Date post: | 27-Sep-2018 |
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Sistemas cromatográficos
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
FM FE MÉTODO
Sistemas a desarrollar
• L convencional/fase ligada reparto• sólida adsorción• resina intercambiadora intercambio iónico• gel poroso tamizado• soporte con ligando unido reacción específica
Líquida
Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida
- Fuerzas iónicas
- Fuerzas polares
- Fuerzas dispersivas
- Enlace de hidrógeno es un ejemplo de fuerzas polares muy fuertes
Fuerzas iónicasSurgen de cargas eléctricas permanentes (netas) de las moléculas. Se usan en cromatografía de intercambio iónico.
Fuerzas polares (van der Waals)Surgen de dipolos permanentes o inducidos en moléculas sin carga neta. La proximidad de una molécula con dipolo permanente a otra molécula polarizable produce un par de cargas opuestas en dicha molécula (polariza) resultando una interacción eléctrica entre cargas inducidas y permanentes. La sílica exhibe fuertes interacciones polares con solutos y solventes debido a su superficie altamente polar con grupos silanol que tienen dipolos permanentes muy fuertes.
Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida
Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida
Fuerzas dispersivas (fuerzas de London)Son las más débiles. Ocurre atracción entre dipolos instantáneos en una molécula. Resultan de fluctuaciones de carga (Ej. fuerzas moleculares que ocurren entre moléculas de hidrocarburos). Las interacciones de solutos y solventes con una fase reversa (considerando ausencia de grupos silanol) son exclusivamente de naturaleza dispersiva.
Cromatografía de reparto
Fase estacionaria LÍQUIDA
Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE
Cromatografía de partición o reparto
CL convencional Fase ligada
El líquido (FE) estáadsorbido sobre un soporte sólido inerte
Las cadenas carbonadas (FE) están unidas covalentemente
al soporte sólido inerte
Fase inversaFase móvil polar/ Fase estacionaria no polar
Fase normalFase móvil no polar/ Fase estacionaria polar
Cromatografía L-L convencional
soporte inerte
FE (líquida)
OH
OHOH
SiO
Si
O
Si
HO
O
SiOSi
O
OH
OHOH
OH
La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE
Representación esquemática de partícula de silicagel
Fase unida o ligada
grupo silanol
grupo silanol reactivo
unión siloxano
- HCl+
Si
H
Si OH
OSi
O
C 3
CH3
R
unión siloxano
alquil clorosilano
Si OH
OHSi
O Si
CH3
RCl
CH3
C6H13C8H17C18H37C4H6NC8H9SO etc
Empaques de siloxanos: las fases ligadas más frecuentes (cepillo, oligomérica y voluminosa) son producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos, respectivamente.
Fase unida tipo “cepillo” (brush)
impedimento estérico (grupos metilos unidos al silicio)
más aceptada
Estructura A Estructura B
Los grupos están en posición perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha
Fase unida tipo “oligomérica”
Alquil diclorosilano
Etapa 1
Fase unida tipo “oligomérica”Etapa 2
Etapa 3
Se trata la sílica en forma alternada con agua y diclorosilano. Se va formando el oligómero que constituye la FE
Fase unida tipo “oligomérica”
Etapa final
Cuando se une la última cadena, se hace reaccionar al grupo silanol remanente con trimetil clorosilano.
Es la fase ligada más difícil de obtener
CH3
Fase unida tipo “voluminosa” (bulk)
Alquil triclorosilano
Etapa 1
Consiste en una película polimérica algo abierta de FE cubriendo la superficie de la sílica
Fase unida tipo “voluminosa”
Etapa 2 La cadena “octildicloro”
reacciona con agua para dar una cadena “octildihidroxo”
Fase unida tipo “voluminosa”Etapa 3
La cadena “octildihidroxo”reacciona con moléculas de triclosilanos y forma la superficie polimérica.
Los grupos clorosilanos tienen libertad de movimiento para reaccionar con silanoles de la superficie (capa de polímero entrecruzado)
� Las fases tipo “cepillo” (brush) se sintetizan de una manera reproducible, y por lo tanto son generalmente recomendadas para la mayoría de las aplicaciones.
� Las fases voluminosas (bulk) tienen alta capacidad retentiva y son adecuadas para sistemas que operarán con mezclas de solventes acuosos con altos contenidos de agua.
