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Desarrollo de un producto fermentado probiótico
no lácteo a base de leche de almendras Laura Isabel Delgadillo Garcés
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
Resumen
En Colombia, el consumo de bebidas vegetales ha aumentado considerablemente en los últimos años. Entre estas, es útil resaltar
los productos a base de almendras como la leche o bebidas fermentadas. Estos productos tienen un alto contenido nutricional,
dado que su contenido de fibra es significativamente mayor al compararlo con bebidas similares. En adición, estos pueden ser
probióticos, es decir, incluyen microorganismos vivos, lo que según la Organización Mundial de la Salud (OMS) puede contribuir
beneficios a la salud humana [1]. De acuerdo con esto, se pretende desarrollar un producto fermentado probiótico cuya base sea
la leche de almendras y el cultivo Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Para esto, se
estandarizó el proceso de elaboración del producto. Este incluyó el desarrollo y la caracterización de la bebida base y el proceso
de la bebida probiótica fermentada. De lo anterior, se analizó el efecto de la concentración de leche base y volumen de inóculo a
añadir en el número de Unidades Formadoras de Colonia al finalizar el proceso de fermentación. Los resultados indican que una
concentración de 27.2 g/100 mL de leche base y un volumen de 2.0 μL/mL de inóculo añadido implican un número mayor de
UFC en el producto fermentado. Asimismo, que los factores seleccionados son significativos para el crecimiento microbiano.
Palabras clave: Fermentación láctica, Almendras, Probióticos, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp.
Bulgaricus
1. Introducción
La demanda de bebidas vegetales ha incrementado en los
últimos años. Según Mintel, el mercado de leche vegetal ha
tenido un aumento en los últimos cinco años de cerca del 61%
en Estados Unidos [2]. En el año 2017, Colombia se ubicó en
el tercer lugar de la lista de países latinoamericanos con mayor
consumo de leches vegetales con una comercialización de 1.4
millones de litros [3]. Análogamente, Mintel establece que la
preferencia de los consumidores por las leches vegetales se
basa principalmente en el cuidado de la salud [2]. Lo anterior,
dado que algunos productos de origen animal pueden estar
relacionados a intolerancia a la lactosa o alergias a proteínas
animales, entre otros. De acuerdo con esto, las leches vegetales
cuya base son principalmente cereales y nueces son una
alternativa al consumo de bebidas lácteas.
Entre los cereales se encuentran avena y arroz. Mientras que,
las nueces utilizadas generalmente son almendras, nueces del
nogal y avellanas. Entre estas, es útil resaltar aquellas
realizadas a base de almendras. Esto dado que, al ser estos
frutos secos, son una fuente significativa de ácidos grasos
monoinsaturados y tienen una relación adecuada entre
contenido de proteína y grasa. Además, contienen antioxidantes
como flavonoides, vitamina E y fibra. La información
nutricional de 100 g de Almendras crudas, de la variedad
Nonpareil, se encuentra en el Anexo 1. Esta variedad
corresponde a la utilizada en la experimentación. Sin embargo,
para la fabricación de bebidas vegetales a base de almendras
generalmente se utilizan almendras blanqueadas. Esto quiere
decir que la piel de las almendras ha sido removida después de
remojar las semillas en agua a 85ºC–100°C por entre 2 y 5
minutos. La semilla se seca y enfría a temperatura ambiente [4].
La información nutricional de 100 g de Almendras blanqueadas
establecido por el Departamento de Agricultura de Estados
Unidos se presenta en la Tabla 1 [5].
Tabla 1. Información Nutricional de Almendras blanqueadas [5].
Las leches vegetales son emulsiones (Sistemas coloidales)
formadas por la dispersión de gotas de aceite, partículas sólidas,
proteínas y gránulos de almidón. De lo anterior, la estabilidad
de la mezcla es altamente sensible a varios factores, entre estos
el tamaño de las partículas de grasa y estabilidad física de la
dispersión líquida. Esta última se relaciona directamente con la
separación de fases entre partículas de grasa, materia no soluble
y agua. Industrialmente, las bebidas vegetales se producen
mediante la aplicación de procesos térmicos y mecánicos con
aditivos con el fin de disminuir los problemas mencionados
anteriormente. En general, el procedimiento utilizado para
procesar leches vegetales de nueces se encuentra en la Figura
1.
Nutriente Unidad Valor
Grasas g 52.52
Fibra dietaria g 9.90
Proteína g 21.40
Sacarosa g 4.63
Humedad g 4.51
2
Figura 1. Procedimiento estándar para la producción industrial de
leche de Almendras [6]
Según Bernat, la aplicación de tratamientos de presión y
temperatura y la adición de compuestos como hidrocoloides
pueden permitir el desarrollo de un producto de alta calidad [6].
En este sentido, es útil conocer
la composición química de la
leche obtenida. De esta forma,
los valores promedio de la
composición química de leche
almendras comercial a partir
de lo encontrado en literatura
se presenta en la Tabla 2. Es
útil resaltar que la composición
promedio se encuentra entre 2
y 8% w/v [7].
