INVESTIGACIN DE CROMATOGRAFA

Montes de Oca de la Luz Ftima Jaqueline

CROMATOGRAFA EN COLUMNAANTECEDENTESPara poder explicar la cromatografaen columna utilizaremos el concepto de elucin en columna.La Figura 1 muestra como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografa de elucin con una fase mvil. La elucinimplica el transporte de una especie a travs deuna columna por la adicin continuada de nueva fase mvil. El proceso empieza cuando una nica porcin de la muestra se introduce en la parte superior de la columna (tiempo t0) despus de lo cual los componente de la muestra se distribuyen entre las dos fases, La introduccin de fase mvil adicional, el eluyente, hace que la fase mvil que la fase mvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tienen lugaruna posterior reparto entre la fase mvil y las porciones frescas de la fase estacionaria a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribucin entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba lamuestra. Las sucesivas adiciones de la fase mvil hacen avanzar las molculas de soluto (analitos) por la columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y mvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de los solutos solopuede ocurrir en la fase mvil, la velocidadmedia a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fraccin de tiempo que reside en esta fase.Esta fraccin de tiempo es pequea para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (compuesto B) y es grande cuando es ms probable la retencin en la fase mvil (componente A). Las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas ozonas, que se localizan a lo largo de la columna (tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se realiza haciendo pasar suficiente cantidad de fase mvil a travs de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella, pudiendoas detectarse o reconocerse (tiempos t3 y t4).

FUNDAMENTO

Figura 1. (a) Diagrama que muestra la separacin de una mezcla de A y B por cromatografa de elucin en columna. (b)Seal de salida del detector enlas distintas fases de la elucinmostradas en (a).FUNDAMENTO.

Durante la elucin en la columna cromatogrficade los distintos analitos de la muestraocurre unproceso asociado y muy importante, la dilucin del analito, proceso que acompaa casi siempre a las separaciones. As el tamao de la banda original que contiene los analitoses notablemente ms pequeo que cualquiera de las zonas que llegan al detector, lo que significa que se produce una importante dilucin de los analitos (su concentracin disminuye) mientras estn siendo separados, (Figura 2). Es evidente que el movimiento deavance por la columna aumenta la distancia entre lasbandas. Sin embargo, al mismo tiempo tiene lugar un ensanchamiento de ambas zonas, lo que disminuye la eficacia de la columna como sistema de separacin. Existen condiciones en las que se puede lograr que el ensanchamiento debandas se d mslentamente quela separacin.

Figura 2. Perfiles de concentracin de lasbandas de los analitos A yB a dos tiempos distintos en sumigracin a lo largo de la columna de la Figura 1. Los tiempos t1 y t2 se indican en la Figura 1.

USOS.La cromatografa en columna es uno de los principales mtodos para la separacin de especies qumicas. Adems, se puede emplear para la identificacin tanto cualitativa como para la determinacin cuantitativa de las especies separadas.En cuanto al anlisis cualitativo, la cromatografa proporciona informacin acerca de las especies dela muestra en cuanto a su tiempo de retencin o su posicin en la fase estacionaria tras el periodo de elucin. A pesar de todo, la cromatografa no nos aporta mucha informacin de la identificacin positiva de las especies qumicas separadas, pero s que es un buen mtodo para evidenciar la ausencia de ciertos compuestos. La cromatografa en columna es tambin un buen mtodo que proporciona informacin cuantitativa acerca de las especies separadas, basndose en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones. Pudindose hacer as anlisiscuantitativos basadosen la altura delpico, en las reas de los picos, mediante el mtodo de calibrado y patrones, el mtodo del patrn interno, ypor ltimo el mtodo de la normalizacin de las reas.

