Date post: | 18-Jul-2016 |
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Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial:
Selección/ optimización del agente biológico
Propagaciónde loscultivos
Fermentación: producción del compuesto de interés
EsterilizaciónPreparaciónde medios
Separación o recuperación
Purificación
Terminado
Tratamientode efluentes
3
Selección/ optimización del agente biológicoFactores a tener en cuenta:Capacidad productora tan alta como sea posibleCapacidad de utilizar materias primas de bajo
costo (de producción local)Estabilidad del agente biológico: para obtener
procesos reproduciblesQue no sea patógeno
Estos factores pueden incorporarse a un agente biológico mediante el uso de ingeniería genética
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Producción del compuesto de interés
Se lleva a cabo en bioreactores o fermentadores
Son recipientes que proveen las condiciones ambientales propicias (Temp., pH, aireación, etc. ) para que los agentes biológicos puedan crecer y producir las máximas cantidades del compuesto deseado.
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A- Inyección de aire
B- Difusor
C- Eje transmisor
D- Motor
E- Agitadores
F- Controladores
G- Salida gases
H- Entrada
I- Deflectores
J- Rompe-espuma
K- Camisa
L- Salida
Fermentador tipo tanque agitado
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7
8
1)Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo.
2)Fermentación: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza.
Se siembra un tanque de inóculos cuyo volumen depende de la escala industrial.
Vinóculos ~50-1000 L y Vfermentador industrial ~10-1000 m3
3. Separación y purificación:
operaciones mecánicas de ruptura de células.
separación de insolubles por filtración, centrifugación o sedimentación.
separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración.
purificación por extracción líquido-líquido, extracción en dos fases acuosas o cromatografía de afinidad.
aislamiento y acondicionamiento del producto.
4) Tratamiento de efluentes: no tiene relación directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volúmenes involucrados y para preservar el medio.
1. Preparación y propagación de inóculos
I. Preservación del inóculo
II. Multiplicación del inóculo
III. Cultivo de prefermentación
IV. Fermentación de producción
El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio
Preservación del inóculo
El objetivo de la preservación es mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Se verifica pureza y capacidad de formar producto.
Multiplicación del inóculo
El cultivo preservado se reactiva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas.
Cultivo de pre-fermentación
En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo:
Actinomicetos...............5 - 10 %
Otras Bacterias.............0,1 - 3,0 %
Hongos..........................5 - 10 %
Preparación y propagación de inóculosIV. Fermentación de producción
preservación reactivaciónMedio líquido
enriquecidoMedio
de experimentación
CINÉTICA DE PROCESOS BIOQUÍMICOS
PROCESOMATERIA PRIMA
PRODUCTO
Acondicionamiento Transformación Recuperación
Celulares
(microorganismos, células vegetales y animales)
Bioquímicas
(enzimas)
Libres Inmovilizadas Libres Inmovilizadas
Los bioprocesos tienen una función PRODUCTIVA que cumple un rol y tiene asociado el factor COSTO que debe ser el menor posible
CINÉTICA DE PROCESOS BIOQUÍMICOS
VELOCIDAD DE CAMBIO: CINÉTICA DE CAMBIO, que obedece al mecanismo propio del sistema.
Es propia del sistema y depende de muchos factores que se deben conocer para tener control del proceso.
El seguimiento del crecimiento del microorganismo o de la producción de sus metabolitos en términos cinéticos, se puede expresar mediante
La cinética permite modelar el fenómeno en términos de la velocidad e identificar los
parámetros y cómo son afectados
MODELOS MATEMÁTICOS
CINÉTICA DE PROCESOS BIOQUÍMICOS
Aspectos cinéticos
Balances de masa
Diseño
(dimensionamiento de equipos)
Rendimiento
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Depende de:
•Microorganismo
•Características genéticas
•Condiciones ambientales
Crecimiento: aumento ordenado de todos los componentes químicos de un sistema biológico
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
BACTERIAS: FISIÓN BINARIA LEVADURA: GEMACIÓN
HONGO (MOHO)
Crecimiento apical
Determinación de la concentración másica de células:
Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión)
Métodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como puede ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formación de un producto.
