2a. Parte.

Cristalización de agua: Congelación

Liofilización

Diagramas de estado suplementadosDiagramas de estado suplementados

Cuando el agua se encuentra formando parte de una Cuando el agua se encuentra formando parte de una mezcla binaria con un soluto es importante mezcla binaria con un soluto es importante mezcla binaria con un soluto es importante mezcla binaria con un soluto es importante determinar cuáles son las fases presentes en función determinar cuáles son las fases presentes en función de la composición, temperatura o de la presión.de la composición, temperatura o de la presión.p , p pp , p p

Además de las condiciones de equilibrio que Además de las condiciones de equilibrio que proveen los diagramas de fase, los proveen los diagramas de fase, los diagramas de diagramas de estado suplementadosestado suplementados incorporan la curva de incorporan la curva de temperatura de transición vítrea Proveen temperatura de transición vítrea Proveen temperatura de transición vítrea. Proveen temperatura de transición vítrea. Proveen información acerca de condiciones de no equilibrio y información acerca de condiciones de no equilibrio y estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, q y, p ,q y, p ,incluyen la noción de tiempo completando así la incluyen la noción de tiempo completando así la información de los diagramas de fase. información de los diagramas de fase.

Estos diagramas son especialmente Estos diagramas son especialmente Estos diagramas son especialmente Estos diagramas son especialmente útiles para analizar la estabilidad en útiles para analizar la estabilidad en sistemas congelados, deshidratados o sistemas congelados, deshidratados o g ,g ,parcialmente deshidratados que no parcialmente deshidratados que no corresponden a estados de equilibrio corresponden a estados de equilibrio termodinámico.termodinámico.

Diagrama de estado suplementado para Diagrama de estado suplementado para un sistema binarioun sistema binarioun sistema binario.un sistema binario.

Líquido sobreenfriado

Solución

Hielo + solución

erat

ura,

°C

Hielo + líq. sobreenfriado Vidrio

Tem

pe

Concentración de soluto, %

•• Temperatura de transisición vítrea (TTemperatura de transisición vítrea (T )) Dichas curvas definen regionesDichas curvas definen regiones•• Temperatura de transisición vítrea (TTemperatura de transisición vítrea (Tgg) ) •• Fusión de hielo (TFusión de hielo (Tmm) ) •• Solubilidad (TSolubilidad (Tmm

ss))

Dichas curvas definen regiones Dichas curvas definen regiones de estabilidad variable. de estabilidad variable.

(adaptado de Fennema, 1996).(adaptado de Fennema, 1996).

RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre TTmm (equilibrio)(equilibrio) yy TTgg::

ElEl sistemasistema sese encuentra,encuentra, concon rarasraras excepciones,excepciones, enent dt d dd lilib ililib i LL TT d fid fi llunun estadoestado dede nono equlilibrioequlilibrio.. LaLa curvacurva TTmm definedefine laslas

condicionescondiciones dondedonde elel solventesolvente (agua)(agua) puedepuedecristalizarcristalizar SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lalacristalizarcristalizar.. SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lalaconcentraciónconcentración definidadefinida porpor elel puntopunto eutécticoeutéctico enen eleldiagramadiagrama dede fasesfases puedepuede formarseformarse unun sólidosólidodiagramadiagrama dede fases,fases, puedepuede formarseformarse unun sólidosólidoeutécticoeutéctico (soluto(soluto yy solvente)solvente) oo bienbien elel solventesolventecontinúacontinúa cristalizandocristalizando enen unauna soluciónsolucióncontinúacontinúa cristalizandocristalizando enen unauna soluciónsoluciónsobresaturadasobresaturada.. LaLa primeraprimera situaciónsituación ocurreocurre concon laslassalessales mientrasmientras queque lala segundasegunda ocurreocurre comúnmentecomúnmenteqq ggconcon azúcares,azúcares, polímerospolímeros yy compcomp.. polioxhidrílicospolioxhidrílicos..

RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre laslascurvascurvas TmTmss yy TT ::

ZonaZona metaestablemetaestable dondedonde puedepuede ocurrirocurrircristalizacióncristalización dede solutossolutos EnEn condicionescondiciones dede

curvascurvas TmTmss yy TTgg::

cristalizacióncristalización dede solutossolutos.. EnEn condicionescondiciones dedetemperaturatemperatura yy concentraciónconcentración cercanascercanas aa lala curvacurvadede solubilidad,solubilidad, lala velocidadvelocidad dede cristalizacióncristalización,,aumentaaumenta concon lala sobresaturaciónsobresaturación.. SinSin embargo,embargo,cuandocuando elel sistemasistema sese acercaacerca aa lala curvacurva dede TTgg,, yaya

t iót ió l iól ió llseasea porpor concentraciónconcentración oo congelación,congelación, lalaviscosidadviscosidad aumentaaumenta drásticamentedrásticamente yy lala velocidadvelocidaddede cristalizacióncristalización disminuyedisminuye debidodebido aa limitacioneslimitacionesdede cristalizacióncristalización disminuyedisminuye debidodebido aa limitacioneslimitacionesdifusionalesdifusionales.. AA TTgg,, laslas restriccionesrestricciones enen lalamovilidadmovilidad molecularmolecular deldel sistemasistema sonson talestales quequeqqimpidenimpiden lala cristalizacióncristalización enen escalasescalas dede tiempotiemporazonablesrazonables.. CabeCabe remarcarremarcar queque ésteéste eses unun estadoestadodi á idi á i ( t i id( t i id i éti t )i éti t )dinámicodinámico (restringido(restringido cinéticamente)cinéticamente) yy nono ununestadoestado dede equilibrioequilibrio..

RegiónRegión comprendidacomprendida debajodebajo dede lala curvacurva dede TTgg::

SiSi elel materialmaterial adquirióadquirió elel estadoestado vítreo,vítreo, enengeneral,general, laslas reaccionesreacciones oo procesosprocesos queque dependendependendede lala transferenciatransferencia dede masamasa oo dede lala difusióndifusiónestánestán restringidosrestringidos yy sonson muymuy lentoslentos..LaLa cristalización,cristalización, porpor ejej..,, nono ocurreocurre enen unaunaescalaescala dede tiempotiempo prácticapráctica..NN di iódi ió dd ilib iilib i ii t dt dNoNo eses unauna condicióncondición dede equilibrioequilibrio sinosino unun estadoestadometaestablemetaestable..

CongelaciónCongelación

Efecto de la Efecto de la Efecto de la Efecto de la velocidad de velocidad de enfriamientoenfriamiento

Control de la cristalización.

Variables extrínsecas

1. Velocidad de cristalización

2. Temperatura mínima alcanzada

Control de la cristalización:

Variables intrínsecas (Composición)

a) Presencia de agentes nucleantes:

Ejs. IAg; bacterias.j g;

b) Modificación del crecimiento de los cristales de hielo: hielo:

Péptidos anticongelantes (en realidad inhiben el crecimiento de los cristales): peces antárticoscrecimiento de los cristales): peces antárticos.