De modo que, se afirma que industrialmente es posible obtener
una mezcla homogénea caracterizada, que se puede fermentar
biológicamente. En este sentido, la bebida de almendras es
materia prima para desarrollar productos fermentados análogos
al yogur, como se ha realizado con otras leches vegetales como
la de soya. En adición, dado que las nueces presentan
componentes no digeribles con propiedades prebióticas, son
considerados sustratos adecuados para el crecimiento
bacteriano. Asimismo, el contenido de fibra de la bebida de
almendras es relevante dado que, según Bernat, el almidón y la
fibra mejoran la estabilidad física de la leche vegetal
fermentada y promueven la supervivencia de los iniciadores
utilizados [6].
En este punto, es pertinente describir el proceso de
fermentación láctica. Este consiste en la degradación de
carbohidratos por parte de microorganismos y la acidificación
de la mezcla por la formación de ácido láctico. Este proceso
implica la formación de un gel a partir de una emulsión.
Estudios previos de fermentación realizados con bebida de
almendras indican que utilizar microorganismos de cepas como
Lactobacillus y Streptococcus mejoran la eficiencia del proceso
analizado. En adición, es útil resaltar la cantidad promedio de
azúcares en la leche de almendras mencionadas anteriormente
(Tabla 2). Si se realiza una comparación con el contenido de
estas en la leche de vaca (4-5g/100mL), la adición de
carbohidratos simples (azúcares) que permitan el crecimiento
microbiano se hace necesaria para llevar a cabo el proceso.
Asimismo, dado que se busca obtener un producto probiótico
es pertinente mencionar que debe tener un mínimo de
107UFC/g. El rango establecido para la concentración de un
producto con bacterias microbianas beneficiosa para la salud se
encuentra 106 − 107UFC/100 mL [8].
Adicionalmente, existen normativas para alimentos lácticos y
en este caso análogo-lácteos. Según el Codex [9], una bebida
fermentada debe cumplir con los siguientes requerimientos.
Tabla 3. Normativa según Codex para bebidas fermentadas [9]
Teniendo en cuenta lo anteriormente mencionado, el objetivo
de este proyecto es desarrollar un producto fermentado
probiótico a base de leche de almendras y del cultivo
Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp.
Bulgaricus como análogo-lácteo al yogur. Para esto se pretende
primero, estandarizar el proceso de leche de almendras base y
caracterizar la misma. Este análisis incluye propiedades como
pH, densidad y tamaño de partícula. En segundo lugar,
estandarizar el proceso de fermentación y analizar los factores
que intervienen en el mismo. De modo que, el siguiente
objetivo fue seleccionar los factores y niveles en concordancia
con el proceso de fermentación estandarizado, para realizar el
diseño de experimentos. De acuerdo con lo anterior, en este
proyecto se pretende analizar el efecto de la concentración de
leche de almendras y el volumen de inóculo a añadir para
obtener una bebida fermentada probiótica. En este sentido, se
realizaron análisis de las propiedades fisicoquímicas y
microbiológicas del producto.
2. Materiales y métodos
2.1 Preparación de leche base
Inicialmente, para la bebida de almendras base se utilizó una
relación (w/v) de frutos secos, remojados en agua durante 8
horas, y agua de 8:100. La preparación se llevó a cabo en la
licuadora Vitamix [10] en el ciclo 6 a temperatura ambiente.
Después de esto, el líquido obtenido fue procesado en un filtro
de tela con el fin descartar partículas significativamente
grandes que contribuyeran a los procesos de coagulación,
floculación y sedimentación de partículas. Estos procesos de
migración interfieren con la estabilidad el producto final. El
líquido lechoso obtenido se utilizó como muestra de control o
blanco. Antes de iniciar el proceso de fermentación y con el fin
Unidad Valor
Proteína % w/w mín. 2.7%
Grasa % w/w menos del 15 %
Ácido láctico % w/w mín. 0.6%
Unidades formadores
de colonia (UFC)UFC/g mín. 10
7
Nutriente Bebida de
Almendras
Lípidos 1.5-2.6
Proteínas 1.1-1.8
Fibra 12.5
Azúcares 0.1-1.6
Fibra 0.4-2.0
Tabla 2. Valores promedio de la
composición química de Leche
de Almendras comercial por 100
mL de producto líquido [6]
3
de aumentar en contenido de carbohidratos en la bebida base se
adicionó 0.75 g/mL de glucosa.
Sin embargo, los resultados de los procesos de fermentación
con la concentración de 8% no fueron satisfactorios. Esto dado
que bajo las condiciones establecidas no se formó un gel estable
y significativo respecto al volumen de leche base inicial. Por lo
que, la concentración de la bebida base cambió a 26, 27.2 y
28% (w/v). Es necesario mencionar que los valores
mencionados corresponden a la concentración de la leche base
después de la remoción de sólidos con el filtro de tela y que no
se añadió glucosa a la leche resultante.
2.2 Tratamientos de homogenización térmicos
Los tratamientos de homogeneización térmicos se realizaron en
un horno de secado por convección. Estos consistieron en
tratamientos a baja y alta temperatura. Por un lado, el
tratamiento a baja temperatura (LT) sometió las muestras a 85
º C durante 30 minutos. Por el otro, el tratamiento de alta
temperatura (HT) utilizó 121 º C durante 15 minutos para
homogenizar las mezclas.
