Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
Definición de la Técnica
R Q
Sonda
A G C
dNTPsTaq
polimerasa
Tampón dereacciónCebadores
Ácido nucléico
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
UNG(opciona
l)
ROX
TTU
Termociclador
con sistema de detección
Agentes intercalantes
RT-qPCR
Cualitativa y cuantitativa.
Elevado rango dinámico de detección
Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-PCR
PCR Convencional
Semi-cuantitativa:
Rango dinámico pequeño ›2 logs Baja Precisión; baja resolución y
poco Sensible. Manipulación post-PCR . Baja Resolución No-automatización Discriminación basada sólo en
tamaño Los resultados no están
expresados en números. El BrET no es muy cuantitativo
A tiempo real(fase exponencial)
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Relativa
A tiempo final(fase plató)
Plus/Minus
Discriminación Alélica
Definición de la Técnica
Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
Escala semi-logarítmica
Cycle Number
Terminología asociada a qPCR
Plató
Lineal
BaselineCt value= 15.5
ThresholdExpo
nenc
ial
Log
Fluore
scence
Rn
+ ROX - ROX
Δ R
n
Ciclos Ciclos
Desv St= ± 0.059
Desv St= ± 0.306
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y
Stratagene.
ROX (6-carboxy-X-rhodamine) como referente pasivo
Terminología asociada a qPCR
mRNAmiRNAncRNAsiRNAsaRNACNA
SNPCNVMutacionesAnálisis Metilación
Análisis en Células StemAnálisis en célula Única
MicoplasmaPatógenos en la comida
Aplicaciones RTqPCR
Proteína
Tejido
Célula Eucariota
RNA
DNA
Virus
Bacteria
Target
5´oligo3´oligo
Validación Microarrays
Terminología asociada a qPCR
Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
qPCR Workflow
Slope= -1.365Slope= -2.276
qPCR Workflow
qPCR Workflow
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
Definir el experimento y los grupos control Número muestras de cada grupo Réplicas Experimentales (Biológicas y Técnicas) Distribución de placa (genes vs muestras)
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow: Diseño experimental
qPCR Workflow: Diseño experimental
Diseño experimental
qPCR Workflow: Diseño experimental
BIOLÓGICAS
TÉCNICAS
RÉPLICAS
Descripción de la muestra (Microdisección o macrodisección) Manipulación (si congelación o FFPE; cómo, que y cuando) Condiciones de almacenamiento
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow: Preparación de la muestra
Método de extracción Tratamiento con DNasa Calidad (Pureza & Integridad) & Cantidad Almacenamiento (-80ºC)
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicos
qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicos
Como afecta el método de extracción de RNA a los resultados qPCR
PUREZA: Libre de contaminación por:
Proteínas, sales caotrópicas y fenoles (Absobancia A260/A280 >1.8-2.0; A260/A230=2) gDNA (Tratamiento con DNAsa Inhibidores (SPUD assay (Nolan, 2006)
INTEGRIDAD: No degradado
rRNA (28S:18S=2:1) RIN (Fleige & Pfaffl, Mol. Aspects Med. 27(2006): RIN › 5) PCR test: Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)
CANTIDAD: Usar el mismo método de cuantificación en muestras que se quieren comparar. (Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005))
2:1
28S
18S
Intacto
Degradado
qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
FT-20ºC
FT-80ºC
4ºC
RT
-20ºC
qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
FT-20ºC
FT-80ºC
4ºC
RT
-20ºC
qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
Inhibición de la RT-qPCR en qué muestras
Material de partida: Muestras fecales Cartílago, hígado. Córnea, etc... Sangre total: heme Anticoagulante: Heparina
Causada por el método de extracción/protocolo erróneo: Etanol en el eluido por una insufiente centrifugación en el
segundo lavado puede inhibir las reacciones de RT y qPCR
cDNA o gDNA demasiado concentrado: Más del 10% de cDNA, gDNA en la qPCR inhibe la
reacción.
Como afecta la calidad del RNA a los resultados qPCR:
qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html
qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicos
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow: Transcripción Reversa
One-Step vs Two Step Cantidad de RNA y vol de reacción CDNA Priming Transcriptasa Reversa y concentración Pérfil Térmico Controles Réplicas
Es la etapa mas variable de todo el proceso
One-Step RT-PCR
Two-Step RT-PCR
RNA cDNA AmplicónRT qPCR
RNA cDNART
cDNA Amplicón
qPCR
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Descripción
Pros
Contras
Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.
Menos Background en ensayos SYBRGreen
No es posible la optimización por separado de ambas reacciones
AmpErase UNG, para prevenir contaminación, no se puede usar
Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa
.
Posibilidad de almacenar cDNA para la cuantificación de varios tragets.
Más eficiente porque se pueden usar Random primers y oligo(dT) a la vez.
Más flexible (Permite la optimización por separado de ambas reacciones.