Presencia de biopolímeros: gomas

Presencia de sales

La fuerza impulsora para los procesos de cristalización es la diferencia en potencial químico entre la fase solución y el sólido cristalino.

Puede expresarse como la diferencia de concentración respecto a la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el sistema que cristaliza y su punto de fusión.

Crecimiento de cristales de hielo. La muestra (LMOX) fue congelada a -35°C y luego recalentada a 1.25°C/min

El crecimiento de cristales se produce cuando la temperatura El crecimiento de cristales se produce cuando la temperatura asciende por encima de -21°C

CongelaciónFormas de congelación y cantidad de

F ió d hi l L lí ti d d d

Formas de congelación y cantidad de hielo formado

Formación de hielo: La línea que se extiende desde el punto eutéctico (TE) a Tg’, representa condiciones de no equilibrio Si el sistema se almacena a:de no equilibrio. Si el sistema se almacena a:

T > TE ⇒ fusión del hielo

T < Tg’ ⇒ sistema altamente viscoso, movilidad molecular muy reducida, limitaciones difusionales

i id l i t li ió d que impiden la cristalización de agua.

Máxima formación de hielo ⇒ congelación lenta a temperaturas entre TE y Tg’.

Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.

(A)(A)Enfriamiento previo a Enfriamiento previo a --100100°°C a 30C a 30°°C/min. Se observa C/min. Se observa formación de hielo al calentar (5formación de hielo al calentar (5°°C/min) por encima de Tg.C/min) por encima de Tg.

(B)(B) Enfriamiento a Enfriamiento a --100100°°C mantenimiento 15 min a C mantenimiento 15 min a --4848°°C reC re--(B)(B) Enfriamiento a Enfriamiento a --100100 C, mantenimiento 15 min a C, mantenimiento 15 min a --4848 C, reC, re--enfriamiento a enfriamiento a --100100°°C, para máxima formación de hielo.C, para máxima formación de hielo.

En este caso las soluciones tenían una Tg de En este caso las soluciones tenían una Tg de --8080°°C y C y devitrificación a devitrificación a --3030°°C.C.

(A)(A)Templado 15 min a Templado 15 min a --3232°°C aumentó Tg y la cantidad de hielo.C aumentó Tg y la cantidad de hielo.

(B)(B) Templado a Templado a --3535°°C 15 min.C 15 min.

(C)(C)15 min a 15 min a --4242°°CC

(D)(D)15 min a 15 min a --4545°°CC

(E)(E)60 min a 60 min a --4949°°CC

(F)(F) 300 min a 300 min a --4949°°C.C.

Cambios inducidos en las biomoléculas por la congelaciónp g

Estrés Respuesta celular

Reducción de T Cambios de fase de lípidos de membrana

Aumento de la conc. de l t Encogimiento osmóticosoluto g

Aumento de fza iónica. Efectos directos en membranas, solubilización de proteínas de membrana

Deshidratación Desestabilización de bicapas lipídicasPrecipitación de sales y formación de eutécticos ?formación de eutécticosFormation de burbujas de gas Daño mecánico a membranas/citoesqueleto

Aumento de viscosidad Los procesos difusivos (ósmosis) se limitanCambios de pH Desnaturalización de proteínas etc.Las células se Las células se comprimen Daños en membranas

Efecto de distintos crioprotectores l t bilid d d LDH en la estabilidad de LDH en

congelado/descongelado

Comparación daño por g /d g (t d ) cong./descong (tramado) con

liofilizado (sólido). PFK con aditi os 0 5Maditivos 0,5M

Criopreservaciónp

Citrus inodorainodora

Especie silvestre

t liaustraliana.

Velocidades de congelación:

Lenta: ≤ 1 °C/min

Rápida ≥ 100°C/minRápida ≥ 100 C/min

La temperatura crítica que usualmente tiene efacto sobre la supervivencia de organismos i i t 40°Cvivientes es -40°C.

Los procedimientos desarrollados para la ió d i l ió preservación de organismos por congelación o

secado son aún altamente empíricos.

La presencia de cierto contenido de agua y el mantenimiento de un rango de temperaturas es un requerimiento para organismos es un requerimiento para organismos vivientes.

Cuando a dos tipos de células distintas se Cuando a dos tipos de células distintas se aplica la misma velocidad de congelación, se obtienen diferentes niveles de congelación gintracelular.

En células de levadura permanece una En células de levadura permanece una significativa cantidad de agua a velocidades > 10°C/min.

En glóbulos rojos, un aumento similar de agau remanente en las células se observa cuando la velocidad es > 1000°C/min.

Consecuencias de la congelación Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.

Consecuencias de la congelación de sistemas gbiológicos.

La supervivencia de células de Saccharomyces La supervivencia de células de Saccharomyces cerevisiae luego de congelar y descongelar es máxima para una velocidad de congelación de 1 a 10°C/min.

La existencia de este óptimo se debe a dos pfenómenos:

Efectos mecánicosEfectos mecánicos

Efectos de los solutos

Efectos mecánicos

Congelación extracelularg

C d ió d él l t •Cuando una suspensión de células se somete a enfriamiento lento, la cristalización de hielo comienza en el medio externo y su interior se comienza en el medio externo y su interior se mantiene en estado sobre-enfriado hasta ~ -10°C.

•En ese rango de T el agua sobre-enfriada tiene ió d l hi l l mayor presión de vapor que el hielo, y el agua

intracelular se expele, causando deshidratación progresiva de las células. progresiva de las células.

Efectos mecánicos

•El agua que sale de las células congela en el exterior al encontrarse con cristales ya formadosexterior al encontrarse con cristales ya formados.

•Si el enfriamiento es lento, el sistema se ilib l l ió d l él l equilibra con la expulsión de agua y las células se

encogen por pérdida de agua intracelular, cuya concentración de solutos aumentaconcentración de solutos aumenta.

•

Causa de daño por Causa de daño por congelación intracelular

aguahielo

hielo hielo

Sistemas congelados Sistemas congelados gg

Mecánicos

Daño por congelación intracelular

Cell

Mecánicos

Químicos

Cell

waterExtracell.

iceCambios de pH

Aumento de fuerza iónmica.

ice iceice iceSupercooled ice iceice icecytoplasm

Dependientes de la velocidad

Efectos mecánicos

Congelación intracelularg

•De un enfriamiento rápido, resulta cristalización intracelular, como resultado de la nucleación con ,hielo que proviene del exterior a través de ductos en las membranas.

•A su vez, si el enfriamiento es muy rápido, los cristales son pequeños y si es ultra-rápido ocurre vitrificación.

•Si se debe evitar el crecimiento de cristales, el ,descongelado debe ser muy rápido también.