2.3 Caracterización de leche base
Se realizaron mediciones de pH y densidad a la bebida de
almendras base con concentraciones de: 8, 26, 27.2 y 28.5
g/100 mL a temperatura ambiente. Para esto, se utilizó un pH-
metro Mettler Toledo y un picnómetro de 25 mL de capacidad.
Análogamente, se realizó la caracterización de estas mismas
bebidas. Esta incluyó la cuantificación de: humedad, cenizas,
proteína, y azúcares. Es relevante mencionar que estos se
determinaron a partir de lo establecido según Matissek [11] y
AOAC Internacional [12]. Los procedimientos empleados se
especifican a continuación.
•Humedad: Para este análisis se utilizó un Termobalanza Series
330XM. El procedimiento tarda cerca de 45 minutos.
•Cenizas: La muestra se secó en un horno durante 4 horas.
Después de desecar la muestra se calcula el residuo por
diferencia de peso.
•Azúcares: Se utilizó refractómetro a través de la medición de
°Brix como estimación sacarosa.
•Proteínas: Se utilizó el método de Kjeldahl. Este consiste en
calcular el contenido de proteína teniendo en cuenta el
contenido medio de nitrógeno.
En adición, la distribución de tamaño de partícula de las
muestras se realizó en un difractómetro láser (Mastersizer
2000). Para las mediciones se utilizó un índice de refracción y
absorción de 1.33 y 0.1 respectivamente y una tasa de
oscurecimiento entre 10 y 20%. Las muestras se diluyeron en
agua desionizada a 2000 rpm.
2.4 Diseño experimental
Dado que el diseño presenta como variables la concentración
de leche base y el volumen de inóculo a añadir se utilizó la
metodología de diseño factorial. Esto con el fin de obtener el
número de experimentos a realizar. En este, la variable de
respuesta se especificó como la cantidad de unidades
formadoras de colonia (UFC) después del finalizar el proceso
de fermentación. Es útil resaltar que para esto se utilizaron los
siguientes niveles de las variables mencionadas:
Tabla 4. Factores y niveles seleccionados para el diseño de
experimentos
Los criterios de selección de los niveles para cada factor se
describen a continuación. Por un lado, para el volumen de
inóculo a añadir se estableció el nivel Alto y Medio de acuerdo
con lo especificado en la ficha técnica del medio cultivo.
Mientras que, el nivel Bajo se estableció con el fin de asegurar
que el producto final correspondiera a una bebida probiótica.
Por el otro, los niveles para el factor de la concentración de
leche base se establecieron conforme a la normativa de Codex
[9] y con el aumento del módulo de almacenamiento G’ de
modo que se obtuviera una bebida fermentada con la menor
separación de fases.
2.5 Producto fermentado
Para el proceso de fermentación se utilizó el cultivo Lyofast
Y430-A. Este contiene los microorganismos Streptococcus
thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus. El
cultivo contiene entre 4 y 8 𝑥107 UFC/mL. La muestra por
fermentar se calentó a 50 °C durante 15 minutos con el fin de
evitar microbiota inicial patógena. Después de esto, se enfrió
hasta 40°C y se inoculó a la misma temperatura en una cabina
de flujo laminar.
El proceso de fermentación se llevó a cabo en un Shaker a una
temperatura de 40°C con el fin de evitar cambios en la
viscosidad a temperaturas mayores y tiempos de incubación
menores a los esperados (Entre 4 y 8 horas) [13]. Cuando el pH
de las muestras se encontraba en 4.8, se detuvo el proceso de
fermentación y las muestras se almacenaron a 4°C para los
análisis siguientes. Es útil resaltar que cada experimento se
realizó con una réplica y que los análisis mencionados se
realizaron tras 12 horas de almacenamiento.
2.6 Caracterización de producto fermentado
Se realizaron mediciones de °Brix con el fin de cuantificar el
contenido de sacarosa después del proceso de fermentación
para todas las muestras. Además, se realizaron mediciones de
Volumen de inóculo a
añadir (µL/mL leche )
Concentraciónde
leche base (g/100 mL)Nivel
2.0 28.5 Alto
1.0 27.2 Medio
0.4 26.0 Bajo
4
pH, acidez y potencial Z. Esto con el fin de establecer si el valor
de pH era cercano al punto isoeléctrico de la proteína de la
almendra (4.8) [14] [15] y cuál era la cantidad de ácido láctico
formado. Para la acidez se utilizó un titulador automático con
una solución de Hidróxido de Sodio (0.1 M) con 20 mL de la
muestra de bebida fermentada y con agitación constante. La
cantidad de ácido se determinó cuando el pH de la muestra
alcanzaba un valor de 8.2. Mientras que, para el potencial Z se
analizaron las muestras en un Zetasizer Nano Zs-Malvern
Instrumnets a 20 °C.
2.6.1 Conteo microbiano
Se realizó la preparación del agar de cultivo MRS selectivo para
bacterias ácido-lácticas. Para las siembras se utilizaron placas
de Petri con 20 mL aproximadamente del medio cultivo. Se
realizaron diluciones en solución salina de 10−7. La siembra de
todos los productos fermentados se realizó en una cabina de
flujo laminar bajo condiciones estériles con el fin de evitar
contaminación externa. Todos los materiales empleados
durante toda la experimentación fueron sometidos al Autoclave
con el fin de esterilizarlos.