CROMATOGRAFA DE GASES.ANTECEDENTESEntra las tcnicas cromatograficas utilizadas con fines analticos, la cromatografa de gases es probablemente la tcnica de ms amplia utilizacin; ninguna tcnica analtica puede ofrecer su capacidad de separacin o su sensibilidad a la hora de analizar compuestos voltiles. Por otra parte, el hecho de que con esta tcnica las mezclas sean separadas en fase gaseosa, establece los lmites de su utilizacin, que estarn marcados fundamentalmente por la estabilidad trmica de los compuestos a separar. Por lo general, la utilizacin de la cromatografa de gases est restringida a la separacin de compuestos con un peso molecular menor de 1000 a una temperatura mxima de trabajo de aproximadamente 400C; dentro de estos lmites, como ya se ha mencionado la nica limitacin existente ser la estabilidad trmica de la muestra.Para realizar una separacin mediante cromatografa de gases, se inyecta un pequea cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura; esta corriente de gas, atraviesa una columna cromatografica que separara los componentes de la mezcla por medio de un mecanismo de particin (cromatografa gas lquido), de adsorcin (cromatografa gas solido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de ambos. Los componentes separados, emergern de la columna a intervalos discretos y pasarn a travs de algn sistema de deteccin adecuado, o bien sern dirigidos hacia un dispositivo de recogida de muestras.FUNDAMENTOLos gases portadores utilizados en cromatografa no afectan, en principio, a la separacin ya que no tienen ninguna influencia sobre los procesos de sorcion-desorcion o de particin que se producen en la columna, por lo que no afectan a la selectividad de esta, de cualquier forma, los trminos de difusin en la fase mvil de la ecuacin de Van Deemter, si dependen de la naturaleza del gas portador, por lo que las curvas de AEPT (figura 2) sern ligeramente distintas para cada tipo de gas, lo que a su vez influir sobre la velocidad optima de la fase mvil y, en consecuencia sobre los tiempo de anlisis.Al margen del efecto que la naturaleza del gas portador puede ejercer sobre la altura de plato, la eleccin de uno u otro tipo de gas, estar determinada fundamentalmente por el sistema de deteccin utilizado. Como fuentes de gas portador se suelen utilizar cilindros de gas comprimido de elevada pureza, capaces de suministrar una presin de gas adecuada y constante; es de hace notar que, en muchos casos, es necesario eliminar las trazas de impurezas que pueda contener el gas (O2 Y H2O fundamentalmente) que pueden afectar al sistema cromatografico, por medio de filtros adecuados. El control de la velocidad del gas portador a travs de la columna, se alza por medio de vlvulas que suministran un caudal constante (columnas empaquetas) o que mantienen constante la presin en cabeza de columna (sistemas capilares).

El horno de un cromatografo de gases, tiene como misin el mantener la columna termostatizada a una temperatura fijada con gran precisin (dentro de unos lmites de 1C); por otro lado, es necesario que el control de termostatizacion del horno permita incrementar la temperatura de estas a una velocidad prefijada y constante (para trabajar con tcnicas de temperatura programada). Evidentemente, el primer requisito es fcil de cumplir, pero cuando se requiere trabajar con temperatura programada, el horno debe cumplir una serie de requisitos tales como tener escasa inercia trmica (particularmente si es necesario realizar rampas de temperatura muy rpidas) y poseer un sistema de control de temperatura muy sofisticado que incluya la posibilidad de programar las posibles variaciones de temperatura del horno as como los tiempos a los que han de realizarse.DIAGRAMA DEL EQUIPO.El Esquema de un cromatografo de gases se muestra en la figura 3.Los componentes fundamentales de un cromatografo de gases, son:1. fuente de gas2. sistema de inyeccin3. horno y columna cromatografica4. sistema de deteccin.5. Sistema de riesgo.

Figura 3. Esquema de un cromatgrafo de gases.

DETECTORESLos detectores ms ampliamente utilizados son el detector de conductividad trmica (TCD) y el detector de ionizacin de flama (FID). Detector de conductividad trmica (TCD thermal conductivity detector).Consiste de dos celdas metlicas idnticas, cada una conteniendo un filamento de alambre de tungsteno o de tungsteno con lmina de oro. El efluente fluye a travs de una celda y el gas portador (He o H2) fluye a travs de la otra. En un lado de la muestra el gas fluye por el filamento mientras que en el lado de referencia el gas puede pasar sobre el alambre del filamento y difundir a travs de l. Los filamentos son calentados por una corriente elctrica. La temperatura del elemento censor depende de la conductividad trmica del gas que fluye alrededor. Cambios en conductividad trmica, como cuando las molculas orgnicas desplazan un poco al gas portador, provocan un incremento en la temperatura del elemento el cual est siendo monitoreado como un cambio en la resistencia. Dos pares del TCD son utilizados en cromatgrafos de gases, un par localizado en la salida de la columna para detectar los componentes separados mientras van saliendo, el otro par localizados antes del inyector o en una columna de referencia separando las resistencias de los dos pares y estn acomodados en un circuito de puente. Para un mximo de sensibilidad, la temperatura del filamento es incrementada, la temperatura y la velocidad del flujo son disminuidas y se escoge un gas con mayor conductividad trmica (la mayora de los gases orgnicos tienen calores de conductividad bajos). Este es un mtodo no destructivo dependiente de concentracin, con selectividad universal, con un lmite de deteccin de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de deteccin es debido al cambio de resistencia del cable basado en la termoconductividad del gas cuando fluye a travs de la columna (Fig. 4).