Efectos mecánicos

•El enfriamiento muy rápido lleva a alta supervivencia, si está seguido de un p , gdescongelado rápido.

•Pero si el descongelado no puede ser lo Pero si el descongelado no puede ser lo suficientemente rápido, es mejor congelar más lentamente ya que la deshidratación de las células limita el desarrollo de cristales intracelulares.

•La velocidad de congelación que causa congelación intra y extracelular depende de la velocidad de mo imiento del agua de adentro hacia afuera movimiento del agua de adentro hacia afuera.

•La velocidad de liberación de agua depende de la l ió á / l d l él l l relación área/volumen de las células y a los

coeficientes de permeabilidad.

•Las condiciones de congelación que provocan cristalización intracelular causan disminución de viabilidad viabilidad.

Sistemas congeladosg

Tanto plantas como animales tienen mecanismos para evitar la cristalización de hielode hielo.

Los tres principales mecanismos son:Los tres principales mecanismos son:

•Formación de vidrios.

•Cristalización extracelular.

•Proteínas anticongelantes.

do, %

Congelacióno fo

rmad

Congelaciónlenta

de

hiel

oCongelación

rápida

Can

tidad

Congelación rápidaCongelación rápida (ej. con nitrógeno líquido): (ej. con nitrógeno líquido):

Tiempo

C

g pg p ( j g q )( j g q )Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se obtiene un sistema amorfo con un valor de Tobtiene un sistema amorfo con un valor de Tgg(menor que T(menor que Tgg’) que será dependiente de la cantidad ’) que será dependiente de la cantidad de agua asociada a la fase amorfade agua asociada a la fase amorfa..Congelación lenta:Congelación lenta: Favorece la formación de hielo Favorece la formación de hielo Congelación lenta:Congelación lenta: Favorece la formación de hielo, Favorece la formación de hielo, que será máxima a Tque será máxima a Tgg’ < T’ < T<< TTE, E,

CC ’ T’ T ’:’:

CrioconcentraciónCrioconcentración

CCgg’, T’, Tgg’:’:

Punto en el diagrama de estado definido por la Punto en el diagrama de estado definido por la Punto en el diagrama de estado definido por la Punto en el diagrama de estado definido por la intersección de las curvas de fusión y de Tintersección de las curvas de fusión y de Tgg. . Corresponde a una concentración de Corresponde a una concentración de soluto/temperatura a la cual la cristalización de soluto/temperatura a la cual la cristalización de agua está inhibida cinéticamente.agua está inhibida cinéticamente.

CCgg’ ’ es la concentración correspondiente a la matriz es la concentración correspondiente a la matriz máximamente concentrada por formación de máximamente concentrada por formación de máximamente concentrada por formación de máximamente concentrada por formación de hielo: a Chielo: a Cgg’ se alcanza la mínima cantidad de agua ’ se alcanza la mínima cantidad de agua asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar por crioconcentración. por crioconcentración.

TT ’ ’ es la temperatura de transición vítrea es la temperatura de transición vítrea TTgg’ ’ es la temperatura de transición vítrea es la temperatura de transición vítrea correspondiente a esa matriz. correspondiente a esa matriz.

Caraterísticas de TCaraterísticas de Tgg’ :’ :

•• El valor es independiente de la concentración El valor es independiente de la concentración inicial sólo depende de la composición o tipo de inicial sólo depende de la composición o tipo de inicial, sólo depende de la composición o tipo de inicial, sólo depende de la composición o tipo de soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su diagrama de estado característico que diferirá diagrama de estado característico que diferirá cuantitativamente pero no cualitativamente del cuantitativamente pero no cualitativamente del diagrama mostrado en la Figura anterior. diagrama mostrado en la Figura anterior.

•• Se determina generalmente por DSC a partir de Se determina generalmente por DSC a partir de soluciones que fueron almacenadas en soluciones que fueron almacenadas en soluciones que fueron almacenadas en soluciones que fueron almacenadas en condiciones de máxima formación de hielo. condiciones de máxima formación de hielo.

•• Conocer el valor de TConocer el valor de Tgg’ es importante para ’ es importante para evaluar la estabilidad de productos congelados (los evaluar la estabilidad de productos congelados (los

l Tl T ’ t bl l i t li ió d ’ t bl l i t li ió d cuales a Tcuales a Tgg’ son estables a la cristalización de ’ son estables a la cristalización de agua por largos períodos de tiempo). agua por largos períodos de tiempo).

Determinación de la matriz máximamente concentrada (Tg’/cg’)

• Gráfico ΔH de fusión vs. Cont. de agua.

Extrapolando hasta ΔH =0 se obtiene el cont. de agua de la matriz concentrada.

• A partir de los termogramas, disminuyendo el contenido de agua hasta que no aparezca

l blagua congelable.

• Luego de efectuar una serie de templados, determinando la Tg de la matriz concnetrada y calculando su contenido de agua por Gordon y TaylorGordon y Taylor.

En este caso las soluciones tenían una TEn este caso las soluciones tenían una T de de 8080°°C yC yEn este caso las soluciones tenían una TEn este caso las soluciones tenían una Tgg de de --8080°°C yC y

devitrificación a devitrificación a --3030°°C.C.

(A)(A)Templado 15 min a Templado 15 min a 3232°°C aumentó Tg y la cantidad de hieloC aumentó Tg y la cantidad de hielo(A)(A)Templado 15 min a Templado 15 min a --3232 C aumentó Tg y la cantidad de hielo.C aumentó Tg y la cantidad de hielo.

(B)(B) Templado a Templado a --3535°°C 15 min.C 15 min.

(C)(C)15 min a 15 min a --4242°°CC(C)(C)15 min a 15 min a 4242 CC

(D)(D)15 min a 15 min a --4545°°CC

(E)(E)60 min a 60 min a --4949°°CC(E)(E)60 min a 60 min a 4949 CC

(F)(F) 300 min a 300 min a --4949°°C.C.

Muchas sales forman soluciones sobresaturadas d t l f i i t t l t durante el enfriamiento y eventualmente vitrifican. Durante la descongelación muestran una transición vítrea y luego cristalización del una transición vítrea y luego cristalización del eutéctico.

Las soluciones binariasbinarias agua sal tienden a Las soluciones binariasbinarias agua-sal tienden a formar eutécticos pero las mezclas ternariasmezclas ternarias de dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua generalmente vitrifican.