Es útil resaltar que se realizaron siembras de leche base con el
fin de identificar microbiota inicial que afectara el proceso de
fermentación. Dado que no se realiza proceso de esterilización
de la bebida base, pero no se encontró crecimiento microbiano
contaminante en las placas de Petri.
2.6.2 Comportamiento reológico
Se realizó un análisis al comportamiento reológico de los
productos obtenidos. Para esto se utilizó una prueba de flujo en
un reómetro rotacional (TA Instruments HR-1). Esta prueba se
realizó con una geometría de cilindros concéntricos con un
esfuerzo de corte desde 0.01 a 100 𝑠−1. Se aplicó una corrida
de ida y una de vuelta para observar la histéresis presentada en
la viscosidad.
2.6.3 Estabilidad
Se realizó un análisis de estabilidad a los productos
fermentados en el Analizador Óptico Turbiscan Lab. Para esto
se emplearon 20 mL de producto que fueron sometidos cada 25
segundos, durante 30 minutos, a una fuente de luz infrarroja
con longitud de onda de 880 nm. Esto permitió establecer las
señales de Retrodispersión.
2.6.4 Textura
Las propiedades de textura fueron establecidas a través de un
Texturómetro (TAXT plus). Para esto, se utilizaron muestras
de 50 mL y un cilindro de aluminio de 35 mm encargado de
deformar y vencer las fuerzas de atracción del fluido. Las
pruebas realizadas incluyeron dos esfuerzos y alcanzar una
altura de 45 mm de la base.
2.6.5 Morfología
Se observó la morfología de las bebidas fermentadas con
mayores UFC en un Microscopio Óptico de Barrido (SEM).
Para esto, fue necesario congelar las muestras a -5 °C en el
equipo con el fin de evitar un cambio de fase por el haz de
electrones utilizado para visualizar la morfología. Se utilizaron
resoluciones de 300, 1000 y 2000x.
3. Resultados y discusión
3.1 Leche base
3.1.1 Concentración 8% (w/v)
En la bebida base con concentración de 8% (w/v) se
encontraron diferencias en los valores de pH y densidad entre
la muestra sin tratamientos y las sometidas a tratamientos
térmicos. El valor promedio del blanco fue de 6.86, mientras
que las muestras tratadas resultaron en un valor de pH de 6.95.
En estos valores no se encontró una diferencia significativa
respecto a los tratamientos de alta y baja temperatura.
Análogamente, los valores de densidad de las muestras no
tratadas resultaron en 1001.3 kg/m3. Mientras que en las
muestras tratadas se observó una disminución de la densidad
con valor promedio para ambos tratamientos térmicos de 985.8
kg/m3(p>0.05). Lo anterior, se explica por los cambios en la
composición y estructura de la bebida base a causa de la
desnaturalización de la proteína de la almendra. Según Sathe
[14] [16], la mayor parte de las proteínas de la almendra inician
su desnaturalización a partir de una temperatura de 72 °C. Esto
se comprobó experimentalmente como se demuestra en la
Figura 2.
Figura 2. Bebida base (26 % w/v) después de A) Tratamiento baja
temperatura B) Tratamiento Alta Temperatura.
Pese a la desestabilización de las muestras, se realizó el análisis
de tamaño partícula. La Figura 3 muestra la distribución de
tamaño de partícula obtenida para leche de almendras base con
concentración de 8% (w/v) sometida a los tratamientos
térmicos de alta y baja temperatura.
A
B
5
Figura 3. Relación entre el Tamaño de partícula y la Densidad de las
muestras blanco, con tratamiento de baja y alta temperatura
Como se observa en la Figura 3, la muestra Blanco presenta una
distribución relativamente bimodal. Lo anterior, indica que hay
un porcentaje significativo de partículas grandes y también de
menor tamaño. Estas probablemente estén constituidas por
gotas de grasa y proteínas respectivamente. La aplicación de
tratamientos térmicos implicó un cambio en la distribución del
tamaño de partícula hacia un comportamiento monomodal. Las
partículas más pequeñas aumentaron su tamaño por la
formación de agregados, mientras que no hubo un cambio
significativo en la distribución de las partículas más grandes.
El comportamiento observado coincide con lo encontrado por
Bernat [6], en donde especifica que, el efecto del tratamiento
térmico llevó a la desaparición de las partículas más finas. Esto
probablemente ocurrió debido a la desnaturalización la
proteína, agregaciones de partículas y aumento en el tamaño de
los glóbulos de grasa [17].
En este punto, es útil mencionar que los tratamientos térmicos
se aplicaron con el fin de homogenizar la leche base. Es decir,
obtener una distribución del tamaño de partícula monomodal
con la reducción en el diámetro medio de las partículas más
grandes como los glóbulos de grasa y células vegetales. Sin
embargo, de acuerdo con los resultados obtenidos los
tratamientos térmicos de baja y alta temperatura no reducen el
tamaño de las partículas más grandes y por ende no funcionan
como tratamiento de homogenización. En contraste, permiten
la formación de aglomerados de partículas pequeñas y generan
una separación de fases en las muestras.
