
son muy pequeñas y que no pueden verse ni aún con los más
poderosos microscopios?. La respuesta a dicha interrogante
proviene de investigaciones espectroscópicas (Tinoco y col . ,
1 9 8 0 ) .
La luz y los fenómenos relacionados con ella han
desempeñado, entre otros caisos, un papel fundamental en la
evolución y el desarrollo) tecnológico de la humanidad.
Dificil seria imaginar un mundo envuelto en la eterna
obscuridad; lo que si es claro es que seria diferente del
mundo en que vivimos y muclno menos interesante. Con la luz
podemos distinguir en cada objeto un color determinado.
El color, es el gran ingrediente de la luz que
contribuye a la riqueza visual de la naturaleza (Cetto,
1 9 8 7 ) . Por as€ decirlo, el color verde de las hojas se debe
a la absorción de la clorofila, el anaranjado de la
remolacha o del tomate se debe a los carotenos y el rojo de
la sangre se debe a la hemoglobina. El color es
caracteristico del espectro electromagnético (en la región
visible) de luz transmitida por la sustancia cuando golpea
sobre ella luz blanca (luz solar), o cuando la luz es
reflejada desde ella. Sin embargo, el color de la luz no
siempre se puede definir a simple vista, por lo cual, se
utilizan herramientas que permitan hacer un análisis más
1
detallado del paso de luz a través de una sustancia; una de
esas herramientas es la espectroscopía (Cetto, 1987).
Tradicionalmente se entiende por espectroscopia la
interacción de la luz con la materia. La luz visible es una
parte muy pequeña del espectro electromagnético, por su
longitud de onda, frecuencia o por la energía (Tabla 1).
Tabla 1. Regiones del espectro electromagnético según
su longitud de onda.
LONGITUD DE ONDA NOMBRE DE LA RADIACION RANGO
Rayos gama
Rayos-X
ültravioleta Lejano
ültavioleta
Visible
infrarrojo cercano
infrarrojo
infrarrojo lejano
Micronda
Radar
Muy alta Frecuencia
Ultra alta Frecuencia
Radio onda
0.003-0.3 A 0.3-100 A 100-2000 A 200-400 nm
400-800 nm
0.8-2.5 pM
2.5-15 pM
15-200 pM
0.2-7.0 iíim
7-100 iíim
10-1000 cm
10-100 m
10-10,000 m
2
En la región del visible (VIS) y el ultravioleta ( W )
se mide la longitud de onda en nanómetros. En la región de
micro-ondas y radio-ondas, se usa comúnmente la frecuencia.
Una de las aplicaciones más generales de la espectroscopia
es la determinación de la. concentración de una especie
quimica en solución (Tinoco y col . , 1980) .
LA ESPECTROSCOPIA W-VIS.
La técnica desarrollada a lo largo de éste trabajo es
la espectroscopia ultravioleta-visible, por lo que a
continuación describiremos brevemente los fundamentos.
Cuando un átomo o molílcula absorbe energia, pasa a un
estado excitado. A cada estado excitado puede asignbrsele un
nivel de energía definido, y todos los estados posibles son
caracteristicos de cada átomo o molécula (Figura 1).
Figura 1. Diagrama de niveles de energía: E+, nivel
energético más bajo; E*, nivel energético más alto.
3
Las transiciones electrónicas en moléculas orgánicas
casi siempre implican transiciones de electrones n, O- y T .
LOS electrones se 1ocaiiza.n en los enlaces fl ; el ejemplo
típico es el enlace de Valencia simple entre dos átomos de
carbono de un hidrocarburo saturado; éstos se encuentran
fuertemente retenidos y la energía de las regiones W o VIS
no es suficiente para vencer dicha atracción.
Los electrones n son electrones no enlazantes que se
encuentran en átomos como nitrógeno, oxígeno, halógenos o
azufre; están retenidos con menor fuerza que los Q- y la
energía de las regiones W o VIS es suficiente para que sean
excitados. Los electrones n pueden sufrir dos tipos de
transiciones:
n 4% Y n Tic
en donde, los electrones n son inducidos a pasar a un estado
excitado (T”o la absorc:ión se origina por debajo de 200
nm, sin embargo, hay absorciones a longitudes mayores que
presentan algunos hidrocarburos saturados. Los éteres,
tioéteres, haluros de a1qui:Lo y aminas alquilicas disueltas,
tienen electrones n; por eso son transparentes en el UV.