La formación de eutécticos parciales puede La formación de eutécticos parciales puede estar entonces acompañada de importantes cambios de pH. p

Formación de vidrio y separación de fases eutéctica en soluciones de sal

Sal Sal TTgg’ T’ Tee

NaCl.2H2O <-60 -21.7

NaHCO3 -52 -4

Tris base -55 -4

Gli i 70 4Glicina -70 -4

β-Ala -65 -14

CaCl 95 52CaCl2 -95 -52

NaCit -41 --

KCit -62 --KCit -62 --

NaAc -64 --

KAc -76 --KAc 76

CompuestoCompuesto TTgg (C)(C)TriosasTriosas

GlicerolGlicerol --9393PentosasPentosas

RibosaRibosa --1010RibosaRibosa 1010XilosaXilosa --1010ArabinosaArabinosa --22

HexosasHexosas

Temperaturas de transición

HexosasHexosasFructosaFructosa 1313GlucosaGlucosa 3939

vítrea de compuestos secos.

ManitolManitol 3030SorbitolSorbitol --33

DisacáridosDisacáridosSacarosaSacarosa 7070TrehalosaTrehalosa 106106MaltosaMaltosa 8787

TrisacáridosTrisacáridosRafinosaRafinosa 109109MaltotriosaMaltotriosa 100100MaltotriosaMaltotriosa 100100

TetrasacáridosTetrasacáridosEstaquiosaEstaquiosa 132132

CompuestoCompuesto T’T’gg ((°°C)C)PentosasPentosas

RibosaRibosa --4848RibosaRibosa --4848XilosaXilosa --4747

HexosasHexosasFF 4242

Temperaturas de transición

FructosaFructosa --4242GlucosaGlucosa --4343ManitolManitol --4040

vítrea de carbohidratos máximamente

d DisacáridosDisacáridosSacarosaSacarosa --3232TrehalosaTrehalosa --3030

concentrados.

LactosaLactosa --2828TrisacáridosTrisacáridos

RafinosaRafinosa --2626a osaa osa 2626TetrasacáridosTetrasacáridos

EstaquiosaEstaquiosa --2424MaltohexaosaMaltohexaosa 1515MaltohexaosaMaltohexaosa --1515CiclodextrinaCiclodextrina --99

Influencia de la velocidad de congelación sobre la Influencia de la velocidad de congelación sobre la morfología de los cristales en la muestra congeladamorfología de los cristales en la muestra congeladag gg g

LentoLento RápidoRápido

hielohielo Sólidos en la matriz no Sólidos en la matriz no congeladacongeladacongeladacongelada

Posibles estrategias para evitar daños por hielo. p

1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados)

2. Aumento de la velocidad de nucleación extracelular INAsINAs

3. Inhibición del crecimiento de cristales AFPAFP

Ice nucleating Agents Ice nucleating Agents Ice nucleating Agents Ice nucleating Agents (INAs)(INAs)

Son lipoproteínas de cerca de 30 kD que reducen el grado de sobreenfriamiento.

Proveen estructuras parecidas al hielo que sirven de molde que sirven de molde.

Colorado potato beetle

I l ti b t i Ice nucleating bacteria from insects (Pseudomona syringae and Erwinia herbicola)

Termogramas de agua pura y agua con

and Erwinia herbicola)

agentes nucleantes (AgI o bacterias).

Agentes nucleantes de hielog

Muchos sistemas biológicos promueven nucleación heterogénea por medio de agentes nucleantes de hielo (INAs) nucleantes de hielo (INAs). Estos agentes nuclean hielo entre las células. Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C.

INAs adaptativos: son generalmente proteínas con PM hasta 30000. Los aminoácidos se encuentran ordenados de tal forma que forman un molde para el hielo Se forma una capa de un molde para el hielo. Se forma una capa de hielo en la superficie de los INAs. Sin embargo, esto no llevará al crecimiento de cristales si no alcanzan un tamaño mayor que r*

Proteinas anticongelantes Proteinas anticongelantes AFP

En condiciones de baja temperatura muchas plantas producen crioprotectores muchas plantas producen crioprotectores coligativos, como prolina o sacarosa.

E t bi t í En otras, ocurren cambios en proteínas y lípidos de membranas.

Unas pocas plantas son capaces de producir AFP que las protegen de los efectos negativos de la congelación efectos negativos de la congelación.

AFPAFP

Se identificaron en peces antárticos pero luego se encontraron en microorganismos, insectos, microorganismos, insectos, plantas y nematodos.

(2,600 - 33,000 Daltons)(2,600 33,000 Daltons)

Actúan evitando el crecimiento de los cristales de hielo (bajo de los cristales de hielo (bajo efecto sobre propiedades coligativas). Antarctic Notothenoid

Mecanismo

Las AFP inhiben el crecimiento de hielo por adsorción-inhibición. Se adsorben específicamente a los planos d i i t d hi l it d l de crecimiento de hielo evitando la propagación. Se comportan como “agentes inhibidores de hielo agentes inhibidores de hielo estructurales”

Hexagonal ice grown Hexagonal ice grown in aqueous solution

(flat disc)

Ice crystal grown in AFP solution

(bipyramidal)

ice-binding site

Type III antifreeze protein (AFP) linked through its N-terminus to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP) to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP).

Pertaya et al., 2007

AFPAFP--GFP on the surface of ice crystalsGFP on the surface of ice crystals

Pertaya et al., 2007 J Phys: Cond Matter

C t i ió d l f t

INA

Caracterización de los efectos

INAs Sobre-enfriamiento Tn

Tiempo de congelaciónTiempo de congelación

Costos de energía g

Tamaño de los cristales

Caracterización de los efectosCaracterización de los efectos

AFP AFPs Sobre-enfriamiento

temperatura de congelaciónp g

Inhiben crecimiento de los cristales, modifican la morfología del hielomodifican la morfología del hielo

Tamaño de los cristales,

Overall

INAS crystallizatione

Rat

e

TemperatureTg Tm

Overall AFPcrystallization

eR

ate

TemperatureTg Tm

Overall AFP

INAS crystallizatione

Rat

e

TemperatureTg Tm

Control cinético de la i li ió d l cristalización de solutos

y agua150

100

e

450

ratu

re 0

empe

r

2-50

-100

Te

-150

W0.25 0.5 0.75 10

Modificación de los di d t d diagramas de estado por cambios en la f l ióformulación

Análisis del comportamiento en

Existen varios métodos para determinar la

pcongelación.

Existen varios métodos para determinar la velocidad de congelación, la temperatura requerida al final de la misma, la temperatura requerida al final de la misma, la temperatura de sublimación de hielo y los cambios estructurales que ocurren si el producto solidificado se mantiene a cierta T a lo largo del tiempo:

••Resistencia eléctricaResistencia eléctrica

••DSCDSC

••Resonancia magnética nuclearResonancia magnética nuclear

••CriomicroscopioCriomicroscopio

AFGP decreases the leakage of liposome contents. Carboxyfluorescein (CF) leakage from dielaidoylphosphatidylcholine (DEPC) liposomes cooled dielaidoylphosphatidylcholine (DEPC) liposomes cooled through the phase-transition temperature was measured in the absence (control) or presence of AFGP purified from the plasma of Greenland cod Control liposomes lost >70% of plasma of Greenland cod. Control liposomes lost >70% of their contents, whereas those treated with 0.5 mg/mL AFGP retained their contents

3ª Parte.