Según Bernat y Flores [6] [18], el cambio en la conformación
se contrapone con los tratamientos de presión. Sin embargo, no
es posible aplicar estos tratamientos en el estudio. De acuerdo
con esto, se descartó la implementación de procesos de
homogenización térmicos dado que aumentaban la
inestabilidad de la leche base y desnaturalizaban la proteína
vegetal antes del proceso de fermentación. Es útil resaltar que,
dado que los tratamientos térmicos permitían asegurar la
reducción de microbiota patógena inicial en las muestras, será
necesario calentar las muestras antes de iniciar el proceso de
fermentación a 50°C.
3.1.2 Proceso de fermentación con concentración de
leche base de 8%(w/v)
Las bebidas fermentadas obtenidas
presentaban una separación de
fases considerable como se
observa en la Figura 4. Como se
puede observar se presenta una
sinéresis espontánea a causa de la
conformación de una red inestable.
La sinéresis se define como la
separación de suero, conformado
por proteína soluble, de la red
formada. Esto se presenta por un
tamaño de poros inadecuado en el
gel formado en el proceso de
fermentación [13] [17].
Con el fin de analizar la estabilidad del producto obtenido se
realizó un análisis en el equipo Turbiscan. Los resultados se
presentan en la Figura 5. De acuerdo con lo observado, el gel
formado es altamente inestable. Esto ya que se obtiene
cremación en la muestra dado que hay migración de partículas
o gotas hacia parte superior de la celda. El desplazamiento
señalado se presenta por interferencias dadas en el tamaño de
partícula y viscosidad del medio en que se encuentran.
Figura 5. Retrodispersión de bebida fermentada con concentración
de leche base de 8% (w/v).
En adición, el tiempo de fermentación era 2.5 horas, tiempo
significativamente menor al reportado en literatura (Entre 4 y 8
horas) [6] [7]. Esta diferencia se debe principalmente a una
mezcla inadecuada de las variables que intervienen en el
proceso de fermentación. Entre estas es útil resaltar las que,
además, intervienen en la estabilidad del producto final:
contenido de materia seca y homogenización de leche base,
temperatura de incubación y catalizadores proteicos [13].
Según Lee y Lucey, las soluciones para mejorar la estabilidad
Figura 4. Bebida fermentada
probiótica resultante con
concentración de leche de
almendras base de 8% (w/v).
6
de una bebida fermentada son: usar estabilizadores, como
pectina, gelatina y almidón y/o aumentar la cantidad de materia
seca de la bebida base, especialmente el contenido de proteína.
Lo anterior, con el fin de reducir el efecto del suero.
Por consiguiente, se buscó aumentar el contenido total de
sólidos y por ende aumentar el módulo de almacenamiento G'
del producto base [13]. Es relevante mencionar que, el módulo
de almacenamiento G' representa la parte elástica del
comportamiento viscoelástico, que describe el comportamiento
de la muestra. Para seleccionar el valor de concentración de
leche base es necesario tener en cuenta las restricciones de
composición formuladas por el Codex. En la Tabla 6 se
presentan valores seleccionados.
Tabla 5. Niveles de concentración seleccionados para leche base
Es pertinente resaltar que con esos valores se obtuvieron
tiempos de fermentación entre 4 y 4.5 horas que coinciden con
el rango reportado en literatura [6] [8].
3.1.3 Leche base con niveles de concentración
En la bebida de almendras base no se encontraron diferencias
significativas en los valores de pH ni densidad entre las
muestras de las concentraciones de leche base analizadas. Los
valores promedio fueron de 6.86 y 1001.3 kg/m3 (p> 0.05). La
composición química de la bebida base con las concentraciones
utilizadas se presenta en la Tabla 7.
Tabla 6.Composición (g/100 g) de leche de almendras base
La composición obtenida para la concentración de 8% (w/v) fue
similar a la encontrada por otros autores [7] [19]. Mientras que,
las composiciones de las concentraciones más altas son
significativamente mayores a las reportados para leches de
almendras industrial. Esto se debe a que, estas bebidas tienen
concentraciones menores que las empleadas en el estudio. Sin
embargo, es necesario mencionar que los valores de sacarosa
son mayores a los obtenidos en la literatura después de que en
los estudios se adicionara azúcares. Esto se puede deber a que
como su nombre lo indica el refractómetro emplea la refracción
para cuantificar sacarosa. Pero en esta medición, también se
puede incluir materia seca de otras características que pueden
inferir en los resultados.
Además, como coincide con lo esperado, una mayor
concentración de almendras en la leche base implicó un
aumento considerable en el contenido de proteína y aunque no
se cuantificó, también lo será en el contenido de grasa. Si se
realiza una comparación con la leche de vaca (3,4 g/100 mL de
proteína) las concentraciones más altas tienen un contenido de
grasa y proteína mayor. Sin embargo, contienen fibra vegetal y
cumplen con las restricciones establecidas en el Codex.
3.2 Diseño de experimentos
A partir de los factores y niveles seleccionados, es útil
establecer las muestras a realizar según el diseño de
experimentos. Este corresponde a un diseño factorial completo
32 con réplica.