Detector de ionizacin de flama (FID flame ionization detector). El FID consiste de una flama hidrgeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen de la columna pasan a travs de la flama, la cual rompe las molculas orgnicas y produce iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una seal elctrica. Es extremadamente sensible en un amplio rango dinmico. La nica desventaja es que destruye la muestra. La muestra debe ser un combustible, esta entra en la base del detector, se mezcla con el hidrgeno y entra a la flama. Hay compuestos con poca o sin respuesta al FID, compuesto como el NH3, CS2, Nox, CO, CO2, O2, H2O, N2, compuestos perhalogenados, etc. La respuesta est basada en el nmero de carbonos y otros elementos tales como halgenos y el oxgeno presentes que reducen la combustin.Este es un mtodo destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para compuestos orgnicos, con un lmite de deteccin de ~ 100pg/seg. Su modo de deteccin es debido a la produccin de iones en una flama resultando en una corriente que puede ser medida (Fig. 5).

CROMATOGRAMAEn muestras complejas y con compnentes que presentan volmenes de retencin muy diferentes, es muy conveniente recurrir a tcnicas de progrmaaion de temperatura (figura 6), es decir, incrementar la temperatura de la columna segn un programa de calentamiento previamente establecido de temperatura en funcin del tiempo.

Figura 6. Cromatograma de una mexcla con porgramacion de temperatura.