Las dos caracteristicas más importante que presenta una
molécula orgánica cuando alssorbe en las regiones W o VIS
son la posición de la banda de absorción (longitud de onda
máxima) y su intensidad ( ¿: ) . La longitud de onda máxima,
4
además de su interés cualitativo, proporciona una medida de
la energía necesaria para l a . transición. Por otra parte,
depende en gran medida de la polaridad del estado excitado
y de la probabilidad de que ocurra la transición, es útil en
determinaciones cuantitativas.
Los grupos orgánicos que sufren las dos transiciones
anteriores se conocen como cromofóricos o cromóforos; son
los grupos responsables del color de una sustancia,
llamándose cromógeno a la :molécula que presenta uno o más
grupos cromóforos (Pietrzyk y Frank, 1983).
LOS INDICADORES METALOCROMICOS.
Los indicadores metalocrómicos, como el Antipirilazo
I11 (APIII), el Arsenazo III, y el Muréxido, son moléculas
orgánicas (Figura 2), con grupos cromóforos que cambian sus
propiedades espectrales en presencia de metales en solución;
las diferencias en el espectro de absorción electrónica,
entre el indicador libre y el complejo indicador-metal,
dependen de la concentración del ion metálico, por lo que
pueden ser usados para determinar cuantitativamente su
concentración en el medio (Scarpa, 1972; Scarpa y col.,
1978; Dorogi, 1984). Estos indicadores, no atraviesan las
membranas biológicas; son suficientemente sensibles a
concentraciones pequeñas de calcio que van del orden
milimolar al orden micromol-ar. La rapidez con que el calcio
se une a estos indicadores crea una respuesta más rápida
5
que la que producen los electrodos ion-selectivos. Así, la
adición del indicador a unai suspensión celular o fracción
celular produce una medicióln cuantitativa más precisa del
transporte neto de calcio bajo una amplia variedad de
condiciones experimentales ((Scarpa y col8 1 9 7 8 ) . Gracias a
esto, los indicadores metal.ocrÓmicos han sido usados para
medir la cinética de los flujos de calcio en diversos
sistemas biológicos como células de músculo esquelético
( O h n i s h i y EbaShi, 1 9 6 3 ) , , tejido cardiac0 ( F a b i a t o y
F a b i a t o , 1 9 7 9 ) , partículas subcelulares -reticulo
sarcoplásmico ( F a b i a t o y F a b i a t o , 1 9 7 9 ) , mitocondrias (Brown
y col . , 1975; Madeira, 1975; Mela y Chance8 1968; Toro,
1 9 8 0 ) ,etc.-
a)
H 5 6
3 H 3
3
b) Figura 2. Estructura .,;T química de O los indicadores
metalocrómicos a) APIII y b) Muréxido (Scarpa y col8 1 9 7 8 ) .
6
Por otro lado, a pesar de su uso extensivo en sistemas
biológicos, los indicadores; metalocrómicos han sido poco
empleados para la determinaición de calcio y algunos otros
iones divalentes en sistemas biológicos o artificiales bajo
condiciones experimentales dle pH ácido. Dado el objetivo del
presente proyecto surge la necesidad de estudiar el
comportamiento de el indicador APIII en medios a pH ácido en
presencia de cationes divalentes.
LA IMPORTANCIA DE LOS IONES.,
Los iones juegan un papel importante dentro de la
economía celular. Un ejemplo de esto es el calcio (Ca2+); se
encuentra formando parte de la maquinaria enzimática como
cofactor; es importante en las transmisiones sinápticas,
pues su entrada a la membrana presináptica permite la
liberación del neurotransmisor al espacio sináptico. Por su
parte, el magnesio (Mg2+) se encuentra integrado a la
molécula de clorofila; además funciona como cofactor
necesario en algunas reacciones enzimáticas (Preston, 1990).
Mientras tanto, el manga.neso (Mn2+) funciona como un
elemento esencial; su papel bioquimico es poco conocido; Sin
embargo, los excesos de manganeso causan una serie de
desórdenes neurológicos en mamíferos (Gavin y co l . , 1991).
El transporte de Mn2+ a través de las membranas biológicas,
es de interés especialmente en los campos de la toxicologia,
neurociencias, etc (Gavin y co l . , 1991).
7
En vista de lo anterior, en el presente trabajo
estudiamos el comportamiento del espectro de absorción
electrónica VIS del indicador APIII en presencia del ion
Ca2+ a p H 7, 4 y 3, con la finalidad de utilizarlo como una
herramienta para cuantificar concentraciones micromolares de
Ca2+ y algunos otros iones divalentes en forma libre.
8
OBJETIVO GENERAL.
Estudiar el comportamiento del espectro de absorción
electrónica en el visible de1 complejo APIII con Ca2+, Mn2+
y Mg2+ en medios de pH 7, 4 y 3, para utilizarlo en el
diagnóstico biofisicoquímico de cuerpos de agua alterados.