Manejo cuantitativo de los microorganismos
Peso seco Biomasa •Mediciones directas Turbidimetría Recuento en celda Número Recuento en placa (viables)
Consumo de nutriente
•Mediciones indirectas Acumulación de producto
Compuesto celular
Métodos para la cuantificación del crecimiento de poblaciones microbianas
Método Fundamento Observaciones
Recuento de celda Conteo directo de células Requiere células individuales y medio limpioRecuento de placa Conteo de número de
coloniasSupone células individuales. Viables
Nefelometría Dispersión de luz Requiere cultivo homogéneo y traslúcidoNMP Estadístico Requiere células individuales y medio limpioPeso seco Medición directa No admite componentes insolubles en el
medio, dispendiosoTurbidimetría Transmisión de luz Requiere células individuales y medio limpio
Volumen empacado
Centrifugación del cultivo No admite presencia de sólidos
Físicos y químicos Variado, indirecto Cambios de viscosidad, pH, análisis de un componente celular
Balance de masa Conservación de masa Requiere varios análisisInstrumentales Variado Requiere variados análisis. Utilizados solos o
en conjunto con balance de masa en desarrollo
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Cinética de crecimiento de un cultivo por lote “batch”Etapas:
1) latencia oinducción
2) crecimientoexponencial
3) dedesaceleración
4) estacionario
5) muerte odeclinaciónCelular
6) Crecimiento críptico
1
2
3 4 5 6
tiempo
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase Lag, de latencia o de inducción.Es la expresión de un período de adaptación para iniciar el crecimiento.
Su presencia y su extensión depende de: Estado fisiológico Fase de crecimiento Tamaño Tipo de microorganismos Inóculo Composición del medio en el que se inocula Condiciones fisicoquímicas del medio
Fase Lag aparente: con inóculos pequeños
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase Lag, de latencia o de inducción
Cinética
(dX/dt) = 0
X = Concentración de células
X = X0
t = Tiempo
X0 = Biomasa inicial
Incidencia Industrial
Costo del tiempo de fermentación
Tamaño del fermentador
Riesgo de contaminación
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase de crecimiento exponencial (aceleración)
Células en plena reproducción a una velocidad que es la máxima
(dX/dt) = µX MODELO DE CRECIMIENTO CELULARLa µ es constante durante la fase de crecimiento exponencial y corresponde con la pendiente en un gráfico semilogarítmico (figura)
µ= 1 dx = d ln x x dt dt
µ= velocidad Específica de crecimiento
X= concentración de biomasa
t: tiempo
Integrando:
ln x = µ t xo
X= Xo e (µt)
X= Xo e (µt)
Relación con el tiempo de duplicación:
To = 0 T=Td
X = Xo X= 2Xo
Ln ( 2Xo / Xo ) = µ . Td
Despejando Td:
O O O O O O O OOOO OOOO…
32 64 128 256 512 1024
ln 2XoXo
µ
ln2
µTd ==
To= 0
T=td
X= Xo
X= 2Xo
Td= 0.693µ
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO*El tiempo de duplicación es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente.
Td aproximados (h):
Bacterias: 0.3 – 2.5Levaduras: 1 - 4Hongos: 1.5 - 7Protozoos: 6 h.Microalgas: 18-35Cél. Mamíferas: 20-40
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase exponencial
El cultivo está en estado autocatalítico Es un período relativamente corto Se cumple que:
X = X0 * 2n
Cinética de crecimientoSe caracteriza por ser una fase de crecimiento constante
(dX/dt) = µX
X = Biomasa microbiana µ = Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-
1.t = Tiempo en hrs
Cinética de crecimiento
Crecimiento diáuxico
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase Estacionaria (de declinación o retardo)
Representa el fin del período exponencial. Se detiene el crecimiento
La concentración celular no cambia
Esta dado por: Agotamiento de un sustrato Acumulación de un inhibidor Otras causas ajenas al crecimiento
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase de crecimiento críptico
En algunos cultivos es posible apreciar una zona de crecimiento lento después de la fase de muerte. El contenido citoplasmático liberado por las células lisadas proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO*Constante específica de la velocidad de crecimiento microbiano.