LiofilizaciónLiofilización

¿Qué es la liofilización?¿Qué es la liofilización?

Es una forma de secar un producto a bajas temperaturas sin el deterioro bajas temperaturas sin el deterioro que produciría el calentamiento.

Por medio de la liofilización se pueden preservar muchos tipos de productos biológicos por p g pperíodos prolongados sin daño en la calidad o viabilidad.

primero se congelase congela la parte acuosa primero se congelase congela la parte acuosa del sistema que se desea liofilizar y, a esa baja temperatura que impide j p q pcambios químicos de deterioro, se la somete a un alto vacíoalto vacío, sublimando el

d d l d ólid l dd ólid l dagua desde el estado sólido al estado estado sólido al estado gaseosogaseoso, sin pasar por el estado líquido líquido.

Vitrificación Vitrificación por por liofilizaciónliofilización

Antecedentes

(oficiales para el mundo occidental)1900. Descubridor: Altman, desarrollo: Gersh. 1900. Descubridor: Altman, desarrollo: Gersh.

1930. Sólo una curiosidad de laboratorio.

1945. Liofilización de plasma humano EUA, Francia, R.U.

Sir Ernst Boris Chain premio Nobel preservación de penicilina

Charles Merieux estabilización de vacunas

Antecedentes globales

Los incas emplearon esta tecnología muchos siglos atrás para secar carne congelada empleando la energía radiante del sol y la baja presión de las alturas del altiplano andino.

Para q é liofili amos?

Hay dos aplicaciones generales del

¿Para qué liofilizamos?

Hay dos aplicaciones generales del secado por liofilización:

• preservación o estabilización de productos alimenticios de alto valor agregado, biológicos o farmacéuticos.

• producción de estructuras porosas definidas o superficies internas tales como esponjas de colágeno, catalizadores, etc.

Aplicaciones de la liofilización: Aplicaciones de la liofilización: sangre, plasma, suero, soluciones de hormonas, productos farmacúticos alimentos e ingredientes farmacúticos, alimentos e ingredientes.

Materiales especiales para transplantes, como arterias, piel hy huesos.

Células que deben permanecer vivas largos períodos. Esto incluye bacterias, virus y levaduras, pero no células de mamíferos.

La liofilización se emplea para la preservación de biomateriales debido al hecho de que en el producto obtenido está inhibido el crecimiento de microorganismos obtenido está inhibido el crecimiento de microorganismos y de reacciones químicas de deterioro.El proceso facilita la distribución y almacenamiento ya que no es necesario mantener la cadena de frío no es necesario mantener la cadena de frío. El producto obtenido es fácil de rehidratar.

Diferencias con otras formas de Diferencias con otras formas de Diferencias con otras formas de Diferencias con otras formas de secado:secado:

La movilidadmovilidad del agua y los solutos durante el procesopLa temperaturatemperatura:: en liofilización < en liofilización < --3030°°C, en C, en secado entre secado entre 50 50 y y 100100°°CC.

Esto determina: Esto determina: Esto determina: Esto determina:

•• Estabilidad química Estabilidad química durante el durante el •• Estabilidad química Estabilidad química durante el durante el procesoproceso

• Generación de una estructura estructura adecuadaadecuadaadecuadaadecuada.

• Características de rehidrataciónrehidratación• Características de rehidrataciónrehidrataciónadecuadas.

La liofilización es un proceso que La liofilización es un proceso que i l t ti l t tinvolucra tres etapas:involucra tres etapas:

• Congelación:Congelación: la mayor parte del agua se convierte en hieloconvierte en hielo.

• Sublimación:Sublimación: el hielo pasa a estado vapor.Sublimación:Sublimación: el hielo pasa a estado vapor.

• Desorción:Desorción: Casi toda el agua no congelable se g gconvierte en vapor y se remueve.

Li fili ió b t hLiofilización en batch

Liofilización contínua

Los estados de agregación del agua: Los estados de agregación del agua: g g gg g gDiagrama de fases. Diagrama de fases.

Los diagramas de fases muestran en forma simple las regiones de presión y temperatura en las que g p y p qpredomina cada fase como también las zonas donde coexisten en equilibrio dos o tres fases (punto triple).

El diagrama denota la presión ejercida por las moléculas de agua a una dada temperatura.

La energía intermolecular determina los cambios é i l i i d fenergéticos en las transiciones de fase.

Varios cambios en el estado del agua son Varios cambios en el estado del agua son importantes en la liofilización: Uno es la congelación del agua (líquido/sólido)g g ( q )Otro es sublimación (sólido/vapor).

L t f i d í id l La transferencia de energía requerida para los cambios es distinta:Para congelar 1g de agua se requiere extraer 80 Para congelar 1g de agua se requiere extraer 80 cal. Mientras que para sublimar hielo se requiere aportar 680 cal.p

Diagrama termodinámico del Diagrama termodinámico del ggaguaagua

Congelación

Secado poraire caliente

Secado al vacío

Punto Triple

Secado porcongelación

Presión de aire a Presión de aire a distintas altitudes

Si vemos el diagrama de fases del agua el punto triple está a 4 6 Torrel punto triple está a 4,6 Torr

Las aplicaciones comerciales emplean 100 T 0 1333 B l t 100 mTorr o 0,1333 mBar, claramente < que la P de aire en los Andes.

¿Cómo podían liofilizar los Incas?

Ojo: a 0°C el punto de 100% R.H. es 5,3 Torr (7,067 mBar), y la H.R. tiene que estar por ( , ), y q pdebajo de 86,4% a 0°C para que comience la sublimación.

Por esto, la condición de sublimación debe ser “una reducción en la presión parcial de agua de manera que sea sustancialmente menor que la presión de saturación a la dada temperatura”.

Esta condición usualmente se alcanza bajando la P, pero sólo es necesario disminuir la PV de

l l i iagua para alcanzar el requerimiento.

Para una velocidad adecuada de sublimación, la pv de H2O tiene que ser < 200 mTorr (0.2 Torr). D l bli ió á d Durante la sublimación en una cámara evacuada la pv total (100%) está dada por las moléculas de aguaagua.Entonces si la P en el manómetro es 200 mTorr, esa es la pv de agua. Es sólo alrededor de 22 p gveces menor que la pv de la atmósfera.

Como generalmente la congelación de agua ocurre a presión atmosférica, la temperatura d l bi d f d l t d lí id í l del cambio de fase del estado líquido sería el punto de congelación de agua (0°C) si se tratara de agua pura, pero la presencia de tratara de agua pura, pero la presencia de sólidos afecta la temperatura a la cual ocurrirá la congelación.

Además del diagrama P, T analizado para el agua pura, nos interesa el diagrama g p , gtemperatura-composición a presión atmosférica (diagrama T-X a 1013 hPa) .

