CromatografíaTécnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria

Volumen de columna

Muestra aplicada

Matriz

Tapónporoso

Eluyente

Eluyente Proteínas separadas

Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente y que se.

Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna.

Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.

Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.

Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel

PRINCIPIO: Separación en función del tamaño

TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado

Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida

APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de proteínas

Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel

PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa

molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor

masa molecular

En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.

FASE ESTACIONARIA

Tipo Peso molecularLímite de

fraccionamiento (daltons)

Agua retenida(g/g gel sec)

Volumen de gel hidratado (ml/g

gel seco)

G10 Hasta 700 1.0 2

G15 Hasta 1500 1.5 3

G25 1000 - 5000 2.5 5

G50 1500 - 30 000 5.0 10

G75 3000-80 000 7.5 12-15

G100 4000 - 150000 10.0 15-20

G150 5000 – 400 000 15.0 20-30

G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

Desventajas: No se pueden obtener fracciones de

proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas

Detección de proteína

Fraccionar extractos proteicos

0.00.20.40.60.81.0

0 25 50 75 100 125 150 175 200

0.00.20.40.60.81.0

0 25 50 75 100 125 150 175 200

0.00.20.40.60.81.0

Abso

rbanci

a a

280 n

m (norm

aliz

ado) Alb + 0 hrs

Alb + 12 hrs

Tiempo (minutos)

Alb + 24hrs

Cromatograma

0.00.20.40.60.81.0

0.00.20.40.60.81.0

0 10 20 30 40 50 60 70

0.00.20.40.60.81.0

Alb + 0 hrs

AB

SO

RB

AN

CIA

A 2

80 n

m (N

OR

MA

LIZ

AD

O)

Alb + 12 hrs

NUMERO DE FRACCION

Alb + 24 hrs

Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz

Ejemplo: Mezcla de proteínas

MW (kDa)

75

440

Mezcla de proteínas

Conalbúmina +

Feritina

En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.

FASE ESTACIONARIA

Tipo Peso molecularLímite de

fraccionamiento (daltons)

Agua retenida(g/g gel sec)

Volumen de gel hidratado (ml/g

gel seco)

G10 Hasta 700 1.0 2

G15 Hasta 1500 1.5 3

G25 1000 - 5000 2.5 5

G50 1500 - 30 000 5.0 10

G75 3000-80 000 7.5 12-15

G100 4000 - 150000 10.0 15-20

G150 5000 – 400 000 15.0 20-30

G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

FerritinaConalbúmina NaCl

Proteína MW (kDa)

Conalbúmina 75

Ferritina 440

NaCl 0.058

Ejemplo:

-25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 32522

23

24

25

26

27

28

29

TIEMPO (Time [min.]:)CO

ND

UC

TIV

IDA

D (

Conductivity [m

S/c

m]:)

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

A 2

80 n

m (U

V [A

.U.]:)

Ejemplo:

MASA

TAMAÑO

Å

Å

kDa