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" Desarrollo de Métodos LC robustos: la combinación óptima
columna-plataforma instrumental HPLC/UHPLC/UPLC "
Presentadora: Olatz Mitxelena Chat: Elena Chiquero
Dpto. Columnas y Accesorios
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Comunicación a través del chat Q&A (durante la presentación y/o turno de preguntas tras presentación) Encuesta al finalizar la sesión
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Maximizar prestaciones Columnas
1kk
α1α
4NRs
+−
=
Contribuciones mecánicas
Baja dispersión: combinación óptima instrumento
Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula
Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas
Contribuciones físico-químicas
Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos
Trabajar a pH extremos Aumentar la retención
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Introducción: plataformas LC actuales
Desde 2004 la tecnología LC ha evolucionado con gran contribución de Waters en constante innovación teniendo como base las necesidades de nuestros clientes para la obtención de resultados robustos, fiables y en cumplimiento de las normativas
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Introducción: plataformas LC actuales
Alliance HPLC
ACQUITY Arc
ACQUITY UPLC H-Class
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Contribución a la dispersión
Sistema Cromatográfico: diseño y diámetro de tubos, fluídicas inyector y celda detector
Columna Cromatográfica: tamaño de partícula y geometría
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Contribución Instrumento
Avances y desarrollo de ingeniería han reducido dispersión – Diseño inyector – Volúmen reducido tubos – Células de detector de dispersión reducida
2222,
2,
2,
2,
2, Fdetectordetectorv,postcolumnvcolumnvprecolumnvinjectorvtotalv ⋅+++++= τσσσσσσ
Volumen inyección
+ Ensan-
chamiento inyector
Tubo Entre
inyector Y
columna
Volumen columna
+ Diseño
columna
Tubo entre
columna y
detector
Ensan- chamiento
Celda detector
+ tubos
Ensan- Chamiento
en tiempo en detector (Veloc.
adquisición; Constante
tiempo)
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Contribución Instrumento
Alliance HPLC
ACQUITY Arc
ACQUITY UPLC H-Class
> 30 µL
12-30 µL
< 12 µL
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Contribución Instrumento: Columna CORTECS 2.1 x 50 mm 1.6 µm
N5σ : 18,000
Minutes 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40
N5σ : 14,900
N5σ : 12,000
-33%
-17%
5.5 µL band spread
14 µL band spread
29 µL band spread
1. Acetone, 2. Naphthalene, 3. Acenaphthene
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Contribución de la Columna (ecuación de van Deemter):
-Tamaño de partícula dp -Longitud de Columna L
-Diámetro interno de columna I.D.
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Contribución Columna: tamaño de partícula dp
Disminuir tamaño de partícula conlleva aumentar eficacia (clave Empaquetamiento) “estilizado de picos”
Consecuencia: presiones mayores
Ecuación de van Deemter: eficacia en función de la velocidad lineal
1.7 µm 2.5 µm 5 µm 10 µm 3 µm
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Contribución Columna: longitud de columna L
Aumentar longitud de columna conlleva aumentar eficacia
Consecuencia: tiempos de retención mayores y mayores presiones
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Contribución Columna: diámetro interno de columna ID
El diámetro interno de la columna incide en el caudal de trabajo: para mantener velocidad lineal, disminuir diámetro interno conlleva a trabajar a caudales menores
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Influencia dispersión de Sistema en ID: Sistema HPLC ~50 µL
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50
CORTECS HILIC, 2.7 µm
4.6 x 50 mm
CORTECS HILIC, 2.7 µm
3.0 x 50 mm
CORTECS HILIC, 2.7 µm
2.1 x 50 mm
7200
4800
2900
Rs(1,2)=3.6
Rs(1,2)=2.5
Rs(1,2)=1.4
Efficiency
-33%
-60%
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Contribución Columna: diámetro interno de columna ID
Mayor impacto de la dispersión del sistema en diámetros internos menores
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Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfica óptima
Combinación Sistema LC y Columna adecuados
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Seleccionar el tamaño de partícula adecuado a la dispersión que generará el Sistema LC
Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima
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Adecuar el tamaño de partícula con el ID de la columna que mejor se ajuste al sistema cromatográfico
Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima
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Seleccionar el caudal de trabajo para la velocidad lineal óptima para maximizar la eficacia de la columna (van Deemter)
Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima
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El sistema LC debe ser capaz de trabajar contra la presión resultante de las condiciones óptimas seleccionadas en función de la columna
Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima
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Impacto en prestaciones para combinaciones inadecuadas Sistema y Columna
UHPLC UPLC HPLC A
U
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
2.1 mm ID 1.6 μm 50mm length
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
3.0 mm ID 2.7 μm 50mm length
4.6 mm ID 2.7 μm 50mm length
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Combinación adecuada Sistema y Columna = Mejor Prestación Cromatográfica
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Combinar Sistema LC y Columna