Fases ligadas
Fase unida o fase ligada
Fase normal Fase reversa
La FE es más polar que la
muestra y la FM
La FE es menos polar que la muestra y la FM
� FM de baja polaridad/ FE polar
� Solutos poco polares eluyen primero
� Incrementar la polaridad de la FM tiene el efecto de reducir el tiempo de elución.
� R-Polar: ciano, diol, amino, dimetilamino.
� FM de baja polaridad: etil éter, cloroformo, hexano
Fase normal
H HN
NO2
---
---
Ejemplo de interacción con fase normal
enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie
� Más ampliamente utilizada
� Las fuerzas interactivas entre FE y soluto (o solvente) son de naturaleza dispersiva: fuerzas de dispersión de London.
�Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad eluyen primero.
�R más comunes: C8 (n-octil) y C18 (n-octildecil)
�Cuanto mayor es el número de átomos de carbono en R mayor es la eficiencia.
�Elución a pH>7.5 puede producir hidrólisis del siloxano
Fase reversa
Ejemplos de fases ligadas reversas
Hexil, C6
Octil, C8
Octadecil, C18
fenil
Alquil fluorada
(reactivo = perfluorooctil dimetil clorosilano)
Ejemplos de fases ligadas
C-18 C8
C1
PFPOxy-Phenyl(pentafluorofenil)
Efecto de la longitud de la cadena en la eficienciade columna de fase reversa
1 uracilo, 2 fenol, 3 acetofenona, 4 nitrobenceno, 5 metil benzoato, 6 tolueno
R= C3 R= C8 R= C18
Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto
Fluoroalcanos < -2
Ciclohexano 0.04
Tolueno 2.4
Cloroformo 4.1
Etanol 4.3
Acetato de etilo 4.4
Metanol 5.1
Nitrometano 6.0
Etilenglicol 6.9
Agua 10.2
SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)
Series eluotrópica de solventes
Fase normal Fase reversa
Hexano
Benceno
Cloroformo
Acetato de etilo
Metanol
Agua
Agua
Metanol
Acetonitrilo
POLARIDAD
POLARIDAD
FUERZA
+
+
+
- -
-
Orden de eluciónPolaridades de los solutos: A > B > C
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
CAMPO MEZCLAS TÍPICAS
Fármacos Antibióticos, analgésicos, sedantes, esteroides
Bioquímica Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
Alimentos Edulcorantes, aditivos, aflatoxinas, antioxidantes
Industria química Aromáticos condensados, tensioactivos,colorantes
Contaminantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, HPAs
Química forense Drogas, venenos, narcóticos, alcohol en sangre
Medicina clínica Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos
Cromatografía de adsorción
Fase estacionaria sólida
Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc.
Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3
Microscopía electrónica de barrido de soportes cromatográficos porosos
sílica de forma irregular
partículas esféricas de
sílica
monolítica de sílicapolímeros orgánicos monolíticos
OH
Si Si
OH
OO
H
solvente débil
analito
Si Si
OH
OO
H
HO R
O
R
solvente fuerte
analito solvente
Cromatografía de adsorción
Sílicagel
cloroformo n-heptanosoluto
sílica
Solvente fuerte: sorción
cloroformo n-heptano
soluto soluto
sílica
Solvente débil: desplazamiento
sílica
Sílica cubierta con bicapa de solvente
Soluto interactuando con 2da capa de solvente B (sorción)
Soluto interactuando con 1er capa de B (desplazamiento)
Solvente B desplazado
Soluto interactuando con 1er capa de B (sorción)
Soluto interactuando con sílica (desplazamiento)
Solvente A desplazado
Soluto interactuando con 1er capa de A (sorción)
Soluto interactuando con sílica (desplazamiento)
Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder (ε°).
