DNA Artwork
Usos de fluorescencia en bioquímica
• Localización subcelular• Cambios en la concentración • Interacciones moleculares• Cambios conformacionales• Distancias intra/intermoleculares• Difusión rotacional • Caracterización estructural• Actividad enzimática
●●●
10-12 s
10-8 s
10-3 s
LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado
Se alcanza el estado excitado por irradiación de luz
FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns
FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms
QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química
FLUORESCENCIA
• 1er. paso: absorción o excitaciónenergía suficiente para llegar a nivel
electrónico superior S1 o S2
λexc
• 2do. paso: emisión de luzenergía radiativa emitida menor que la absorbida, λem > λexcCorrimiento de Stokes
ESTADO EXCITADO
X X*hν
hν’
Relajación por solvente
Transferencia de energía
Quenching
Transferencia de carga
Disociación de H+
Formación de complejos
Formación de oligómerosτ (ns)
Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS
Intensidad resuelta en el tiempo (τ)
Pulso de luzIluminación continua
Parámetros a medir en fluorescencia
• Intensidad de fluorescencia (ISS)
• Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)
• λmax(ex), λmax(em)
• Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)
• Vida media del fluoróforo (τ)
• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)
• Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)
Rendimiento (Q) = fotones emitidosfotones absorbidos
= constante de velocidad de emisión
= constante de velocidad de decaimiento no radiativo
= vida media intrínseca o natural,
sin ningún proceso no radiativo
= vida media medida
Vida media del fluoróforo
La emisión es independiente de λexc
λexc = 370 nm, λem = 480 nmλexc = 340 nm
DENS = 2-Dietilamino-5-naftalensulfonato
1-hidroxipireno-3,6,8-trisulfonato pKa (exc) < pKa (basal)
A pH 1 la especie que absorbe es la protonada pero la especie que emite es otra (la aniónica)
Excepciones: - disociación de protón, especie aniónica fluorescente
Excepciones: - formación de complejo fluorescente
Se forma complejo de transferencia de carga entre antraceno excitado y la dietilamina (exciplex) que emite a mayor λ
Excepciones: - formación de oligómeros fluorescentes
Emisión estructurada igual a la absorción del pireno, a concentraciones bajas (monómero). A concentraciones altas se forman agregados excitados (excimer = excited dimer) que emiten a λmayor
ESPECTROFLUORÍMETRO
ESPECTROFLUORÍMETRO
FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (laser, LED)
MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROSancho de bandapolarizadores
DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT)
MUESTRA geometría de iluminación de la muestra
La medida de IF es relativa a la geometría del equipo
• Fuente con flujo constante de fotones a cualquier λ
•Monocromador deja pasar toda λ con = eficiencia
•PMT detectar fotones de toda λ con = eficiencia
Efecto de filtro interno -
Fluoróforo muy concentrado
Cuantificación del fluoróforomidiendo Intensidad de fluorescencia IF
IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental
IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo
Si Aλ << 1 IA = I0 (2.3 ε c l)
IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l
IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas
λexc = 280 nm
Banda Raman H2O = 311 nmDispersión de excitación
λmax (em) = 360 nm
Usar soluciones diluidas A < 0..05
Control con solo solvente
Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo
Filtrar la solución
Microscopía de fluorescencia