En estos casos resulta muy conveniente realizar una prueba previa con una velocidad de calentamiento relativamente elevada y cubriendo un rango de temperaturas muy amplio, con el fin de estimar la temperatura a la que eluye cada componente y la resolucin que presentan los picos; a la vista de los resultados obtenidos, se podr fijaar mayor precisin el intervalo de temperatura a utilizar, asi como la velocidad de calentamiento, teniendo en cuenta que la mayor separacin entre los componentes se obtiene siempre con velocidades de calentamiento muy pequeas.USOS1. En comida, saborizantes y fragancias. En la mayora de las investigaciones hechas sobre saborizantes se realizan por cromatografa de gases, y las correlaciones sensoriales que se requieren para que haya significancia en la determinacin de sabores deben ser medidas por patrones de cromatografa de gases.2. Relacionados a qumicos y petrleo. Los anlisis de productos del petrleo incluyen la separacin de mezclas de gases ligeros hasta la caracterizacin de aceites crudos y materiales producidos en la licuacin del carbn. La diferenciacin de hidrocarburos parafnicos, olefnicos y aromticos son metas normales, y algunas veces se requiere la deteccin de componentes nitrogenados y sulfurados. Las preparaciones de hidrocarburos derivados de aceites o carbn licuado pueden ser extremadamente complejas y tambin pueden incluir una variedad de otros grupos funcionales. La cromatografa multidimensional puede ser requerida para el anlisis de estas mezclas complejas, la cual da una gran estimacin de ciertos aditivos de octanos.3. Ambientales. Los anlisis ambientales se enfocan a la deteccin y/o cuantificacin de muchas substancias diferentes en una diversidad de matrices. Estos anlisis pueden ir desde qumicos de pesticidas y herbicidas hasta hidrocarburos aromticos polinucleares (PAHs), compuestos clorados mezclados en el aire, agua y tierra. En muchos casos el problema inicial es la obtencin y preparacin de la muestra. Las muestras de agua son muy variables, desde agua potable hasta aguas industriales.4. En la industria. La cromatografa de gases es muy til cuando pretendemos identificar los compuestos que determinan una caracterstica aromtica conocida. Por lo tanto, es necesario conocer los umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirta nuestro producto, ya sea mediante estudio bibliogrfico o por deteccin olfatomtrica. Esta informacin es un instrumento til para el seguimiento del producto en el proceso productivo, as como el control de otros materiales enolgicos, como son los tapones y las barricas.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICOANTECEDENTES.La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. FUNDAMENTO.El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unin. R + A - es un intercambiador aninico en la forma A - y B - representa a los aniones en la disolucin.DIAGRAMA DE EQUIPOEsta tcnica est basada en 4 etapas: 1- Equilibrio. El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catinico sulfonado asociado a Na+ producto de la disociacin de NaOH. 2- Aplicacin y Lavado: El paso siguiente es sembrar la muestra a la cual queremos filtrar a travs de la columna mediante un lavado especfico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza inica que el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador. Por ejemplo: A la forma sdica de la resina lavada se le aade una solucin cida (pH=3) de la mezcla de aminocidos; a dicho pH los aminocidos se encuentran en forma de cationes con carga neta positiva. Los aminocidos catinicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las partculas de resina. A pH 3 los aminocidos ms bsicos se unirn a la resina de forma ms estrecha que los ms cidos. 3- Elusin: Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la composicin del buffer. La elusin puede realizarse de dos formas diferentes; la ms usual consiste en aumentar progresivamente la concentracin de un contra in, de modo de desplazar el equilibrio de unin de la macromolcula hacia la forma libre. El contrain es normalmente una sal, disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc). Las macromolculas de una mezcla se irn desplazando de manera secuencial, de acuerdo a la fuerza de unin: las que posean menos densidad de carga eluiran antes, mientras que para las de mayor carga neta el tiempo de retencin ser mayor. La otra manera es realizar un cambio en el pH del solvente; esta tcnica se emplea con intercambiadores dbiles. La lgica es que al cambiar el pH, de modo de acercarnos al PI de cada protena, la carga neta de esta ir disminuyendo y en algn punto dejara de interaccionar con la matriz. Sin embargo, esta tcnica posee sus desventajas. Dado que es este caso las protenas se eluiran a un pH igual a su PI su solubilidad estar disminuida y pueden precipitar. Adems, La disminucin del pH protonar a los grupos negativos de los aminocidos, por lo que su carga neta tender a ser positiva, por lo cual se necesitaran intercambiadores cationicos ( portadores de grupos con cagas negativas) que van a unir estos cationes de forma reversible; en contraposicin el aumento del pH provocara una desprotonacin de los grupos positivos de los aminocidos, por lo cual su carga neta tendera a ser negativa; necesitndose asi intercambiadores anionicos que unan reversiblemente cargas negativas. Las diversas fracciones pueden analizarse cuantitativamente mediante la reaccin con ninhidrina. Los aminocidos aninicos aparecen primero y los ms catinicos aparecen posteriormente (con un intercambiador catinico). 4- Regeneracin: Por ltimo, se remueven las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Los iones que se adhieren a los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo y pueden ser removidos total o parcialmente durante el proceso de regeneracin. Una vez agotadas las resinas, se pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la operacin de intercambio. As, el intercambio inico es un proceso cclico y no continuo. La regeneracin de las resinas se hace segn reacciones inversas.Figura 7. Diagrama de Equipo para la cromatografa por intercambio inico. Fracciones recogidas sucesivamente

DETECTORESExiste una amplia gama de detectores (conductimtrico, amperomtrico, UV, etc) donde se registra la seal obtenida respecto al tiempo. El resultado es un cromatograma donde la posicin de los mximos indica el in presente (anlisis cualitativo) y el rea corresponde a su concentracin en la disolucin (anlisis cuantitativo).Este tipo de cromatografa se subdivide en cromatografa de intercambio catinico y cromatografa de intercambio aninico, siendo esta ltima la que presenta mayores aplicaciones.CROMATOGRAMA El cromatograma es el resultado grafico de la cromatografia. En el caso de separacin optima, los diferentes picos manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada. La posiscion de los mximos nos indica el ion presente (carcter cualitativo) y su rea nos indica la cantidad existente de dicho ion cuantittivo.

Figura 8. Cromatograma para cromatografa de intercambio ionico.USOS1. Deionizacin del agua: las impurezas inicas del agua se pueden remover pasando el lquido a travs de una resina aninica en su forma OH- y una resina catinica en su forma H+.