Ciclo de liofilización:

Preparación del material.

•Congelación (todos los fluidos se solidifican: pueden ser cristalinos, amorfos o vítreos). Se genera un pueden ser cristalinos, amorfos o vítreos). Se genera un red compleja de hielo, que puede estar embebida en estructuras vítreas o permanecer asociada a estructuras intersticiales Ojo con estrés mecánico por expansión intersticiales. Ojo con estrés mecánico por expansión volumétrica. Se realiza en ciclos de enfriamiento/calent..

S bli ió d i i •Sublimación: secado primario. El material congelado se coloca al vacío. Debe haber un balance adecuado entre el calor que se le provee (transf. de calor) q p ( )y el agua que sublima (transf. de masa) para que no haya colapso. Desafío: entregar energía en el vacío.Importante ajustar la presión para manejar la posibilidad Importante ajustar la presión para manejar la posibilidad de sublimación.

Ciclo de liofilización:

•Desorción: secado secundario (comienza cuando se ha sublimado todo el hielo). Para cada producto se establece un rango de contenido de agua remanente agua remanente.

•Acondicionamiento final: para extarerlo de la Acondicionamiento final: para extarerlo de la cámara: cuidados con el aire que ingresa, humedad ambiente, luz, oxígeno, sellado.

•Reconstitución del producto: temperatura y solvente procedimientosolvente, procedimiento.

j l d li fili ió d Ejemplo de un programa para liofilización de inyectables.

Permite calcular la pv de agua sobre hielo.

ΔH depende de T en la Fig está para T= -40°C ΔH depende de T en la Fig. está para T 40 C (tabla).

Los parámetros del materialmaterial y del procesoprocesodeterminan que una liofilización sea exitosa.

Las propiedades termoquímicas y termomecánicas de los materiales solubles amorfos forman la base de un

ódiseño efectivo de formulación y las aproximaciones coordinadas para la

óformulación y el desarrollo de proceso permiten alcanzar óptimos resultados

í i d bcon un mínimo de prueba-error.

Equivalencias de unidades de presión

Para que ocurra sublimación en la interfase Para que ocurra sublimación en la interfase qqentre la capa congelada la energía requerida entre la capa congelada la energía requerida para la transformación sólidopara la transformación sólido--vapor debe ser vapor debe ser transportada a través de la muestra hasta la transportada a través de la muestra hasta la interfase. Esto requiere gradientes de interfase. Esto requiere gradientes de temperatura cuya magnitud dependerá de las temperatura cuya magnitud dependerá de las temperatura, cuya magnitud dependerá de las temperatura, cuya magnitud dependerá de las resistencias al transporte de calor presentes resistencias al transporte de calor presentes en el producto.en el producto.pp

La capa congelada tiene mucho menor La capa congelada tiene mucho menor resistencia al transporte de calor que la capa resistencia al transporte de calor que la capa resistencia al transporte de calor que la capa resistencia al transporte de calor que la capa seca y por lo tanto se requiere mucho menor seca y por lo tanto se requiere mucho menor gradiente de temperatura a través de la capa gradiente de temperatura a través de la capa congelada que a través de la capa seca. congelada que a través de la capa seca.

Análisis del comportamiento l ióen congelación.

Microbalanza

Segregación de hielo y concentrado Segregación de hielo y concentrado durante la liofilización de durante la liofilización de soluciones.soluciones.

Regiones de sólidos concentrados

Cristales de hieloCristales de hielo

Red de huecos interconectada

Queda una matriz porosa luego de la remoción de hielo por sublimación

La congelación causa la microseparación de La congelación causa la microseparación de l ió l d j l ió l d j una solución acuosa en una mezcla de agujas una solución acuosa en una mezcla de agujas

de hielo y sólidos cristalinos o solución amorfa de hielo y sólidos cristalinos o solución amorfa concentrada, en la que permanecen las concentrada, en la que permanecen las concentrada, en la que permanecen las concentrada, en la que permanecen las sustancias activas. sustancias activas.

M t i Aguja de hielo

Matriz concentrada

Sección ideal de un líquido congeladoSección ideal de un líquido congelado

Microestructura unidireccional.Microestructura unidireccional.

En la cámara de vacío se entrega el calor En la cámara de vacío se entrega el calor latente para que ocurra la sublimación:latente para que ocurra la sublimación:latente para que ocurra la sublimación:latente para que ocurra la sublimación:

Flujo radiante

Vapor sublimante

Capa seca

Zona

sublimante

Frente de Zona congeladahielo

Primero sublima el hielo cerca de la superficie, Primero sublima el hielo cerca de la superficie, dejando un frente uniforme de hielo a cierto nivel dejando un frente uniforme de hielo a cierto nivel dejando un frente uniforme de hielo a cierto nivel dejando un frente uniforme de hielo a cierto nivel dentro del material.dentro del material.

La región por debajo del frente de hielo es La región por debajo del frente de hielo es l l d El l d bli ió l l d El l d bli ió la zona congelada. El calor de sublimación la zona congelada. El calor de sublimación se entrega al frente de hielo por se entrega al frente de hielo por conducción a través de la capa seca.conducción a través de la capa seca.

El vapor El vapor sublimado deja el sublimado deja el frente de hielo a frente de hielo a frente de hielo a frente de hielo a través de los través de los capilares que capilares que d j l j d j l j

Capilar vacío

dejan las agujas dejan las agujas de hielo de hielo sublimado sublimado

hielo

previamente.previamente.Solución concentrada amorfa/cristales

La superficie externa del material debe mantenerse La superficie externa del material debe mantenerse por debajo de la temperatura del frente de hielo para por debajo de la temperatura del frente de hielo para que ocurra esta transferencia de calor.que ocurra esta transferencia de calor.

La velocidad de secado está limitada por la velocidad a la cual el vapor puede difundir del velocidad a la cual el vapor puede difundir del frente de hielo. Elevando la temperatura del frente de hielo aumenta la velocidad de transferencia de de hielo aumenta la velocidad de transferencia de masa, pero esto está limitado por una temperatura crítica del material, por encima de la cual los capilares se estrangulan:

T > TT > TT > TT > Tcc

hielo hielo

Capa seca

C

A través de canalesA través de canalesA través de la matrizA través de la matriz

hielo hieloCapa cong.

Representación de distintas formas de flujo Representación de distintas formas de flujo d l li fili iód l li fili ióde vapor en la liofilizaciónde vapor en la liofilización

Capa seca

Capa

A través de grietasA través de grietas Colapso en el frente de hieloColapso en el frente de hielo

hielohielop

cong.