Fluoroalcanos 0.00 -0.25Ciclohexano 0.01 -0.2Tolueno 0.22 0.29Cloroformo 0.26 0.40Acetato de etilo 0.48 0.58Etanol 0.70 0.88Metanol 0.75 0.95Etilenglicol 0.90 1.11Agua grande grande
SOLVENTE εO (SiO2) εO (Al2O3)
Elección de la fase móvil
fase móvil interactiva fase móvil no-interactiva
reparto, adsorción, intercambio iónico
CG y exclusión molecular
los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada
participación activa en la separación
los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada
la FM solo transporta la muestra a través de la FE
Se produce un equilibrio entre fuerzas intermoleculares de soluto, FE y FM
hidrocarburos<éteres<ésteres<cetonas<aldehídos<amidas<aminas<<alcoholes<agua
Se elige la polaridad de FE bastante similar a la de los analitos y para eluir se usa FM de polaridad considerablemente distinta
Polaridad creciente
Cromatografía de intercambio iónico
FE cargada
Fundamento de separación:intercambio reversible de iones entre el analito y la FE funcionalizada. Intervienen fuerzas electrostáticas.
Fase estacionaria: resinas y geles de intercambio iónico, intercambiadores iónicos inorgánicos
Fase móvil: ácidos y bases inorgánicos y orgánicos (KOH, NaOH, HClO4, HCl, ácidos tartárico, dipiconílico, metanosulfónico, etc), sales (carbonato de sodio, perclorato de sodio, etc.), con o sin mezcla de solventes orgánicos (metanol, acetonitrilo, etc.)
Detector: conductímetro
Fases estacionarias
Resinas de intercambio iónicoSe usan para moléculas pequeñas (PM<500). Penetran en los poros pequeños de la resina
Geles de intercambio iónicoSe usan para moléculas más grandes (proteínas y ácidos nucleicos)
Intercambiadores iónicos inorgánicos (óxidos hidratados de Zr, Ti, Sn y W)Separaciones que exigen condiciones químicas fuertes (alta temperatura, agentes oxidantes fuertes, radiación)
Cromatografía Iónica
� La cromatografía iónica es una variante de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de intercambio iónico.
� Se utilizan columnas de intercambio iónico especialmente diseñadas para este tipo de cromatografía.
� Los conectores del cromatógrafo iónico son poliméricos (en vez de ser de acero inoxidable). El más común es el PEEK (polyether ether ketone).
� Se utilizan detectores conductimétricos, amperométricos, UV, etc, aunque el más común es el conductímetro.
� El resultado es un cromatograma donde la posición de los máximos nos indica el ión presente (carácter cualitativo) y su área nos indica que cantidad existente de dicho ión (carácter cuantitativo).
Cromatografía Iónica
SO4-2
NO3
-
F-
PO4-3
Cl-
NO2
-Inject
Minutes0
Br-
Hace 25 años….
Análisis de aniones en la actualidad
Intercambiador Grupo Nombre comercial
catiónico
ácido fuerte ácido sulfónico Dowex 50, Amberlite IR120,Ionac CGC-240
ácido débil ácido carboxílico Amberlite IRC 50, Ionac CGC-270
Aniónico
base fuerte ión amonio cuaternario Dowex 1, Amberlite IRA 400, Ionac AGA-542
base débil grupo amina Dowex 3, Amberlite IR-45Ionac AGA-316
Resinas de intercambio iónico
Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte
Resinas de intercambio catiónico: ácido debil
Resinas de intercambio aniónico: base fuerte
Resinas de intercambio aniónico: base debil
Diferentes empaques en intercambio iónico
vidrio
película intercambiadora: microesferas de sílica o vidrio (1 - 2 µm) cubiertas con intercambiador iónico
30 – 40 µm
Resina pelicular
Resina macroreticular
macroporos
x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3 )xMx+ + x H+
sólido solución sólido solución
El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio
El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio
x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3
+]x Ax- + x OH-
sólido solución sólido solución
Se aplica elución en gradiente con fuerza iónica creciente o mediante cambios de pH
Un gradiente de fuerza iónica es semejante a gradiente de solvente o de temperatura
0.005 M
Ni
Mn
CoCu
Fe
Zn
12 M HCl
6 M
4 M
volumen de retención
cc
Ejemplo: Separación de iones metálicos como cloro complejos en un intercambiador aniónico fuertemente alcalino con gradiente de elución con HCl
0.5 M
2.5 M
El Ni prácticamente no forma complejo con el Cl- y eluye primero, sin quedar retenido. Le sigue el Mn y así sucesivamente hasta llegar al Zn que forma el complejo más estable y es el más retenido