Tabla 7. Muestras por realizar
3.3 Caracterización de producto fermentado
En la Tabla 9 se observa una reducción en los °Brix y presencia
de acidez después del proceso de fermentación. Esto coincide
con lo esperado dado la transformación de sacarosa a ácido
láctico parte del cultivo inoculado de bacterias ácido-lácticas.
Sin embargo, los resultados de acidez obtenidos son menores a
los establecidos para un yogur estándar (Entre 0,8 y 1 g de ácido
láctico/100 mL) y a lo reglamentado en el Codex para bebidas
fermentadas.
Tabla 8. Resultados de °Brix, acidez y potencial Z de las muestras
fermentadas
En cuanto al potencial Z, es útil resaltar que esta propiedad
permite concluir acerca de la estabilidad de los sistemas
analizados. Cuando el pH corresponde al punto isoeléctrico, las
cargas netas de las proteínas son cero de modo que el potencial
Z será igual a cero. Este punto implica la desnaturalización
completa de la proteína. Sin embargo, valores negativos pueden
Porcentaje de remoción promedio Concentración de leche base (g/mL)
14.4 +/- 0.3 28.5
12.8 +/- 0.2 27.2
10.9 +/- 0.3 26.0
Composición (g/100g) 8.00 26.00 27.20 28.50
Humedad 91.20 73.40 72.20 70.90
Cenizas 0.23 0.72 0.81 0.91
Sacarosa 2.80 1.80 2.10 2.40
Proteínas 1.89 6.58 6.95 7.01
Concentración inicial de leche base (g/100g)
Muestra Volumen de inóculo a
añadir (µL/mL leche )
Concentración inicial de
leche base (g/100 mL)
1 A B
2 A M
3 A A
4 M B
5 M M
6 M A
7 B B
8 B M
9 B A
Muestra °BrixAcidez (g Ácido
láctico/100 mL)Potencial Z
1 1.30 0.27 0.31
2 1.55 0.32 0.21
3 1.70 0.41 0.49
4 1.24 0.32 -0.05
5 1.70 0.27 -0.07
6 1.84 0.32 0.35
7 1.41 0.27 -0.08
8 1.68 0.28 0.30
9 1.78 0.36 -0.07
7
relacionarse con la formación de un gel inestable a causa de la
floculación de partículas. De los resultados obtenidos, se
observa que coinciden en gran parte con la supervivencia del
cultivo, ya que las muestras con valores negativos
corresponden a las muestras con un número menor de UFC al
final del proceso de fermentación.
Adicionalmente, los resultados de los análisis de tamaño de
partícula en términos de los diámetros medios de partículas se
presentan en la Tabla 10. Los diámetros medios de partículas
las muestras fermentadas aumentaron de tamaño. Esto coincide
con lo esperado dado que, la acidificación del sistema permite
la floculación de partículas. Los diámetros medios máximos se
obtuvieron en las Muestras, cuyo potencial Z fue mínimo.
Tabla 9. Resultados de diámetros medios de partículas
3.4 Conteo microbiano
Se realizaron los experimentos de acuerdo con lo arrojado por
Minitab (Anexo 2). Después de incubar los medios de cultivos
sembrados durante 48 horas se realizó el conteo microbiano.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 11. Estos
muestran el número de UFC 107/g de bebida fermentada.
Tabla 10. Resultados conteo microbiano UFC (107)
A partir de los resultados obtenidos se confirma que todas
muestras corresponden a bebidas fermentadas probióticas. Esto
dado que superan la restricción de 107 UFC/g establecida en el
Codex. Además, se observa que la muestra con un número
mayor de UFC obtenida es la Muestra 2. Esta corresponde a los
niveles alto y medio del volumen de inóculo a añadir y la
concentración de leche base respectivamente.
3.4.1 Análisis estadístico
Para el análisis de los datos de conteo microbiano se estableció
un intervalo de confianza del 95%. Los resultados obtenidos se
analizaron en el programa Minitab. Es relevante mencionar que
los resultados indican que el bloqueo respecto a la réplica no es
significativo para el número de UFC obtenidas. De con esto, el
termino mencionado no fue tenido en cuenta.
Sin embargo, con el fin de comprobar si los supuestos del
modelo estadístico se cumplen es necesario analizar los
residuos de las pruebas. En la Figura 6 se presenta el
Histograma de residuos estandarizado. La estandarización se
realizó con el fin de observar de una mejor forma la distribución
de residuos. El Histograma de residuos generales se presenta en
el Anexo 2.
Figura 6. Histograma de residuos estandarizado
En esta figura se observa una distribución normal, centrada en
0 y sin desviación significativa respecto a las colas. Lo anterior
indica que los residuos presentan una distribución simétrica.
De igual forma, la gráfica de probabilidad normal de residuos
se presenta en la Figura 7. En esta se observa que los valores si
se distribuyen normalmente dado que se ubican cercanos a la
línea recta de tendencia. En adición, es útil resaltar que la
prueba de Anderson-Darling arrojo un p-value igual a 0.064,
valor mayor al error establecido. Lo anterior indica que no se
debe rechazar la hipótesis nula que establece la distribución de
residuos uniforme.