Objetivos particulares.
a) Estudiar los espectxos absolutos de los complejos
del APIII con los cationes divalentes Ca2+, Mn2+ y Mg2+, en
las condiciones de p H antes mencionadas, para caracterizar
las diferencias e interferencias entre ellos.
b) Estudiar los espectros diferenciales para cada uno
de los complejos de APIII con los cationes divalentes Ca2+,
Mn2+ y Mg2+, en las condiciones experimentales de pH arriba
citadas, para cuantificar dichos iones en muestras de
cuerpos de agua del Centro I?isclcola "El Zarcoll.
9
MATERIAL Y METODOS.
Se prepararon soluciones madre de APIII, sal de sodio,
(ICN) grado reactivo a una concentración de 100 pM y se
guardaron en frascos ámbar para evitar su descomposición por
efecto de la luz. Las sol~uciones madre de los cationes
divalentes se prepararon a una concentración de 0.1 M en
forma de cloruros; cloruro de calcio (CaC12) grado reactivo
(Merck), cloruro de manganeiso (MnC12 4 H20) y cloruro de
magnesio (MgCL2 6 H20) grado reactivo (Baker). El pH de
las soluciones se ajustó c:on ácido clorhídrico (HCL) y/o
trietanolamina (TEA) (Merc:k) grado reactivo. El pH se
registró con un electrodo de vidrio (A.H. Thomas 4094-510) y
un potenciómetro (Orión modelo 611) con agitación constante.
Todas estas soluciones se prepararon en agua desionizada
(Millipore Milli-Q) y se utjLlizaron frescas.
Se corrieron espectros absolutos del APIII y del
complejo APIII-Metal, colocando en una celda (Pyrex de 3 ml
con 1 cm de paso de luz) 50 pM de APIII y añadiendo el
catión correspondiente (100 pM de Ca2+, 50 pM de Mn2+ y 300
pM de Mg2+); todos l o s espectros se corrieron a cada pH. Los
espectros diferenciales se corrieron como APIII versus
APIII-Metal; cada celda contenía 50 pM de APIII y se
titularon con el cloruro del catión. Los experimentos se
realizaron en un espectrofotómetro de doble rayo W-VIS con
agitación (Aminco DW.2a) a una temperatura de 25 OC.
10
Las muestras de agua de la estanquería del centro
piscfcola "El Zarcomt se tomaron -a nivel de superficie- sin
burbujear en botellas de polietileno de alta densidad (HDPE)
de 250 ml (Nalgene); se filtraron (millipore 0.65 pm) para
eliminar sólidos que pudieran interferir con las lecturas
espectrofotométricas. Para la detectar la presencia de
cationes se tomaron 1.5 ml. de APIII 100 pM y 1.5 ml de
muestra, se colocaron en la. celda y se corrieron espectros
diferenciales. La concentración de Ca2+ en cada muestra se
determinó midiendo su absorbencia a 660 nm, en un
colorímetro CARL ZEISS PM6 (Tabla 2). Se midió el pH de cada
muestra in situ (Tabla 3) con un pHmetro portátil (CORNING).
RESULTADOS.
Los espectros absolutos obtenidos de APIII a pH 7.0,
tanto del complejo con Ca2+ como del indicador solo, se
presentan en la Figura 3a. El espectro absoluto del APIII,
muestra una absorbencia máxima a 550 nm, mientras que en el
espectro del complejo con :LOO pM de Ca2+ el coeficiente de
extinción a esa misma longitud disminuye (Scarpa y col,
1978). Se presentan los tres puntos isosbésticos conocidos.
Los espectros diferenciales a pH 7.0 (Figura 3b), con
distintas concentraciones de Ca2+ presentan tres puntos
isosbésticos a 430 nm, 494 nm y 613 nm. La banda en la que
podemos realizar una curva de calibración se encuentra a 660
nm, donde mejor se ajusta a la ley de Lambert y Beer.
11
El espectro absoluto del APIII a pH 4.0 presenta un
máximo a 550 nm, mientras que el del complejo con Ca2+ lo
presenta en 600 nm (Figura 4a); también se presentan tres
puntos de cruce. En los espectros diferenciales se presentan
tres puntos isosbésticos: 4:20 nm, 490 nm y 600 nm (Figura
4b). La absorción también es lineal a 660 nm, donde podemos
realizar la cuantif icación del ion Ca2+ (Velbzquez-
Manzanares y col., 1991a).