2. Interconversin de sales:

3. Concentracin de trazas: a veces es necesario concentrar un componente para poder hacer su determinacin. Por ejemplo, si se hace pasar un gran volumen de agua a travs de una resina catinica en su estado H+, se podrn concentrar iones metlicos presentes en el agua.

CROMATOGRAFA HPLC DE LIQUIDOS.ANTECEDENTESEn la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionariaA diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa.La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

HPLC preparativaEs la tcnica escogida para aislamiento y purificacindeproductos de valoren las industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologay la bioqumica.La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

FUNDAMENTOEl HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografa liquida dealta resolucin, es una tcnica cromatogrfica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones qumicas entre el analito y la columna cromatogrfica. Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba, inyector, columna de separacin y detector. El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase mvil liquida con alta presin. La muestra se introduce en pequeos volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de interacciones qumicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de retencin, nico para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composicin de la fase mvil. Los solutos ms comunes usados en la fase mvil son combinaciones de agua purificada con lquidos orgnicos, los ms comunes son Metanol y Acetonitrilo, tambin suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separacin de componentes. Tambin se usa el cido Trifluoroacetico para actuar como formador de pares inicos. Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elucin. Consiste en la variacin de la composicin de la fase mvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la matriz del analito en funcin de la afinidad del analito por la composicin de la fase mvil. Cada analito tiene un gradiente de elucin ptimo para obtener la mxima separacin de picos en el detector.DIAGRAMA DE EQUIPOEn la figura 9 podemos observar el diagrama bsico de un sistema de HPLC el cual consta de un recipiente para el solvente (fase mvil), la cual nos va a permitir separar nuestro compuesto de inters cuando entre en contacto con la (fase estacionaria), que es la columna por medio de un sistema de bombeo. Normalmente se emplea una micro jeringa que inyecta la muestra al sistema, La columna de cromatografa estar conectada a un detector, que medir la cantidad de cada uno de los componentes (ya separados) que vayan saliendo de la columna. Los datos de este detector suelen ser recogidos y procesados por una computadora que elaborar una grfica (un cromatograma), cuyos picos representarn cada uno de los compuestos que han sido separados por el HPLC. El rea bajo el pico ser proporcional a la cantidad del compuesto correspondiente.

Figura 9. Diagrama bsico de un sistema de HPLC

El cromatgrafo consiste de un contenedor del disolvente (Fase mvil), (b) una bomba que mueve el eluyente y la muestra a travs del sistema, (c) un inyector de la muestra, (d) una columna que provee el soluto de separacin, (e) un detector que nos permite visualizar la separacin de los componentes y (f) un recipiente de residuos. En la figura 10 se puede observar un equipo de HPLC , es un ejemplo de una instalacin modular, aqu se muestra un equipo modelo HP1200 que incluye un inyector automtico que, que permite el funcionamiento continuo, un controlador de temperatura de la columna, los compuestos que son eluidos , despus de su paso por el detector UV . En la actualidad existen una gran cantidad de cromatgrafos en el mercado, existen dos grandes opciones segn la concepcin instrumental, la ms econmica y verstil responde a un diseo modular como el ejemplo de la figura 2.8, de tal manera que sobre el diseo bsico puedan ir acoplndose o sustituyndose, diversos mdulos o sustituir los detectores, cada vez es ms frecuente en el mercado la opcin integral que tiene la ventaja de control nico a travs de un microprocesador, lo que sin duda reduce la intervencin humana y eleva la seguridad del proceso analtico , pero tiene los inconvenientes de la falta de flexibilidad (los mdulos no pueden operar independientemente) y su elevado costo.