A través de grietasA través de grietas Colapso en el frente de hieloColapso en el frente de hielo

Efecto del contenido inicial de sólidos

S l ió d Solución de proteína 10%

Solución de manitol 5%

Si el contenido de sólidos es bajo (<2%) el producto seco no es mecánicamente estable

La temperatura de colapsotemperatura de colapso de la muestra (TTcc) es el punto en el cual el ablandamiento progresa

d l l d l dcausando colapso estructural de la torta secada, un fenómeno que puede estudiarse por microscopía de liofilización (FDM) microscopía de liofilización (FDM).

Para un sistema que cristalizaque cristaliza el colapso ocurreqq pcuando se excede el menor punto eutéctico de fusión (TTeueu).

Para un sistema que no cristalizano cristaliza la Tc está determinada por la temperatura de transicióndeterminada por la temperatura de transiciónvítrea del sistema (Tg).

Cristalización Con sembrado de cristales Cristalización granular. No cristalina

Distinta estructura de un producto, de acuerdo con las condiciones de cirstalización.

Colapso durante el secado primario. Se empleó una solución 15% de LMOX (latamoxef) y una temperatura de estante de 40°C, con vacío de 10Pa en la cámara

Controlador termoeléctrico para Controlador termoeléctrico para liofilización microscópicaliofilización microscópica

ó éó éPermite la observación directa del eutéctico.Permite la observación directa del eutéctico.

Avance del frente de hielo en el secado primario

Transporte de calor

Desde la fuente de calor a la superficie se

Transporte de calor

Desde la fuente de calor a la superficie se realiza por radiación.

Desde la superficie hasta la interfase a través de la capa seca ocurre principalmente por de la capa seca ocurre principalmente por conducción.

A través de la capa congelada ocurre por conducción.

Desde la fuente de calor hasta la capa congelada depende del diseño, puede ser por g p p pconducción.

Pasar a Pa!

El flujo de vapor de agua es impedido por tres El flujo de vapor de agua es impedido por tres

barreras de resistencia:

• Resistencia de la capa seca del producto

• Resistencia de los viales semitapados

• Resistencia de la cámara.

La relación entre flujo de calor y diferencia de temperatura puede describirse por un coeficiente de transferencia de calor del vial que tiene contribuciones de tres vial que tiene contribuciones de tres mecanismos paralelos:

• Conducción directa del estante al vial a través de los puntos de contacto directo

• Conducción a través del vapor entre el fondo del vial y el estante yfondo del vial y el estante, y

• Flujo de calor radiante.j

A l i d d Acoplamiento de transportes de calor y masa

Como todo el vapor que se forma, d t i d l t t d l d b determinado por el transporte de calor, debe ser extraído, la presión de agua en la interfase se establecerá a un nivel relativo al interfase se establecerá a un nivel relativo al la presión del condensador .

De esta manera el transporte de masa De esta manera, el transporte de masa resultante desde la interfase balancea la velocidad de formación de vapor determinado ppor el transporte de calor.

Transporte de calor y de masa en Transporte de calor y de masa en óóla liofilizaciónla liofilización

Veloc. de transporte =

Área*fuerza impulsora/resistencias

ECUACIONESECUACIONES

Suposiciones:Suposiciones:

• Ts (Tº de la superficie sólido) permanece constante.

• Material se seca por un lado• Material se seca por un lado.

• T° calor interior sólidos conducción

• Vapor de agua difusión

• Todo el calor se va λ

C Capa seca

Capa congelada

Capa seca

1.- Transferencia de masa (vapor de agua) proveniente del frente de sublimación por proveniente del frente de sublimación, por difusión (removida por el condensador).

b es la permeabilidad de la capa seca con respecto al transporte de vapor (kg/m.s.Pa)

2.- Transferencia de calor por conducción.

En condiciones de estado estacionario

(si el secado procede por ambas caras es (e/2)

El tiempo del secado primario puede expresarse también en función de la diferencia de presión de pvapor de agua en la interfase hielo/capa seca y la presión de vapor de agua en la superficie de la capa seca

(pi - ps)b.

(si el secado procede por ambas caras es (e/2)

Por lo tanto el tiempo de secado depende de las siguientes variables:

Máxima temperatura permisible, TsMáxima temperatura permisible, Ts

Contenidos de agua inicial y final Xo, Xe

Entalpía de sublimación, λ

Espesor de la muestra, ep

Conductividad térmica de la capa seca, Kd

Para un dado producto distribuido en viales el ptiempo del secado primario puede minimizarse haciendo la diferencia de

l l hi l l á temperatura entre el estante y el hielo lo más grande posible.

El control de la temperatura de los estantes es lenta por que la capacidad calorífica del medio de transmisión es grande medio de transmisión es grande.

Es más fácil controlar la presión.

La temperatura del hielo está determinada por interacciones entre la temperatura de la por interacciones entre la temperatura de la superficie, la presión de la cámara y las propiedades de la capa seca, k.

La temperatura de la capa congelada debe mantenerse por debajo de una T crítica que p j qdepende de la naturaleza del producto.

Secado secundario

•Involucra la remoción del agua remanente en el producto que no se separó como hielo durante producto, que no se separó como hielo durante la congelación de y por lo tanto no sublimó.

•Es difícil transferir energía en una matriz porosa colocada al vacío, ya que se comporta

t i l i fl d f t como un material insuflado perfecto.

•Por lo tanto, el secado secundario lleva tanto Por lo tanto, el secado secundario lleva tanto tiempo como la etapa del secado primario, aunque durante esta etapa se separa mucho menos agua.

Al final del proceso de sublimación el agua puede p g pestar:

•Retenida en capilaresRetenida en capilares

•Adsorbida a grupos polares

Debido a su baja presión de vapor se elimina con dificultad.

Generalmente:

Se aumenta la temperatura hasta el límite Se aumenta la temperatura hasta el límite tolerable del producto seco

O se genera alto vacío alrededor del productoO se genera alto vacío alrededor del producto.

1.Disminución de la temperatura del condensador

Ej de -50°C (0,04 mbar) a -80°C (0,0005mbar)

Esta disminución de presión es relativamente pequeña cuando se la compara con la presión de pequeña cuando se la compara con la presión de saturación de agua en la muestra (0,023 mbar a 20°C). Mientras una disminución de presión en el 2 ) pcondensador parecería permitir una menor presión de vapor de agua, casi no tiene efecto.

2. Aumento de la temperaturra de la muestra

Ej de -20°C a 30°C

resulta en un aumento de la presión de saturación de 23 3 mbar a 42 3 mbar lo que significa casi el de 23,3 mbar a 42,3 mbar, lo que significa casi el doble de gradiente.

En este caso hay que tener en cuenta

consideraciones de estabilidad mecánica y química

de las muestrasde las muestras.

Debe encontrarse un compromiso ya que el material poroso es aislante, muy alto vacío provoca un gradiente de temperatura muy alto entre la superficie y el centro y una temperatura lo más uniforme posible asegura una desorción más pareja.