El espectro absoluto del APIII a p H 3.0 presenta un
máximo a 590 nm mientras el complejo con Ca2+ presenta una
disminución en el coeficiente de extinción a esa misma
longitud de onda (Figura 5a). Los espectros diferenciales
también presentan puntos isosbésticos: 420 nm, 496 nm y 622
nm (Figura 5b); se presenta una linearidad a 650 nm y 710 nm
con extinciones menores, esto comparado con los espectros a
pH 7.0 y 4.0; sin embargo, la técnica sigue siendo
resolutiva bajo estas cond.iciones (Velázquez-Manzanares y
col., 1991b). . Por otro lado, el espectro absoluto del complejo de
APIII-Mg2+ con una concentración de 300 pM del catión a p H
7.0 (Figura 6a), presenta un corrimiento a longitudes de
ondas más pequeñas, con una banda más fina respecto al
espectro del APIII sin el catión y un pico máximo de
absorbencia a 530 nm; este espectro presenta sólo dos puntos
de cruce. Los espectros diferenciales del APIII a varias
concentraciones de Mg2+ a p H 7.0 (Figura 6b) presentan tres
puntos isosbésticos en 458 nm, 550 nm y en 660 nm. Las
12
longitudes de onda en que se puede realizar la
cuantificación del ion Mg2+ son 491 nm, 517 nm y 598 nm, ya
que son éstas las que mejor se ajustan a la ley de Lambert y
Beer. (Scarpa y col, 1 9 7 8 ) .
Respecto al complejo de APIII con 60 pM de Mn2+ a pH
7.0 (Figura 7a), el espectro absoluto presenta un
corrimiento hacia el violeta1 con un pico máximo en 520 nm y
tres puntos de cruce, lo anterior comparado con el espectro
del APIII solo. En cuanto a los espectros diferenciales
(Figura 7b), éstos presentan tres puntos isosbésticos en las
longitudes de ondas siguientes: 460 nm, 538 nm y 651 nm, con
una linearidad en 491 nm y 600 nm, donde se puede realizar
la cuantificación del Mn2+.
En los medios a pH 4.0 y 3.0, el APIII con Mg2+ y Mn2+
no presenta bandas de absorción dentro del intervalo
estudiado y por lo tanto 1 1 0 se pueden cuantificar dichos
cationes en estas condiciones. Aparentemente, el indicador
comienza a mostrar bandas de absorbencia características a
pH 6.0 con dichos cationes (resultados no mostrados).
En la Figura 8 y tabla 2 y 3, se observa la utilidad de
la presente técnica en muestras tomadas de cuerpos de agua
del centro piscícola el Zarco. La Figura 8a presenta el
espectro diferencial del APIII con una muestra de agua a pH
4.0, mostrando los tres puntos isosbésticos que se dan en el
espectro diferencial del coimplejo APIII-Ca2+ al mismo pH. En
la Figura 8b se observa el (espectro diferencial de APIII con
una muestra de agua del centro piscícola el Zarco a pH 6.6;
13
presenta una banda negativa !más fina en 580 nm que indica la
presencia del ion Mg2+ o Mri"; las bandas positiva que se
presentan a 640 nm y a 720 nm son propias de la presencia
del ion calcio.
14
a) A
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
C 1
APl l l 6OuM. OH 7.OiHCL
. L L . L _ I _ L L U _ L I _ J _ _ L I _ L I I _ I _ I _ I _ _ L ~
O 440 480 520 560 600 640 680 720
Longitud d e onda (nm).
480 5 2 0 500 600 640 680 720 440 - 0.3 I l . d - _ L l _ _ L I I i I I _ _ l . - I - L l L - L L - . L
400 Longitud de onda (nm)
Figura 3 . Espectros del A P I I I a p H 7.0; Espectro absoluto
diferencial a distintas [Ca"] (b). (a), Espectro 2+ del APIII (50 pM) solo y del APIII-C
15
a) A
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
(3 1
APllll lOuM pH 4.01HCL
O 440 460 520 560 600 640 680 720
Longitud d e onda (nm).
400 440 480 520 560 000 640 680 720
Longitud d e onda (nrn).
Figura 4. Espectros del AE'III a pH 4.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) solo y del APIII-Ca2+ (a), Espectro
16 diferencial a distintas [Ca2+] (b) .
a) __-____- A
API I I 60uM. pH 3.0l i iCL
1.6
1.4 - APl l l
1.2 -
1 -
0.8 -
0.4 -
0.2 -
I - 1 - L l _ _ l - . l i I i i I L I I l - L L o - ' I I I
0.06
0.04
0.02
O
- 0.0 2
-0.04
-0.06'
APll l 6 0 uM p i i 3.0
_ L I _ - L - L L 1 1 - 1 - l L J _ i I L L _ L _ L l - I - U _ L L I - ' I ' ' I
b) A
17
a) A
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
a
APl l l 60uM. pH 7.OIHCL
API I I -MpZ*
400 440 480 520 560 600 040 680 720
Longitud de onda (nm).