La constante específica de la velocidad de crecimiento microbiano (µ) se utiliza para caracterizar el comportamiento de una población microbiana.
Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo.
Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energía tanto en calidad como en cantidad.
Velocidad específica de crecimiento, h-1
dX
dtµX=
Cinética de primer orden
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Crecimiento de tipo exponencial que se puede modelar
µmax
lnX
t
µ =1 dX
=X dt
dlnX
dt
Velocidades de crecimiento de algunos microorganismos bajo condiciones óptimas
Efecto de la fuente de carbono sobre el crecimiento
Diseño de medio de cultivo
Inóculo
Nutrientes: H20, C, N, sales inorgánicas, vitaminas, otros
O2
Productos gaseososDe salida:CO2, CH4, etc.
Otros productos: Biomasa, otros
Estequiometría del crecimiento celular y producción
Fuente C + Fuente de N + Fuente de O2 + sales minerales + nutrientes específicos
Masa celular + producto + CO2 + H2O
OBJETIVO: Desarrollo de una fermentación con mínimo costo por unidad de producto
Concepto de fermentaciónProceso de fermentación:
MICROORGANISMOSBacterias, levaduras , hongos
MEDIO DE CULTIVO
CONDICIONES AMBIENTALES
MICROORGANISMO
CO2
PRODUCTOIntra o extra celular
Crecimiento microbiano: Crecimiento microbiano: DescripciDescripcióón qun quíímicamica
ACaHbOc + BO2 + DNH3 MCaHbOc Nd+ PCO2 + QH2O C
donde: A, B, D, P y Q son moles.CaHbOc fuente carbono-energía.M son moles de una unidad celular, CaHbOc Nd
Aproximadamente el 92 % en promedio de biomasa corresponde a los elementos mayores
Datos de composiciDatos de composicióón n celularcelular
BacteriasC0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07
LevadurasC0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065
Requerimientos nutricionalesFUENTE DE ENERGÍA: -C: AUTOTROFO, HETEROTROFOS-FOTOTROFICO-QUIMIOTROFICO
FUENTE DE ELEMENTOS MAYORES: C, H, O, NFUENTE DE ELEMENTOS MENORES: P, K, S, Mg, Ca,
NaFUENTE DE ELEMENTOS TRAZA: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, Nutrientes esenciales: factores de crecimiento
Clasificación Fuente de carbono Fuente de energía
Autótrofos CO2 -------
Heterótrofos Compuestos orgánicos
--------
Quimiótrofos --------- Compuestos químicos
Quimiolitótrofos _______ Compuestos químicos inorgánicos
Quimiorganótrofos _______ Compuestos químicos orgánicos
Quimioautótrofos CO2 Compuestos químicos
Fotótrofos _______ Luz
Fotoautótrofos CO2 Luz
Fotoheterótrofos Compuestos orgánicos
Luz
Quimioheterótrofos Compuestos orgánicos
Compuestos químicos
Tipos de medio de cultivoMEDIOS COMPLEJOS: Para un determinado
elemento está presente más de una fuente. Composición variable. Ej.
Extracto de levadura, extracto de carne, melaza, subproductos o desechos.
MEDIOS DEFINIDOS: Una fuente definida para cada elemento. Compuestos puros, Composición conocida y reproducible, una fuente por cada elemento.
