Date post: | 24-Jan-2016 |
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Construcción de una biblioteca genómica
• Cada fragmento en un vector que entra en una célula bacteriana = libro
• Clonado de todos los fragmentos del genoma de un organismo = library genómica
• La colección de todos los clones es la library genómica
Una library genómica tiene:
• sec. representativas de todo el genoma
• N° manejable de clones
• fragm. clonados largos
• solapamiento de sec. entre los clones
• fácil de construir
• fácil de hacer el screening
• ser amplificables
Digestión parcial
Construcción de una biblioteca genómica
• Para asegurar que los fragmentos de DNA sean del tamaño adecuado para clonado– Digestión con enzima de restricción con sitio
de reconocimiento con 4bp– Hacer digestión parcial (no todos los sitios
clivados)– Ligar los fragmentos al vector
Preparación del inserto
Preparación de fragmentos
Digestión parcial con ER variable o tiempo variable
Library genómica
Números
Equivalente genómico= largo total genoma/tamaño promedio del inserto
Para el genoma humano, usando un tamaño promedio de inserto de 6 kb en un vector1 equivalente genoma = (3 x 109 bp) / (6 x 103 bp)= 5 x 105 vectores.Para el genoma humano usando un fago l de reemplazo con insertos de 20 kb1 genome equivalent = (3 x 109 / (2 x 104 bp) = 1.5 x 105 fagos.
Cálculo más preciso:
Una ER six-cutter (e.g. Eco RI) cortará en promedio cada 4.1 Kb. La completa digestion de DNA humano resultará en aproximadamente 1 x 106 fragmentos únicos.
Cuál es la probabilidad de encontrar un clon en una library?
N = ln(1 -P)/ln(1 - f)
P probabilidad deseada
f fracción proporcional del genoma en un solo recombinante
N número necesario de recombinantes
N = ln(1 - 0.99)/ln(1 - (4096/3x109)) N = 3.37 x 106 clones
Vectores empleados
– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb
Construcción de una biblioteca genómica
Vectores empleados
– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb
Construcción de una biblioteca genómica
Cosmid Cloning
Cosmid Cloning
Vectores empleados
– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb
Construcción de una biblioteca genómica
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YAC vectors for cloning large DNA inserts
CEN4ori
URA3
TEL TEL
TRP1
CEN4ori
SUP4
TRP1
URA3TEL TEL
pYAC3
BB
S
Cut with restrictionEnzymes S + B
Ligate to very largeFragments of genomicDNA
Large insert, 400 to as much as 1400 kb
11.4 kb
Yeast artificial chromosome = YAC
Not to scale.
Vectores empleados
– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb
Construcción de una biblioteca genómica
BAC son derivados del plásmido F de E. coli y contiene los siguientes elementos:
parA y parB para asegurar una segregación apropiada
oriS y repE involucrados en la replicación unidireccional
un marcador que otorga resistencia a ampicilina
el sitio cosN de P1 para el clivado sitio específico via P1-Ter
el sitio loxP de P1 para el clivado sitio específico via P1-Cre
inactivación del gen lacZ
• el clonado se realiza directamente en el plásmido circular (cortado con 1 ER) o en el vector cortado con 2ERs (2 brazos)
• la mezcla de DNA ligado se transfiere en E.coli via electroporación
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BAC vectors for large DNA inserts
Cut with restriction enzyme E, remove “stuffer”
Ligate to very large fragments of genomic DNA
SacBII
promoter
oriF
Cm(R)
pBACe3.6
EES
11.5 kb
SacB+: SacBII encodes levansucrase, which converts sucrose to levan, a compound toxic to the bacteria.
Large insert, 300kb
oriFCm(R)
promoter
SSacBII
SacB-: No toxic levan produced on sucrosemedia: positive selection for recombinants.
Not to scale.
Screening de una library
• Sondas (probes) para hibridización
un gen vecino un gen relacionado evolutivamenteotro miembro de la familia génica una mezcla de oligos degenerados
derivados de una secuencia conservada de aminoácidos
un exón conocido del gen
• PCR con pooles de clones