0.4
0.2
O
-0.2
- 0.4
. __
A P l l l 6 0 uM. pH 7 . 0
- 0.6 400 440 480 520 500 600 640 680 720
Longitud de onda (nrn).
Figura 6. Espectros del APIII a pH 7.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) so lo y del APIII-M$+ (a), Espectro
diferencial a distintas [Mg 3 (b).
18
a) A
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
O
APl l l 60uM. p n 7.OIHCL
APII I -MnZ*
400 440 480 520 580 600 640 680 7 2 0 Longitud de onda (nrn).
I M"*+
400 440 480 520 560 8 0 0 640 6 8 0 720
Longitud de onda (nrn).
Figura 7. Espectros del APIII a pH 7.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) s o l o y del APIII-Mn2+ (a), Espectro
diferencial a distintas [Mn2+] (b).
19
a) A
ol : I r o. 1
0.05
-0.05
-0.1
-0.15
APl l l 6 0 uM pn 4.0
hluestra de agua
-
O,
-
~-
u I. -1 -I- u- L 1 l L - U I I I I
400
0.15
o. 1
0.05
O
-0.05
-0.1
-0.15
b) A
-0.2 400
480 560 640 700 Longitud de onda (nm).
A P l l i 60 uM p n 6 .6
480 560 640 Loingitud de onda (nm)
720
Figura 8. Espectros diferenciales del APIII (50 pM) con muestras de agua del centro piscícola "El Zarco"; Muestra de
agua a p H 4 (a), Muestra de a pH 6.6 (b).
20
Tabla 2, Concentraciones de calcio (Ca++) mg/l Centro piscícola "El Zarco".
Tabla 3 . Valores de pH del Centro piscícola "El Zarco"
21
D18SCUSION.
Como se puede observai- en la Figura 2, la mol4cula de
Antipirilazo I11 presenta una gran densidad electrónica,
compuesta por enlaces 3 (grupos cromóforos), fácilmente
excitables a longitudes de onda que caen dentro del espectro
visible (Budesinsky, 1 9 7 4 ) .
El cambio en el espectro absoluto hace evidente la
modificación de la molécula de APIII en presencia del catión
metálico. L o s complejos APIII-Ca2+ a pH 7.0 reflejan un
cambio en la estructura electrónica de la molécula de APIII,
dada por la interacción del catión con los grupos
cromóforos. Esta interacciem provoca la disminución en el
coeficiente de extinción molar comparado con el espectro del
APIII sin calcio. El cambio en el espectro es prueba de la
formación del complejo.
Por su parte, a pH 4-10 el complejo del indicador con
calcio aumenta su coeficiente de extinción molar en 600 nm;
esto se debe al efecto del pH y la presencia del calcio en
la molécula. Es claro que el espectro absoluto del APIII sin
el catión sigue teniendo un comportamiento parecido al
realizado a pH 7.0. Es probable que la concentración de
protones no sea suficiente para ionizar los grupos
responsables de la señal espectral.
Por otro lado, a pH 3.0 las bandas de absorción del
APIII se hacen más finas en 600 nm. Se observa una
diferencia muy pequeña entre la absorbencia del espectro
22
absoluto del APIII solo y la del complejo APIII-Ca2+. Sin
embargo, por espectroscopla. diferencial es posible detectar
concentraciones micromolares de calcio bajo estas
condiciones.
Respecto a los espectros de los complejos APIII-Mg2+ y
APIII-Mn2+ a pH 7.0, estos presentan corrimientos y aumentos
en el coeficiente de extinción molar a longitudes de onda
más cortas. Estos corrimientos pueden estar en función de
las energias de ionización de dichos cationes, ya que sus
valores son similares (Pietrzyk, 1983). Los espectros
diferenciales de Mn2+ y Mg'!' son muy parecidos en la señal
espectral; se presenta una interferencia entre estos
espectros. Esta interferenc:ia impide la determinación de
los iones Mn2+ y Mg2+ en l o s cuerpos de agua del centro
pisclcola "El Zarco". Sin embargo, es posible determinar
calcio en longitudes de onda de 660 nm ya que en dicha
longitud no se presenta interferencia del magnesio ni del
manganeso.
La presencia de los puntos isosbésticos en los
espectros diferenciales sugiere que el APIII sufre
Únicamente cambios en su estructura electrónica y no en su
estructura química.
23
CONC!LUSIONES .