MEDIO MÍNIMO: fuente de C y E + sales inorgánicas
MEDIO MÍNIMO ENRIQUECIDO: con algún factor de crecimiento (esencial o inductor).
Tipos de medio de cultivoMEDIOS COMPLEJOS INDUSTRIALES
Componente OrigenMelaza Industria azucareraLicor de maceración de maíz
Subproducto del procesamiento de maíz
Licor de sulfito Desecho de la industria de pulpa y papelPermeado de suero
Subproducto del procesamiento del suero de leche
Vinazas Subproducto de la producción de etanol por fermentación
Harinas de soya y pescado
Industrialización de soya y pescado
Hidrolizado y extracto de levadura
Industria productora de levadura forrajera y de panificación
Criterios utilizados en la formulación del medio(I)CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de producto
Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del producto.
Económicamente rentable.Máxima producción.Adaptación constante al proceso de fermentación.
Criterios utilizados en la formulación del medio.(II)
Recuperación del producto.Eliminación de la represión catabólica.Materiales de fácil disposición en cantidad
suficiente.Bajos costes de transporte.Impedir que las impurezas dificulten la
recuperación de producto.
Diseño del medio de cultivo
¿Cuánta biomasa vamos a generar?Composición celularFuente de cada elementoRendimientos
A. RANGO DE CONCENTRACIÓN DE BIOMASA
Matraces 0,5 - 2 g/lFermentador de laboratorio 1-10 g/lFermentador industrial 10-50 g/lAlta densidad 120-250 g/l
Compuesto Bacteria (% base seca)
Levaduras (% base seca)
Hongos (% base seca)
Promedio Promedio Promedio Carbono 48 46-52 48 46-52 48 45-55 Nitrógeno 12.5 10-14 7.5 6-8.5 6 4-7 Proteínas 55 50-60 40 35-45 32 25-40 Carbohidratos 9 6-15 38 30-45 49 40-55 Lípidos 7 5-10 8 5-10 8 5-10 Acidos nucleicos 23 15-25 8 5-10 5 2-8 Cenizas 6 4-10 6 4-10 6 4-10
g/100 g en peso seco Elemento Bacteria Hongos Levaduras Fósforo 2-3 0.4-4.5 0.8-2.6 Azufre 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24 Potasio 1-4.5 0.2-2.5 1-4 Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5 Sodio 0.5-1 0.02-0.5 0.01-0.1 Calcio 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3 Fierro 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5 Cobre 0.01-0.02 --------- 0.002-0.01 Manganeso 0.001-0.01 --------- 0.0005-0.007 Molibdeno -------- --------- 0.0001-0.0002 Total Cenizas 7-12 2-8 5-10
SustratoSustratossS1S2
Sn
CélulasCélulas
X
ProductosProductos
P1
P2Pn
Producto:Producto:Compuesto químico diferente de material
celular que es liberado al medio.
Sustrato:Sustrato:Compuestos que son consumidos a partir del
medio como resultado de crecimiento celular o formación de producto.
Factores que limitan la formulaciFactores que limitan la formulacióón de n de medios de cultivo:medios de cultivo:
Algunos elementos del sustrato liberados como productos no asimilados a material celular.
Velocidades limitantes y estequiometría, deben considerarse los rendimientos.
Nutrientes específicos que pudieran ser limitantes, o productos específicos que pueden ser inhibitorios.
Factores ambientales.Factores de crecimiento.
c. Fuente de cada elementoMEDIOS INDUSTRIALES
-Fuentes de C y EAlmidón de maíz, glucosa de maíz, melaza, aceites vegetales,
suero
-Fuentes de NLicor de maceración de maíz, harina de soya, amonio (gas), Urea,
extracto de levadura.