Elevado Background en ensayos SYBRGreen
qPCR Workflow: Transcripción Reversa
qPCR Workflow: Transcripción Reversa
cDNA Priming
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow: qPCR
Diseño Amplicón y Oligonts. Reactivos, Instrumento, Perfil Térmico . Validación (Especificidad, Eficiencia, Reproducibilidad, Rango dinámico lineal). Controles Estrategia de Normalización
Las secuencias de los oligonts y del amplicón tienen que ser únicas.
No deben tener estructuras secundarias.
Los oligonts no deben amplificar DNA (diseño en la zona exon/exon)
Idealmente, deberían testarse dos parejas de oligonts.
Efecto de la Tª de anillamiento sobre la estructura secundaria del amplicón: El análisis de la secuencia del amplicón mediante el MFOLD predice elevada estructura secundaria a 60ºC y baja a 65ºC.
MFOLD
Amplicón 75-150 bp. 50-60% contenido en GC.
Oligonts TM= 55-65ºC. 50-60% contenido en GC. Evitar homopolímeros, sobretodo de G. Los 5 nts en el extr3¨no deben ser más de 2 G y/o C.
qPCR Workflow: qPCR
Aplicación
Método de Normalización
Química de detección: Sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes Intercalantes Fluorocromos unidos a primers
Reactivos: Core kit vs Master Mix dNTPs/dUTPs y UNG enzyme ROX como referente pasivo
Termociclador: Formato Número de canales de detección Software de análisis Duración del programa Precio y flexibilidad de la oferta
qPCR Workflow: qPCR
Perfil térmico qPCR que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG2.- Activación Taq y desnaturalización UNG3.- Desnaturalización del dsDNA4.- Anillamiento y extensión primers
qPCR Workflow: qPCR
Normalización respecto a la masa total de RNA exraído(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
Normalización respecto al volumen/masa de la muestra( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
Normalización respecto al número de células( moléculas/célula)
Normalización respecto a un gen endógeno no regulable(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3) geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology) BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004) Normfinder Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome
Biology)
Estrategias de Normalización qPCR
BMC Bioinformatics 2009, 10:110
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review
qPCR Workflow: qPCR
qPCR Workflow: qPCR
Los genes de referencia tienen que: ser de expresión constante No ser regulados por las diferentes condiciones experimentales Suficientemente abundantes entre los diferentes tejidos y tipos celulares.
Se recomienda el uso de al menos 3 genes de referencia para la normalización de datos de qPCR.
EL gen de referencia “Perfecto” NO existe.
Genes de Referencia
Softwares: genNorm Normfinder
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo.
Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos.
Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada.
Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.
Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.
Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
qPCR Workflow: qPCR
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Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
Controles qPCR
NEGATIVOS NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para
normalizar. Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
Curva de Disociación (SYBR Green)
Curva Estándar Linealidad de los datos Distancia entre las curvas de amplificación Eficiencia de amplificación
qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qPCR
Pendiente
EficienciaAmplificación
(E= 10-1/slope)
Convertir E enPorcentaje
%E= (E-1)100%
-3,0 2,2 115
-3,1 2,1 110
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
Curva Estándard:
Slope= -3.73
2n=Factor de dilución
FactorDilució
n
n=LG(Factor Dil.)/LG(2)
2 1,00
5 2,32
10 3,32
OK
R2 ›0.98 o r › 0.99
qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qPCR
SlopeR2
ΔC
t=
(Ct
gen T
arg
et
– C
t gen E
ndógeno)
Log Diluciones
Y = 0.0471x + 3.0178R2 = 0.2315
Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC
qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qPCR
PreparaciónMuestra
RNA cDNAProducto Amplifica
do
MuestraDNA
Diseño Experimental
Extracción Ác. Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
qPCR AnálisisEstadístico
Estrategia Cuantif.
qPCR Workflow
UEB
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Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
Placas-384
Servicio de RTqPCR en la UCTS
Microfluidicas(Arrays de baja densidad)
Placas-96
FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.Formato LDA: FAM, VIC, ROX.
7000 SDS 7900HT Fast SDS
Química
Softwares V1.2.3f2 con RQ studyPrimer Express 2.0
SDS 2.4.1RQ Manager 1.2
Tiras de 8 Tubos
LightCycler 480
White Plates-384
mode 9600 Emulation /Standard 9600 Emulation/StandardFast
Formato
Filtros/canales detección:500, 533, 568, 610, 640, 670 nm
Ref. Pasivo ROX ROX Ninguno
Fast
SW 1.5
Elección en el software del ensayo a realizar
Software qPCR Plantilla para el Run Análisis
7000 SDS de ABI
1.-Absolute Quantification (Standard curve)
2.-Relative Quantification
(ddCt) Plate
Absolute Quantification (Standard curve)
Relative Quantification (ddCt) Study
7900 SDS de ABI 1.- Standard Curve (AQ)
2.- ΔΔCt
LighCycler480
7000 SDS 1.1 RQ Study
Servicio de RTqPCR en la UCTS
LightCycler 480 II
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qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
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Bibliografía muy recomendada
Direcciones de interés relacionadas con qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
http://genex.gene-quantification.info/
Gracias