El presente trabajo demuestra que el Antipirilazo I11
es un indicador metalocrómico que permite cuantificar
concentraciones de Ca2+ del orden micromolar, aun en
condiciones extremas de pH ácido. Por lo tanto, el APIII se
presenta como una Útil herramienta para determinaciones de
calcio de manera diferencial, tanto en sistemas
experimentales modelo, como en tejidos biológicos no
ensayados previamente (por ejemplo: epitelios gástricos,
arqueobacterias, etc.).
Sin embargo, en las presentes condiciones la técnica no
es útil para cuantificar los iones Mg2+ y Mn2+, dado que
presentan interferencias espectrales mutuas.
Además, el indicador metalocrómico APIII presenta
amplias perspectivas para emplearse en las determinaciones
de calcio en epitelios branquiales de peces, para contribuir
a explicar la toxicidad, que a nivel membranal presentan
algunos iones metálicos, sobre organismos acuáticos
sometidos a la alteración de! su hábitat por factores como la
disminución del pH y la lixiviación de metales al cuerpo de
agua debidas a la precipitación ácida (Tam y Williams,
1986).
24
ACTIVIDADES REALIZADAS.
Para la realización del presente trabajo, dentro del
proyecto Modelo Biofisicoqufmico del Efecto de la Acidez del
Medio en Trucha (Salmo sairdneri). Su Correlación con la
Producción en el Centro Piscícola “El Zarco”, los muestreos
se llevaron a cabo en estanques seleccionados dentro de la
granja (Figura 9). La toma de muestras se hizo una vez por
semana durante el primer ines de desarrollo del proyecto.
Posterior a este periodo, se efectuó un muestre0 mensual,
hasta el mes de diciembre.
Los resultados que se obtuvieron durante la realización
del presente trabajo se publicaron, en su versión corta, en
diversas publicaciones especializadas, las que se enuncian a
continuación:
Velázquez-Manzanares M., Alva, R., Rivera, B.E. Los
indicadores Muréxido y Antipirilazo I11 a pH ácido. En
Memorias del V Simposio de Estudiantes de Posgrado en
Química ffFernando Romo1t, U. A. M. , México. En prensa.
Velázquez-Manzanares, M., Alva, R. y Rivera, B.E. 1991.
Comportamiento espectral de1 complejo Antipirilazo III-
Ca(I1) a pH Acido. Rev. Soc. Qu5m. Méx. 35, 295
25
OBJETIV08 ALCANZADOS.
Cumpliendo con los objetivos planteados se logró
evidenciar l o s espectros absolutos del complejo APIII-
Catión, siendo característica la señal espectral para cada
uno de los complejos.
Por medio de espectroscopía diferencial se logró
ajustar una técnica capaz de determinar concentraciones
micromolares de calcio en f'orma libre aún en condiciones de
pH ácido.
Se demostró que la técnica es viable para su
utilización en la determinac:ión de calcio.
Además, se demostró que el APIII no forma complejos con
Mn2+ y Mg2+ en condiciones de pH 4 y 3 .
27
RECOMENDACIONES.
Dada la importancia del Mn2+ y Mg2+ en los seres vivos,
es recomendable estudiar m á s a profundidad los espectros del
complejo APIII-Mn2+ y APIII-Mg2+, para una evaluación m á s
precisa de estos iones en forma libre en cuerpos de agua.
Es importante profundizar aún más en estudios sobre la
formación de complejos de APIII con iones alcalinos y
algunos metales de transicih en condiciones extremas de pH,
para poder tener una comprensión más detallada del mecanismo
fino de la respuesta espectral.
Es recomendable continuar estudios sobre la cinética de
unión entre el APIII y los cationes (calcio, magnesio y
manganeso), estudiar las constantes de formación y
disociación. Además, es conveniente hacer estudios en
sistemas biológicos para verificar si este indicador
interfiere en el metabolismo celular y así poder utilizarlo
con seguridad en las mediciones de cationes en condiciones
extremas de pH (ácidas y alcalinas).
Se deben evidenciar las características espectrales de
otros indicadores como el Miiréxido y el Arsenazo I11 en las
determinaciones espectroscópicas de cationes divalentes u
otros y realizarlos en condiciones no ensayadas previamente.
28
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d e Posgrado en Química "Fernando Romo11, U.A.M. , México. En prensa..
AGRADECIMIENTOS.
Este trabajo fue apoyado parcialmente por CONACyT
P228CCOX891754, DGICSA C89-01-0216 y C90-01-0287.