DetectorEl conductímetro es el detector universal de iones
Problema: gran concentración iónica del eluyente → elevada conductividad de FM → línea de base alta en el cromatograma → se reduce la señal del analito y por lo tanto la sensibilidad
Solución: columnas supresoras (colocadas inmediatamente después de la columna), que reducen la línea de base
Contienen una segunda resina de intercambio iónico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares
poco ionizadas, sin alterar los iones del analito
Se requiere “suprimir” la señal del eluyente
Cromatografia de aniones con supresión iónica
COLUMNA DE SUPRESIÓN
Intercambiador catiónico fuerte
muestra KNO3/CaSO4
eluyente Na2CO3
COLUMNA DE SEPARACIÓNIntercambiador aniónico fuerte
conductímetro
desecho
Se retienen los aniones de la muestra
Reacción del eluyente con el supresor
2Na++CO32- +2H+ 2Na+ +H2CO3
Especie poco disociada
Sin supresión
contraiones SO42-
SO42-
Tiempo de elución
NO3-
NO3-
Con supresión química
Tiempo de elución
cccc
Otro ejemplo de cromatografía de aniones con supresión iónica
Eluyente NaOH
bomba
NaBrNaOHNaClNaF
HBrH2OHClHF
detector
NaBr, NaCl, NaF, NaOH(diluyente)inyector
residuosTiempo
cc
Columna separadora
Columna supresora
Cromatografia de cationes con supresión iónica
COLUMNA DE SUPRESIÓN
Intercambiador aniónico fuerte
eluyente HCl
COLUMNA DE SEPARACIÓNIntercambiador catiónico fuerte
conductímetro
desecho
muestra KNO3/CaSO4
H+ + Cl- + OH– Cl– + H2O
K+
tiempo de elución
ccCa2+
Inconveniente de las columnas supresoras: necesidad de regenerarlas periódicamente a fin de convertir sus rellenos a la forma ácida o básica original.
Actualmente se dispone de supresores de membrana que operan continuamente. El eluyente y la solución supresora fluyen en direcciones opuestas en ambos lados de membranas permeables de intercambio iónico: para aniones → membranas intercambiadoras de cationes y para cationes →
intercambiadoras de aniones.
Ejemplo: para eliminar los Na+ del eluyente, en la corriente supresora fluye continuamente HCl para la regeneración. Los Na+ migran a través de la membrana y se intercambian con los H+ del reactivo regenerador. El dispositivo tiene una velocidad de intercambio muy alta.
¿Con o sin supresión?
Cromatografía de exclusión molecular
FE: geles porosos
Hidrofílicos Hidrofóbicos
Filtración en gel Permeación en gel
Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito
Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.
Exclusión molecular
Exclusión molecular
K = 0.2 K = 0.5Rta
Volumen
VSVM
Exclusión total
Permeación selectiva
Permeación total
102
104
106
Volumen
PM
VR - VM
VS
K =
K = 0 K = 1
Exclusión molecular
Utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-receptor.
Un ligando se une al soporte de la FE. Cuando la muestra atraviesa la columna solo se retiene la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.
Concluida la separación, se provoca la salida de la sustancia que dio la reacción específica.
Cromatografía de afinidad
ligando unido covalentemente
empaque
muestra
analito
etapa de lavado
etapa de elución
columna regenerada
solución con analito puro
+
etapa de interacción
Cromatografía de afinidad
Métodos de Elución
Elución bioespecífica: La FM contiene un ligando de bajo peso molecular, capaz de desplazar a la macromolécula del sitio activo de la FE.Normal (interacción ligando-muestra)Inversa (interacción ligando-ligando de afinidad)
Elución no específica: La fase móvil provoca la desnaturalización de la muestra, del ligando de afinidad o de los dos.
Cromatografía de afinidad
proteínas no
deseadas
columna conteniendo polímero unido a
ligando específico para la proteína de interés
mezcla de proteínas
la proteína de interés se eluye con solución de ligando
proteína de interés
ligando
ligando unido a polímero
ligando
Cromatografía de afinidad
proteína unida a residuos de glucosa (G) ligada a la fase estacionaria
adición de glucosa (G)
proteína liberada por unión a glusosa (G) adicionada
proteína
Cromatografía de afinidad
102
103
104
105
106
PM
no polar iónicopolar no iónico
Aumento de la polaridad
adsorciónintercambio
iónico
particiónfase
reversafase
normal
exclusión
permeación en gel
filtración en gel
Elección del sistema cromatográfico
Reacciones específicas: afinidad