Figura 10. Equipo de HPLC modelo HP1200

DETECTORESEl sistema de deteccin se trata de un mdulo del cromatgrafo de lquidos situado a la salida de la columna, que proporciona de forma continua informacin acerca de la composicin del flujo que circula a travs de l. Generalmente origina una seal elctrica continua, que debidamente amplificada y registrada, constituye el cromatograma, del que se extrae informacin cualitativa y cuantitativa de la muestra inyectada. Un detector debe de reunir ciertas caractersticas para su empleo: alta sensibilidad (del orden de 10-12-10-11g/mL), lo que implica un bajo ruido de fondo, la respuesta universal a todos los solutos, amplio rango lineal de concentracin (5-6 ordenes de magnitud volumen mnimo en la celda de flujo, para evitar la dispersin de los solutos, debe de ser no destructivo, en caso de que se requiera recoger fracciones, insensible a cambios de presin temperatura, etc. Debe de operar continuamente durante largo tiempo ser asequible a la automatizacin. Los modos de deteccin ms utilizados se basan en las propiedades pticas de los compuestos (absorcin, fluorescencia e ndice de refraccin). Detectores espectrofotomtricos. Este tipo de detectores se basan en la ley de Lamber-Beer = AB la absorbancia A de la fase mvil se mide a la salida de la columna, a una o varias longitudes de onda en el UV o visible, la intensidad depende del coeficiente de absortividad molar caracterstico, lo que hace que no sea posible el clculo de las concentraciones de cada una de las especies detectadas por medida directa de las reas de los picos, que no considerara estos coeficientes de absortividad especficos. La fase mvil debe mostrar una absorbancia despreciable. Para aquellos compuestos que no poseen un espectro de absorcin aprovechable, se recurre a formar derivados de los analitos. Para los detectores existen dos modelos bsicos de deteccin monocromtica o policromtica, en la primera como su nombre lo indica permite aislar una longitud de onda especifica y el modelo policromtico permite registrar la absorbancia en varias longitudes de onda al mismo tiempo o tambin percibir todo un campo de longitudes de onda sin interrumpir la circulacin en la columna. El detector de arreglo de diodos permite no solamente obtener un cromatograma sino tambin proporciona informaciones espectrales que puedan servir para asegurar la identidad de los compuestos separados. Detectores espectrofluorimtrico. Los compuestos fluorescentes remiten, en forma de luz, toda una parte de la radiacin de la fuente luminosa a la que estn sometidos. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentracin de la sustancia a condicin de que esta sea dbil, el campo de aplicacin de este tipo de detector es muy sensible y selectivo, puede ampliarse aplicando reacciones de formacin de derivados fluorescentes. Para estos procedimientos se sita un reactor antes de la columna (precolumna) o bien entre la columna y el detector (postcolumna) para realizar una o varias reacciones sobre los compuestos para hacerlos fluorescentes. Detector refractomtrico. Su funcionamiento se basa en lo que ocurre cuando un haz luminoso (mono o policromtico) pasa a travs de una clula que contiene dos compartimentos, uno de los cuales se rellena solo con una fase mvil y el otro con eluyente a la salida de la columna. La diferencia de los ndices de refraccin entre los dos lquidos que aparecen cuando un soluto se mezcla con el eluyente, se traduce en un desplazamiento angular del haz refractado. En la prctica la seal corresponde a la medida en continuo de la retroalimentacin que hay que proporcionar a un elemento ptico para compensar el haz reflejado.CROMATOGRAMADeterminacin de hidrocarburos aromticos policclicos ligeros en aguas superficiales de los ros Almendares y Luyan en La HabanaSe realiz la identificacin y asignacin de los picos dentro de los cromatogramas por inyeccin conjunta de una dilucin de la muestra de referencia (Fig. 11) y patrones de naftaleno, fenantreno antraceno y pireno. El aumento significativo del rea del pico correspondiente a cada analito en cuestin fue el criterio para establecer la correspondencia plena entre los tiempos de retencin (tr) de cada una de las sustancias a analizar.

Figura 11.Cromatograma con la adicin de patrones de naftaleno, fenantreno y antraceno.USOSCampos de Aplicacin de HPLC Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa Separacin y purificacin de metabolitos Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina Purificacin y separacin de enantimeros Purificacin de compuestos naturales Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

REFERENCIAS. http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia(2) Harris, Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc Dabrio, M.V. 1971. Cromatografa de gases. Vol. I. Ed. Alahambra, S.A. Espaa. 182pp. Lehninger, Principios de bioqumica, quinta edicin Skoog, Douglas A. yLeary, James J. (1994), Anlisis Instrumental, Madrid:McGraw-Hill.2. Mc Master, Marvin (1994) HPLC: APractical User's Guide. Wiley-VCHMTODOS Y ANLISIS DE MUESTREO. CROMATOGRAFA