DNA ARRAYS
• Hasta el momento se conocen los genomas completos de 800 organismos, se conocen billones de secuencias
Qué hacen todos esos genes?Cuándo se expresan ? Qué genes no se expresan o se sobrexpresan en una determinada enfermedad? Cómo funciona una droga?
Genómica Funcional: Entendendimiento de los procesos biológicos a través de la identificación de los genes y sus funciones
Técnicas: Arrays de Acidos Nucléicos
Trabajan explotando la habilidad de los RNA o DNA marcados en solución a hibridizar con secuencias complementarias de DNA unidas sobre un soporte sólido en un sitio específico
Los fragmentos de DNA unidos pueden provenir de cDNA, DNA genómico u oligonucleótidos.
“array”
Ubicar en un forma ordenada. Es importante que las secuencias de los genes estén ubicadas de manera fija y ordenada para que se pueda utilizar la ubicación de un spot para identificar una secuencia particular de un gen
Array de DNA: soportes sólidos pequeños en los cuales secuencias de miles de genes diferentes están unidas a lugares fijos.
Macroarray spot mayor de 300 m (se pueden hacer a mano)
Microarray spot menor de 200 m (requieren de robótica)
Términos: DNA microarray, DNA chip, Biochips, Gene chip, genoma chip
Los microarray pueden contener un gran número de genes en una superficie pequeña, pueden contener un genoma completo.
ESQUEMA DE MICROARRAY
PASOS BASICOS
1) Procesamiento del DNA (material a fijar)
2) Fijación DNA a soporte
3) Probes marcados
4) Hibridización
5) Adquisición de Imagen y análisis
TIPOS DE ARRAY:
según tipo de DNA fijado
Forma I: cDNA o DNA genómico de 500 a 5000 bases de largo
Forma II: array de oligonucleótidos (10-50 mer) . Pueden sintetizarse in situ.
SOPORTES:
nitrocelulosa
- MEMBRANAS
(cargadas) nylon
- VIDRIO Slides microscópicos (tratados con polilisina, grupos cargados aminas)
- PLASTICO
Fijación a matriz por cross-linking con UV
DNA A FIJAR EN ARRAY
- Secuencias elegidas de bases como Gene Bank, dbEST, UniGene.
- cDNAs full-length, colecciones de ESTs, o cDNAs de cualquier library de interés
Arrays de: - eucariotas superiores: basados típicamente en EST
- levaduras y procariotas: preparados amplificando DNA genómico con pares específicos de primers.
El material para generar los spots : - Productos de PCR (0.6-2.4 kb) generados a partir de cDNA libraries o colecciones de clones
- Oligonucleótidos (hasta 80 bases)
Pueden sintetizarse directamente unidos al soporte (20-25 bases)
Array slides:
2.5 cm X 7.6 cm
12 pens, cada pen es una grilla con 22 X 22 spots de 200 m de diámetro 5800 spots .
1cm X 1cm 100.000 spots
Ejemplos:
PROBES
Hibridización con probes marcados.
Probes : mPNA de las muestras a testear.
Marcación: Rdioactiva con P 32 o P 33
Fluorescentes Cy3 o Cy5
Métodos de marcación: RT en presencia de nucleótido marcado
P 32 o P 33
HIBRIDIZACIÓN
Cy3 detección por excitación con =Cy5 laser y medición de luz emitida con
microscopio scanning con focal
Nylon Plástico
Vidrio
DATOS
Macroarray
Nylon 22cm X 22 cm
Revelado: 32 P, 33 P
Mouse slide : 8734 clones en = 10.000 spots , 225 u$D
Yeast Genome Array: 6000 , ORF, 225 u$D.
Microarray
glass-slides 2 X 2 cm
1 X 1 cm
7,5 X 2,5 cm
2,5 X 2,5 cm
Revelado: 33 P, Cy3-Cy5
spots: 40.000-80.000 cm2
75 - 120 m
APLICACIONES
1) Monitoreo de la expresión de genes( mRNA abundancia) .
TRANCRIPTOMA dinámico , cambios en respuesta a perturbacioneso durante eventos celulares ( reclinación de DNA , división celular)
2) Enfermedades y expresión génica : determinar genes marcadores deciertos tipos de enfermedades, se determinan genes up -regulados o down-regulados
3)Análisis de genomas completos: Para organismos con genomacompletamente secuenciados (ej . Levaduras) , existen arrays completos. Ejgenes involucrados en maquinaria de iniciación de la transcripción.
4) Expresión y función : Genes con funciones iguales tienen expresión similar,aumentan o disminuyen juntos ante una determinada situación.Clusters de expresión . Levaduras
5)Análisis de Genotipos: Sobre una secuencia determinada de DNA , seanalizan pesencia de mutaciones puntuales.
SNPs ,(2000) han sido seleccionados y se prepararon sets de oligonucleotidospara arrays . Genotyping de HIV
Messenger RNA abundance levels in differentcells, tissues and organisms. a, Human HIV-infected T lymphocytes; b, mouse olfactory epithelium; c, rat brain; d, S. cerevisiaestrain RY136 grown at 25 7C in rich medium.Levels of gene expression were measured using Affymetrixoligonucleotide arrays are represented in the histograms. Data from multiple arrays containing probes for a different subset of genes and ESTs were combined to generate the plots for human (five arrays),mouse (five arrays) and rat (three arrays).
Figure 3 Methods for analysing geneexpression data shown for measurements of expression in the cell cycle of S. cerevisiae. a, Yeast cells were synchronized and cells were collected every ten minutes throughout two complete synchronous cycles (18 timepoints in total are shown). Expression data were collected by hybridizing labelled cDNA samples to high-density oligonucleotide arrays. Transcript levels were determined for almost every gene in the genome for every time point24. A sample of 409 genes (from a total of 6,000) that showed both a significant(more than twofold) fluctuation in transcript levels during the time course and cell cycledependent periodicity were selected for further analysis.