32
295
%d d e 1385m. P e r f o r a d o e n 1973,des I carga desde e n t o n c e s una mezcla agua-- ';por d e a l t a e n t a l p i a , p resentando v a r i a 'dciones en e l i n d i c e N a / K (de 6 . 1 a 9 . 7 'únidades) y en l a e n t a l p i a (de 1410 a )060KJ/Kg), d u r a n t e s u d e s a r r o l l o y también a t r a v e s d e l t iempo, t e n i e n - do ac tua lmente 1 1 . 2 unidades N a / K y
,000 K J / K g de e n t a l p i a .
onectado a l a c e n t r a l desde 1973 con un f l u j o d e vapor separado de 45 tori /hr entrega a l a f e c h a 30 t o n / h r r e s u l t a n - do s e r un pozo d e l a r g a v i d a c o n u n buen lujo d e vapor .
El objetivo de est contr-bució' es mqstrar Lii ca acidad del indl @!or metalocrhiqo Anti lrilaz 11'1 APIII ara cu n I F 1 r concentraciones Ricrmof'are; f 8 O. A pesar d u uso extensi o
c i s emac b;ol&iic&. como cCfu?as de m3sciiro Ca(]if a pH 2 6
COMO REACTIVO PARA LA D E T E R M I N A C I O N ESPECTROFOTOMETRICA DE ITRIO Y TORIO.
Macías P. M. LÓpez J. J. A.*, Carrillo R. Ma. T. Instituto d e ~ n v e s t i g a c i o n e s Científicas. Universidad de Guanajuato, Lascurain de Retana # 5, C.P 3 6 0 0 0 . Guanajuato, Gto.
El Acido Carmínico forma complejos coloridos con Itrio a pH=5.7 (600nm) y con Torio a pH=3.7 (570nm) . Las condiciones Óptimas, curva de calibración y precisión del método han sido establecidas para Torio e Itrio. La estequiometria para el complejo de Torio es de 2:3, para Itrio se observa la f ormaci ón de diferentes complejos.
I I S . C L A S I F I C AC I ON DE DE RMATOF I TOS DEL GENERO TRICHOPHYTON POR Pli ér-. CROMATOGRAFTA DE GASES
__ OCTAVIO VA'LQUEZ A . , MARIA DE J E S U S GONZALEZ* Y MARIA DE LAS MERCEDES ROJAS* I N S T I T U T O NACIONAL DE I N V E S T I G A C I O N E S NUCLEARES APARTADO POSTAL 18-1027, C . P . 11801 MEXICO , D. F.
*FACULTAD DE QUIMICA, [J.A.E.M. TOLUCA, MEX . El material biológico fue identificado en base al análisis de los ácidos grasos como productos metabólicos. Las cepas de T. ru b u no producen los ácidos 2-hidroxidecanóico (2-OH Cloz0) y undecanóico (C,l,o), pero se o b t i e n e 18.40% más de ácido palmítico (C16:o) que en T. mentasrophvtes. El análisis cromatográfico permitió la
J 4 >UO.
! ~ T O ! C I L .
5'Bt9:Fhisk+ í9r1 'I&:
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t
II
114. QUIMICA DEL ACID0
'Iiér. ACID0 CARMINIC0 CARMINIC0 (11). EL
LOS INDICADORES MUREXIDO Y ANTXPIRILAZO 111 A p H ACXDO.
'e Y z-5Laetiiz8ma@es@r Raúl Alva y Blanca Estela
Rivera.
Departamento de Ciencias de la Salud, U.A.M. Iztapalapa,
c J). 5 5 - 5 3 5 , 0 9 3 4 0
Y- /
El propósito
de los
Antipirilazo
micromolares I \.
', ácido (4.0 y
Ex i s t en
cuantitativo
México 13,, D . F .
de la presente contribución es mostrar
indicadores metalocrómicos Muréxido
la
Y
I11 (APIII) para cuantificar concentraciones
de praseodimio (Pr3+) y de calcio (Ca2+) a pH
3.0) .- varios método:; descritos para el análisis
de iones metál.icos en sistemas biológicos y
artificiales. Los procedimientos más comunes son: el empleo
de electrodos ion-selectivos (Flora y col., 1980), la
espectroscopía de absorción atómica (Toro, 1980) y la
espectroscopía con indicadores flourescentes (Fabiato y
Fabiato, 1979) y metalocrómicos (Scarpa y col., 1978).