-SuplementosSales minerales, vitaminas, aminoácidos
MEDIOS DEFINIDOS
Fuente de Nitrógeno: (NH4)2SO4Fuente de K y P: K2PO3SulfatosCloruros
En un medio definido podemos elegir el sustrato LIMITANTETodos los demás elementos (nutrientes) irán en exceso entre el
30 y el 50 %
Zabriskie, D. W., Armiger, W. B., Philips, D. H. & Albano, P. A. (1980) Traders' Guide to Fermentation Media Formulation.
D. Rendimiento biomasa D. Rendimiento biomasa sustrato (Ysustrato (YX/SX/S))
YX/S Xs
Biomasa producida (Xf – X0)
Sustrato consumido (S0 – Sf)=
Se puede calcular:
• Experimentalmente•Teóricamente
YX/S Xf-Xo
==
=So-SfSo X - Xo
YX/S
Estimación teórica del Yx/s
Y x/S
Ei
% Ei en la célula
% Ei en el nutriente
Ei
% Ei en el nutriente
% Ei en la célula= =
Y x/S =% Ei en el nutriente
% Ei en la célula* F
F= 0.6 crecimiento aeróbico
F= 0.1 crecimiento anaeróbico
Para otros elementos
F= 1
Para el caso de la fuente de C y E,Una parte del C es excretado como CO2
Elemento Ei Ei %Ei en célula
Nutriente % Ei en el nutriente
C 12 48 glucosa 40N 14 7.5 (NH4)2SO4 21.2P 31 1.7 kH2PO4 22.8K 39 2.5 K2HPO4 28.7
Mg 24 0.3 MgSO4.7H2O
9.7
S 32 0.13 (NH4)2SO4 24.2Fe 56 0.26 FeSO4.7H2
O20
Ca 40 0.20 CaCl2 36.2Na 23 0.06 NaCl 39.3Zn 65 0.02 ZnSO4.7H2
O22.8
Mn 55 0.004 MnCl2.6H2O
27.7
Mo 99 0.0002 MoO3 66.6Co 59 0.003 CoCl2.6H2O 24.8
otros <0.01
Nutriente Y X/S Concentración g/l
glucosa 0.5 18(NH4)2SO4 2.8 2.14 fuente limitante
kH2PO4 (P) 13.4 0.67
MgSO4.7H2O 32 0.28FeSO4.7H2O 77 0.12
CaCl2 181 0.05NaCl 655 0.014ZnSO4.7H2O 1140 0.008MnCl2.6H2O 6925 0.0013CoCl2.6H2O 8267 0.0011MoO3 333000 0.00003
Ejemplo medio para X= 6 g/l de biomasa
Ejemplo:
Calcular la concentración de glucosa que requiere para producir una biomasa final de 6 g/l, en aerobiosis
Peso Glucosa: 180 g% Ei en el nutriente: 40%Y x/S =
% Ei en el nutriente
% Ei en la célula* F
Y x/S = 40 * 0.6 0.5
48=
=So X - Xo
YX/S
=So 6 g/l - 0
0.5=* 1.5 18 g/l
Productividad volumétrica y Productividad específicaDesde el punto de vista de un proceso
industrial, el solo rendimiento no constituye elemento de juicio suficiente para evaluar el comportamiento de una fermentación.
Es necesario considerar el factor cinético
Productividad volumétrica =Masa de producto
Tiempo X Volumen
Productividad específica =Masa de producto
Tiempo X masa de células
Cinética de crecimiento de la S. cereviceae y del consumo de sustrato (glucosa) en medio definido
Responder:
1.En general, qué se genera durante la fermentación?2.Cuáles son los aspectos importantes para la selección del medio de fermentación?3.Qué es el sustrato limitante?4.Por qué el rendimiento de Carbono en biomasa es menor para la levadura en anaerobiosis que en aerobiosis (0.12 y 0.56 g/g, respectivamente)?5.Por qué la melaza puede resultar un medio adecuado para fermentación. En qué caso se ha utilizado a nivel industrial?6.En qué consiste la reacción de Maillard y cómo afecta el medio de cultivo para la fermentación?