Aspectos que deben considerarse:Aspectos que deben considerarse:

1. Diagramas de estado suplementados.

2. Congelación.

3 El proceso3. El proceso.

4. Caracterización del producto: sorción d d it óde agua y de nitrógeno.

5. La estabilidad del producto.

El El agua y los sólidosagua y los sólidos del material del material determinan cómo se va a comportar la determinan cómo se va a comportar la determinan cómo se va a comportar la determinan cómo se va a comportar la muestra durante el proceso.muestra durante el proceso.

A través de A través de diagramas de estado diagramas de estado suplementadossuplementados se pueden seleccionar se pueden seleccionar pp ppcondiciones de proceso (incluyendo condiciones de proceso (incluyendo congelación) o establecer congelación) o establecer g )g )formulaciones óptimas.formulaciones óptimas.

La La estabilidadestabilidad del producto dependerá de del producto dependerá de La La estabilidadestabilidad del producto dependerá de del producto dependerá de todas las consideraciones previas.todas las consideraciones previas.

Efecto de excipientes

Hormona de crec. Humano (hGH); 1 mes a 40°C.Hormona de crec. Humano (hGH); 1 mes a 40 C.

hGH/Gly/Man 1:1:1; hGh/Dextrano 40 1:6

Buffer fosfato (Na) pH 7 4; 15% de hGH Buffer fosfato (Na) pH 7,4; 15% de hGH

Cont inicial de agua 1%

Reacción: oxidación de metionina y deamidación Reacción: oxidación de metionina y deamidación de aspargina

4ª Parte.

Estabilización por encapsulaciónProcesos para encapsular:

•• Secado por aspersión (“spray”). Secado por aspersión (“spray”). •• Extrusión.Extrusión.•• Inclusión molecular.Inclusión molecular.•• CoacervaciónCoacervación•• Coacervación.Coacervación.•• CoCo--cristalizacióncristalización•• MacrocápsulasMacrocápsulasMacrocápsulasMacrocápsulas

Secado por aspersión.

100

120

D

F

40

60

80Ts

0

20

40

(°C

) Tm

solution

Maximum

G

B

A

Vitrificación Vitrificación por secadopor secado

60

-40

-20

pera

ture

(

Tg'

Maximum ice crystallization rate ice + freeze-concentrated solution

C

B Epp

-100

-80

-60

Tem

p

ice+glass

glass

-140

-120

0 0.2 0.4 60 80 100

Tg cg'V ce

Solid mass fraction (%)

Secado por aspersión.Variables involucradas: Variables involucradas:

% de sólidos: en general lo óptimo está entre 35 y 50%.

Temperatura de ingreso: 160- 250°CTemperatura de egreso: 70-90°C. En general el ΔT

debe ser lo más bajo posibledebe ser lo más bajo posible.Tipo de atomizador (tobera o disco)Velocidad de secado.Velocidad de secado.Tamaño molecular del componente: a mayor tamaño

de partícula, mayor encapsulación.Concentración del flavor: a mayor concentración

inicial hay más pérdida durante el secado.Tamaño de partícula: a menor tamaño de partícula Tamaño de partícula: a menor tamaño de partícula

mayor retención.

Si el componente es insoluble en agua la carga Si el componente es insoluble en agua la carga máxima puede llegar a ser de 20%.

Los secadores por aspersión tienen diversas capacidades,

tamaños y diseños. Algunos se tamaños y diseños. Algunos se muestran en las siguientes

t itransparencias

Dispersión de la solución en gotas pequeñas

Ejemplo: 100mL de solución resultan en 8 x 10Ejemplo: 100mL de solución resultan en 8 x 108 8

gotas de 25 gotas de 25 μμL con 12 mL con 12 m2 2 de área superficialde área superficial

Diferentes secadores con cámaras cilíndrico-cónicas para aplicaciones que pueden ir desde nivel laboratorio a ind strialindustrial

Equipo de laboratorio

Variables involucradas

1. Tamaño de partícula de la emulsión inicial

2. Temperatura de entrada

3. Contenido de sólidos en la entrada

4. Temperatura de salida

Algunos ejemplos

Microestructura de los Microestructura de los materiales encapsulados

Mecanismos de liberaciónMecanismos de liberación

* Ruptura mecánica

* Liberación térmica

* Permeación

* Disolución

* Liberación retrasada o específica

* Liberación osmótica o por pH

* Lib ió f lí i* Liberación fotolítica

* Biodegradación

Otras alternativas: empleo de ciclodextrinas

β (7)

HIDROFÍLICO

HIDROFÓBICO

Encapsulación en sistemas bi capaEncapsulación en sistemas bi-capa

CoacervaciónCoacervación

Sistema de encapsulación con Sistema de encapsulación con liberación controladaliberación controladaliberación controlada.liberación controlada.

Nanoesferas (verde) Ingrediente activo (violeta)

Otros ingredientes (amarillo) Otros ingredientes (amarillo)

Al exponerse a agua, pH o T la microesfera libera su contenido y en un tiempo extendido las nanoesferas liberan el activo encapsulado por dif ió l l d d ió i áti li difusión molecular y degradación enzimática por lipasa. http://www.foodtech-international.com/papers/application-nano.htm

Estabilidad y liberación de enzimas Estabilidad y liberación de enzimas confinadas en cápsulas de polielectrolitos.

ó áPreparación de las cápsulas.

Algunos polielectrolitos para la generación

OH

OH

O

OHO

OH

OH

O

O

OH

OH OOH

O

OH

OH O

OHO

OH

O

R

R

O CO CH

O

OH

O

OH

CO2H

generación

OHOOH

OO OOH

OH

OH

OHO

MG G M GO

OHOH

OOH

O

OH

O

OH

CONH2

O

OH

O

OH

CO2CH3O

O

OH

O

OH

CO2H

-D-galacturónicoα

Alginato

CO2CH3

OOH

OH

O

-L-ramnosaβPectinaMecanismo gelación-

caja de huevo

HH H H H HHH

-O2C

O

O

OHOH O

O

Quitosano

O

OH

O

O OH

OH

OH O

OH

OCa2+

O

OH

OHO

NH2

OOHO

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

O

OHOH O

-O2C

O

NH2COCH3 NH2

OOH

n

H H H HH HH H

Actividad enzimática.Actividad enzimática. E.C. (%)

A 83 ± 1

A-T 92 ± 2

A-TB 83 ± 1

A Q 92 2A-TQ 92 ± 2

AP-T 73 ± 1

-Generación: importancia de un 2do biopolímero.

-Tipo de secado: influye sobre la morfología y estabilidad.

-Trehalosa: provee elevada resitencia enzimática en la d hid ió l é é ideshidratación y el estrés térmico.

composición-composición.-grado de hidratación.-pH generación.- Liberación controlada p g-método de secado.

Microcápsulas de polielectrolitosMicrocápsulas de polielectrolitos