L o s indicadores metalocrómicos, como el Muréxido, el
Antipirilazo I11 y el Arsenazo 111, son moléculas orgánicas
(Fig. 1) con grupos cromóforos que cambian sus propiedades
espectrales en presencia de metales en solución. Las
diferencias en el espectro de absorción electr6nicaf entre
el indicador libre (Ind) y e:L complejo indicador-metal (Ind-
M), dependen de la concentración del ion metálico, por lo
q u e se pueden usar para determinar cuantitativamente la
concentración ionica en el medio (Scarpa, 1972; Scarpa y
1
col., 1978; Dorogi, 1984). Estos indicadores han sido
ampliamente usados para medir la cinética cle los flujos de
calcio en diversos sistemas biológicos (Mela y Chance, 1968;
Brown y col., 1975; Madeira, 1975; Toro, 1980).
Figura 1. Estructura química de los indicadores
metalocrómicos a) Muréxido y b) ApIII.
Por otro lado, a pesar de su u s o extensivo en sistemas
biológicos, como células de músculo esquelético (Ohnishi y
Ebashi, 1963), tejido cardiac0 (Fabiato y Fabiato, 1979),
p a r t í c u l a s subcelulares -rc:t iculo sarccplásmico (Fahiato y
Fabiato, 1 9 7 9 ) , mitocondr ias (Mela y Chance, 1968; Toro,
2
1980) , etc.-, los indicadores metalocrómicos han sido poco
empleados en sistemas biológicos o artificiales bajo
condiciones experimentales a pH ácido.
En vista de lo anterior, en el presente trabajo
estudiamos el comportamiento del espectro de absorción
electrónica, en el Visible (VIS), del indicador Muréxido en
presencia de Pr3+ a pH 7 'y 4, así como el espectro del
indicador APIII en presencia del ion Ca2+ a pH 7 y 3 .
Se prepararon soluciones de Muréxido 40 pM y de APIII
50 pM; se titularon con cloruro de praseodimio (PrC13) y
cloruro de calcio (CaC12) (Scarpa y col., 1 9 7 8 ) ,
respectivamente. El pi1 de las soluciones se ajustó con ácido
clorhídrico (HC1) y trietanolamina (TEA). Se corrieron l o s
espectros absolutos del Ind y de los complejos Ind-M a cada
pII en un espectrofotómetro UV-VIS Aminco DW 2a. Los
espectros diferenciales se corrieron como Ind vs Ind-M a
diferentes concentraciones de Pr3+ y de Ca2+.
En la figura 2a se observa el espectro absoluto d e l
Muréxido a pH 7.0; éste muestra una absorbencia máxima a 525
nm mientras el espectro del complejo con 100 pM de Pr3+
presenta un máximo a 4 8 5 nm. Los espectros diferenciales a
pH 7.0 (fig 2b) , a distj.ntas concentraciones de Pr3+,
presentan un punto isosbéctico a 510 nin. La b-?nda de
absorción que se ajusta a la ley de Lambert y Beer se
encuentra a 470 nm.
El espectro absoluto de Muréxido ri p!I :.O nuestra un
pico máximo a 525 nm mientras el complejo con Pr3+ lo
3
presenta a 485 nm (fig 2c). Los espectros diferenciales
muestran también un punto isosbéstico a 510 nm (fig.ad),
siguiendo un comportamiento lineal en 470 nm.
Por su parte, en la Figura 3a se observa que el
espectro absoluto de APIII a pH 7.0 muestra una absorbencia
máxima a 550 nm, mientras que en el espectro del complejo
con 100 pM de Ca2+ el coeficiente de extinción disminuye
(Scarpa y col., 1978). Los espectros diferenciales a pH 7
( F i g . 3 b ) , a clistintas concentraciones de Ca2+, presentan
puntos isosl *;ticos a 430, 500 y 610 nm. La banda de
absorción q u e se ajusta a la ley de Lambert y Beer se
encuentra a 647 nm.
El espectro absoluto del APIII a pH 3 . 0 presenta un
máximo a 530 niii mientras el complejo con Ca2+ presenta una
disminución en el coeficiente de extinción en esa misma
longitud de onda, (Fig. 3c). Los espectros diferenciales
también presentan puntos icosbésticos: 420, 496 y 622 nm
(F ig . 3d); se presenta una linearidad a 650 y 710 nm con
extinciones menores, comparados con los espectros a pH 7.0.
En conclusión, la presente contribución muestra que el
Murexido y el Antipirilazo I11 cpn indicadores
metalocrómicos que permiten cuantificar concentraciones de
Pr3+ y Ca2-+, del orden de 10 a 100 pM, aun en condiciones de
pH ác ido . Por lo tanto, el PIuréxido y e l APIII se presentan
como un par de herramientas útiles para la determinación de
estos cationes, tanto en sistemas experimentales modelo como
4
en tejidos biológicos no ensayados previamente, por ejemplo:
epitelios gástricos, arqueobacterias, etc.
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