Figura 7.Probabilidad normal de residuos
En adición, es necesario evaluar el supuesto de
homocedasticidad que indica varianza constante a lo largo de
las observaciones. De este modo, la relación entre el
comportamiento de valor ajustado respecto al residuo
estandarizado se presenta en la Figura 8.
Muestra D 4,3 (µm) D 3,2 (µm)
No tratada 82.8 3.97
1 106 6.35
2 104 7.57
3 109 8.51
4 113 8.56
5 114 9.01
6 105 7.66
7 115 9.13
8 105 6.34
9 113 8.82
Muestra Experimento Réplica
1 7.29 7.64
2 8.69 8.57
3 7.90 8.02
4 5.15 5.43
5 6.33 6.16
6 5.06 4.91
7 6.67 6.68
8 4.87 5.31
9 4.24 4.61
8
Figura 8. Comportamiento entre el valor ajustado y el residuo
estandarizado
A partir de lo observado en la Figura 8 es posible mencionar
que dado que no hay un comportamiento especifico entre el
valor ajustado y los residuos no se rechaza la hipótesis de
homocedasticidad. El último de los supuesto a evaluar implica
que el orden en que se realizaron las pruebas no influyó en los
resultados obtenidos. Para esto, la Figura 9 describe el
comportamiento entre las observaciones y el residuo
correspondiente.
Figura 9.Comportamiento entre la observación realizada y el
residuo correspondiente
Dado que no se observa ningún patrón comportamiento, la
hipótesis no se rechaza. De todo lo anterior, es posible afirmar
que los resultados del análisis estadístico realizado son
confiables con un nivel de significancia del 95%.
Después de haber comprobado la confiabilidad del estudio
realizado es posible afirmar que el volumen de inóculo añadido
y la concentración de la bebida base son factores significativos
para el número de UFC al final del tiempo de fermentación en
la bebida producto. Lo anterior, indica que variaciones en el
volumen de inóculo añadido y la concentración de leche base
implicarán cambios en la bebida fermentada probiótica en
términos del número de UFC obtenidas. Teniendo en cuenta los
resultados, de las gráficas de efectos e interacción, es posible
afirmar que no hay diferencia notable entre los niveles Medio
y Bajo de ambos factores. Sin embargo, el nivel Alto de la
concentración de leche base implicó una disminución en el
número de UFC, lo opuesto a lo encontrado para el volumen a
añadir (Anexo 2).
3.5 Textura
La dureza y la cohesión dependen de la fuerza requerida sobre
un fluido para deformarlo y su grado de deformación, de modo
que varían respecto a cada muestra. Los resultados obtenidos
para estas propiedades se presentan en la Tabla 12.
Tabla 11. Resultados dureza y cohesión
De los resultados obtenidos, es posible afirmar que la dureza
depende significativamente de la concentración de leche base y
del volumen de inóculo añadido. Esto coincide con lo esperado
dado que, esta propiedad depende de la matriz proteica formada
y de la cantidad de sólidos totales. Mientras que, la cohesión
depende del volumen de inóculo añadido. Lo anterior, indica
que la variación entre los niveles de concentración de leche
base no es significativa para la cohesión del producto
fermentado (p>0.05).
3.6 Estabilidad
Los resultados de Retrodispersión de las Muestras 2, 3, 5 y 7 se
presentan en la Figura 10. La primera muestra corresponde al
número mayor de UFC obtenidas, mientras que las demás
muestras se presentan dado que obtuvieron un comportamiento
diferencial de las demás. De lo observado en la Figura 10, es
posible afirmar que el sistema coloidal formado en todas las
muestras es relativamente estable en el tiempo. Esto dado que
no hay variación significativa en el valor de Retrodispersión
con el paso del tiempo y con la altura de la celda.
Sin embargo, en la Muestra 3 y 5 se observa un incremento en
el tamaño de partícula específicamente fenómenos de
floculación o coalescencia. Esto ocurre principalmente por la
disminución de la fuerza de barrera entre partículas y gotas del
sistema y por su viscosidad. No es posible especificar cuál de
los fenómenos mencionados ocurrió por las limitaciones de la
prueba. Sin embargo, es útil mencionar que ambos fenómenos
implican la aglomeración de gotas o partículas y por ende un
cambio en el tamaño de estas. La diferencia radica en que este
cambio sea reversible o no, la floculación es un fenómeno
reversible con procesos como la agitación de la muestra. Es útil
resaltar que este incremento es más visible en la Muestra 3 que
corresponde a los niveles altos de los dos factores
seleccionados.
Adicionalmente, en la Muestra 7 se observa la migración de
partículas por sedimentación. Este fenómeno implica el
traslado de las partículas suspendidas hacia la parte inferior del
líquido por acción de la gravedad. Esto se debe al tamaño de
partícula y viscosidad del medio. Es relevante mencionar que
esta muestra corresponde a los niveles bajos de los dos factores
seleccionados.