La calidad de la separación cromatográfica queda definida por la combinación de Instrumento y Columna
Caudal y presión no son causa sino consecuencia de la optimización de las condiciones de la separación cromatográfica
Sistema HPLC UHPLC UPLC Dispersión > 30 μL 12 – 30 μL <12 μL
Tamaño Partícula 3.5 μm, 5 μm, 10 μm (Prep) 2.x μm, 3.5 and 5 µm < 2 μm
Presión rutina < 4000 psi < 10000 psi < 18000 psi (I-Class)
ID Columna 4.6 mm (3.0 mm) 3.0 mm (2.1 mm) 2.1mm (1.0 mm)
Longitud Columna 75 - 250 mm 50 mm - 100mm ≤ 150 mm
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Maximizar prestaciones Columnas
1kk
α1α
4NRs
+−
=
Contribuciones mecánicas
Baja dispersión: combinación óptima instrumento
Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula
Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas
Contribuciones físico-químicas
Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos
Trabajar a pH extremos Aumentar la retención
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Tecnología Partículas
Tecnología CORTECS Solid-Core
Mayor eficacia y
resolución
Productividad mejorada a resolución similar
Mayor prestación a igual
presión
Tecnología BEH
Estabilidad pH sin precedentes
Versatilidad fase móvil y
temperatura
Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC
Tecnología HSS
Máxima Retención
Selectividad partícula y ligando
Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC
Tecnología CSH
Capacidad de carga excepcional
Forma de pico superior para analitos básicos
Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC
TODAS disponibles en tamaños de partícula HPLC, UHPLC, y UPLC
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La gama más amplia de columnas LC
Siete partículas base • BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: 125Å , 130Å, 200Å y 300Å • CSH [Charged Surface Hybrid] y HSS [High Strength Silica] • Sílica Núcleo Sólido
Selección amplia y creciente de químicas de columna • 19 fases estacionarias escalables
• BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC y Amide • BEH 300Å C18 y C4
• HSS C18, T3, C18 SB, PFP y CN • CSH C18, Fluoro-Phenyl y Phenyl-Hexyl • Sílica Núcleo sólido C18, C18+, HILIC
Soluciones certificadas aplicaciones específicas • SEC, AAA, OST, PST, PrST y Glycan
Transferencia entre HPLC y UPLC XBridge HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC BEH XSelect HSS HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC HSS XSelect CSH HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC CSH CORTECS UPLC y UHPLC
Guarda columnas VanGuard
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Constante crecimiento rango Selectividades
ACQUITY UPLC BEH Phenyl XBridge Phenyl
ACQUITY UPLC BEH C18 XBridge C18
ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18
ACQUITY BEH C8 XBridge C8
ACQUITY UPLC HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB
ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18
ACQUITY UPLC HSS T3 XSelect HSS T3
ACQUITY UPLC CSH C18 XSelect CSH C18
ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl
ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl
ACQUITY UPLC HSS CN XSelect HSS CN
ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP
CORTECS C18
CORTECS C18+
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Conditions : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF3COOH in H2O Mobile Phase B: 0.08% CF3COOH in ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B 0.0 92 8 6 0.1 92 8 6 4.45 50 50 7 4.86 10 90 6 5.0 92 8 6 6.0 92 8 6 Injection Volume: 1.0 µL Sample Diluent: 50:50 H2O: MeOH with 0.05% CF3COOH Sample Conc.: 100 µg/mL Temperature: 40 oC Detection: UV @ 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC®, with ACQUITY UPLC® TUV
Compounds 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid
1 2 4 5 3 BEH C18
BEH C8
BEH Shield RP18
BEH Phenyl
1 2 4 5 3
1 2 4 5 3
1 2 4 5 3
1 2 4 5 3 HSS T3
HSS C18 1 4 3 5 2
Gama amplia Selectividades
1 2 4 5 3 HSS C18 SB
HSS CN
HSS PFP 1 2 3
4 5
1 2
4
3 5
1 2 4 3 5 CSH Phenyl-Hexyl
1 2
4
3
5
CSH Fluoro-Phenyl
CSH C18 1 2
3,4
5
Comparative separations may not be representative of all applications
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Avances en Tecnología de partículas: Partículas Porosas vs. Núcleo Sólido
Solid- Core
Solid-Core
Par
ticle
Attribute CORTECS
ρ 0.7
Particle Size 1.6 µm, 2.7 µm
Pore Volume 0.26 cm³/g
Pore Size 90 Å
Surface Area 100 m²/g
FIB SEM Images
Solid- Core
Solid-Core
Par
ticle
1.6 µm 2.7 µm
ρ = 0 → fully porous particle
ρ = 1 → nonporous particle
ρ = core diameter / particle diameter
2.5 µm
Fully Porous
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¡Nuevo! Guarda columnas VanGuard
Hasta el momento: – Optimizadas para columnas ACQUITY UPLC – Únicamente en 2.1 mm I.D. – Tamaño partícula Sub 2-µm
NUEVAS Vanguard HPLC
– Optimizadas para columnas HPLC/UHPLC – 2.1 x 5 mm; 3.9 x 5 mm – Tamaños de partícula 2.5/2.7 µm para columnas XP y UHPLC – Tamaños de partícula 3.0 - 5.0 µm para columnas HPLC
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Conclusiones
La combinación óptima columna e instrumento: – Maximiza eficacia cromatográfica – Reduce efectos extra-columna que degradan la prestación cromatográfica
o Sensibilidad o Eficacia o Resoución
Recomendación columna óptima según plataforma instrumental basada en la
Dispersión – HPLC (4.6 mm i.d) (>3 µm tamaño de partícula) – UHPLC (3.0 mm i.d.) (2 µm - 3 µm tamaño de partícula) – UPLC (2.1 mm i.d.) (< 2 µm tamaño de partícula)
Columnas XBridge BEH, XSelect HSS, XSelect CSH XP 2.5 µm y CORTECS 2.7 µm compatibles con plataformas HPLC, UHPLC y UPLC – Maximizan eficacia, prestación y productividad en cualquier sistema LC – Amplio rango (escalabilidad) de químicas, longitudes de columna y diámetros
internos