Experimento Réplica Experimento Réplica
1 35.33 35.15 1.08 1.08
2 35.40 35.68 1.08 1.07
3 35.12 35.05 1.08 1.06
4 32.35 32.10 1.05 1.04
5 33.11 32.61 1.05 1.05
6 32.25 32.44 1.05 1.05
7 29.63 30.33 1.06 1.06
8 30.65 30.36 1.07 1.06
9 30.25 30.92 1.04 1.03
Dureza [g] Cohesión [-]Muestra
9
Figura 10. Retro dispersión de A) Muestra 2. B) Muestra 3. C) Muestra 5 D) Muestra 7
A
B
C
D
10
3.7 Comportamiento reológico
A las 9 muestras y sus réplicas se realizó caracterización
reológica a través de una prueba de flujo. Los resultados por
muestras se presentan en la Figura 11. De los resultados
obtenidos, se comprueba el comportamiento pseudoplástico de
la muestra. Esto dado que, la viscosidad disminuye con el
aumento en la velocidad de cizalla. En la Figura 11 se observa
diferencias entre las curvas resultantes de las pruebas de ida y
vuelta para todas las muestras. Esta discrepancia se denomina
histéresis y se presenta por un cambio en la viscosidad inicial
de la muestra. Esto dado que, someter el fluido a un esfuerzo
implica reconstruir y adaptar su estructura un tiempo
específico.
Es relevante mencionar que las muestras 1,3 y 4 son las que
presentan mayores histéresis. De lo anterior, es posible afirmar
que concentraciones menores en la leche base implican una
variante en la viscosidad, es decir la disminución en la proteína
de almendra. En contraste, un volumen de inóculo añadido
mayor resultó en una variación mayor de la viscosidad de la
muestra. Asimismo, los resultados obtenidos para la viscosidad
de las muestras son mayores a los reportados en literatura [7]
[8]. Esto se debe que con el aumento del módulo de
almacenamiento G’, gracias a un número mayor de sólidos
totales, la también se incrementó.
3.8 Morfología
El microscopio óptico de barrido (SEM) permitió observar la
estructura de agregados formados en las bebidas fermentadas.
Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 12. Estos
incluyen el estudio morfológico de las Muestras 1, 2, 3, que
corresponden a las muestras con el número mayor de UFC
resultantes.
De los resultados obtenidos, es posible afirmar que se
generaron agregados en todos los geles (Sistemas coloidales) y
que estos varían morfológicamente para cada muestra. De
modo que, se confirma la formación de una red tridimensional
entre proteínas que permite la contención de ácidos grasos.
Además, se evidencia que los agregados formados en la
Muestra 1 fueron más grandes que los formados en la Muestra
2 y 3, con mayores UFC obtenidas y una concentración de leche
de almendras menor respectivamente. Mientras que, en las
imágenes no se observa una diferencia notable entre las
Muestras 2 y 3. Lo anterior, puede indicar una relación entre la
morfología de las muestras y la concentración de leche base,
que coincide con lo esperado.
A B
C D
11
Figura 11. Prueba de flujo relación entre la Viscosidad (Pa.s) y la taza de cizalla (1/s) A) Muestra 1. B) Muestra 2. C) Muestra 3. D) Muestra
4 E) Muestra 5. F) Muestra 6. G) Muestra 7. H) Muestra 8. I) Muestra 9.
E F
G H
I
12
Figura 12. Microscopia óptica de barrido (SEM) de Muestras 1, 2, 3
4. Conclusiones
En primer lugar, fue posible estandarizar el proceso de
obtención de la leche de almendras base y se comprobó que
los tratamientos de homogeneización térmicos afectaron las
propiedades físicas y la estabilidad de las bebidas base. De
modo que, las emulsiones no fueron estables y se evidenció
la separación de fases y la aglomeración de partículas con la
desnaturalización de la proteína de la almendra.
En segundo lugar, se realizó la estandarización del proceso
de fermentación de bebidas fermentadas, de modo que, se
obtuvo una bebida fermentada probiótica estable a base de
leche de almendras. De los factores que intervienen en el
proceso se seleccionó a la concentración de bebida base (%
w/v) y al volumen de inóculo a añadir como factores del
diseño de experimentos. Esto con el fin de realizar una
comparación entre el comportamiento de los productos con
variaciones en los factores seleccionados. La combinación
de factores de crecimiento que resultó en una mayor
población celular en el producto fermentado fue de 27.2
g/100 mL de leche base y un volumen de 2.0 μL/mL.
De lo anterior, se concluye que los dos factores
seleccionados son significativos para el crecimiento
microbiano identificado como el número de Unidades
Formadoras de Colonias al final de proceso de fermentación.
De igual forma, se estableció que la interacción entre los
factores no es significativa y no se requiere un estudio
posterior.
En tercer lugar, se analizaron propiedades físicas y químicas
de las muestras fermentadas. Los resultados indicaron una
acidez entre 0.27 y 0.41 g/100 mL de ácido láctico.
Adicionalmente, se comprobó el consumo de sacarosa y que
los valores de potencial Z fueron cercanos a 0. También, se
confirmó la formación de una red tridimensional de
agregados de proteína de almendra en respuesta a la
disminución del pH, por la formación de ácido láctico. Los
geles formados fueron estables y permitieron confirmar la
naturaleza pseudoplástica del producto. Sin embargo, deben
estudiarse modificaciones a los factores y niveles
seleccionados y vida útil del producto.
A B C
13
5. Referencias
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