TATIANAMONTOYAGARCÍA
UNIVERSIDADDESEVILLA
FACULTADDEFARMACIA
EFECTO ANTIINFLAMATORIODE LA OLEUROPEÍNA ENCÉLULASSW982
FacultaddeFarmacia
DepartamentodeFarmacología
UniversidaddeSevilla
TrabajoFindeGradoExperimental
GradoenFarmacia
EFECTOANTIINFLAMATORIODELAOLEUROPEÍNAENCÉLULASSW982
Realizadopor:TatianaMontoyaGarcía.
Dirigidopor:CatalinaAlarcóndelaLastraRomero.CatedráticadeFarmacología.
FacultaddeFarmacia,Sevilla.
7dejuliode2016
1
RESUMEN
Introducción: La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica
crónicadeetiologíaautoinmunecaracterizadaporunasinovitiserosivaenlacualeltejidode
granulación de origen sinovial (pannus), invade y erosiona el cartílago y el hueso de las
articulacionesdiartrodiales.Losfibrobalstossinoviales(FS)osinoviocitosdetipofibroblástico
jueganunpapelfundamentalenlapersistenciadelainflamacióncrónicayeneldañoarticular,
siendounasdelaspoblacionescelularesmásabundantesdelpannus.
Laoleuropeína(OLE)esunsecoiridoide,componentefenólicomayoritariodelapulpadelfruto
y hojas de Olea europaea L. y, que a su vez, se encuentra en el aceite de oliva. Se han
documentado diversas actividades farmacológicas del citado secoiridoide, entre las que se
destaca la antioxidante y antiinflamatoria. No obstante no existen, hasta la fecha, estudios
experimentalesenfibroblastoshumanosquevalidensupotencialantirreumático,asícomolos
mecanismosbioquímicosymolecularesimplicados.
Objetivos:EsteestudiopretendeevaluarelefectoantiinflamatoriodeOLEenlalínea
celularSW982 inducidacon IL-1β,medianteelanálisisde laproducciónde laproducciónde
mediadorespro-inflamatorios,asícomo,lasvíasdeseñalizacióninvolucradas.
Materiales ymétodos: LascélulasSW982 fueroncultivadasenDMEMyestimuladas
con IL-1β (5 ng/mL) en presencia o ausencia deOLE (50 y 100 μM). La viabilidad celular se
determinó mediante un ensayo con sulforrodamina B (SRB). Los niveles de TNF-α e IL-6
fueronevaluadosporlatécnicaELISA.LaexpresióndelasproteínasinflamatoriasCOX-2ym-
PGES-1y,estudiodelasvíasdeseñalizacióncelularfueronllevadosacabomedianteWestern
blot.
Resultados:EltratamientoconOLEredujosignificativamentelosnivelesdeIL-6yTNF-
α, y además disminuyó la sobreexpresión de COX-2 y m-PGES-1. Este compuesto a las
concentraciones ensayadas fue capaz, además, de modular la activación de JNK y p38,
impidiendosufosforilación.
Conclusión:OLEreducelaproduccióndecitocinaspro-inflamatorias IL-6yTNF-αy la
expresiónproteícadeCOX-2ym-PGES-1,posiblementea travésde la inhibiciónde lavíade
señalizacióndeMAPK:PJNKyp38,enfibroblastossinovialeshumanosSW982estimuladoscon
IL-1β.
PALABRASCLAVE:Oleuropeína–inflamación–fibroblastosinovial–SW982
2
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓNYANTENCEDENTESDELTEMA……………………..3
§ Oleuropeína
§ Actividadfarmacológicadelaoleuropeína
II. JUSTIFICACIÓNYOBJETIVOS…………………………………………………17
III. METODOLOGÍA…………………………………………………………………….18
§ Oleuropeína:Extracciónycaracterizaciónquímica
§ Cultivocelular
§ Viabilidadcelular
§ Determinacióndecitocinas:IL-6yTNF-α
§ Determinacióndelaexpresiónproteíca
§ Evaluaciónestadísticadelosresultados
IV. RESULTADOS………………………………………………………………………..23
§ Efectosdelaoleuropeínaenlaviabilidadcelular
§ Efectosdelaoleuropeínaenlaproduccióndecitocinaspro-inflamatorias
Interleucina-6 (IL-6) y Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) en células
SW982
§ EfectosdelaoleuropeínasobrelaexpresióndeCiclooxigenasa-2(COX-2)y
ProstaglandinaESintasa1microsomal(m-PGES-1)encélulasSW982
§ Estudiodevíasdeseñalización
V. DISCUSIÓN………………………………………………………………….………28
VI. CONCLUSIONES…......………………………..………………….....…….....30
VII. ABREVIATURASYSIGLAS……………………………………….…………….31
VIII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..32
3
INTRODUCCIÓNYANTECEDENTESDELTEMA
I. OLEUROPEÍNAA. Característicasquímicasydistribuciónenlanaturaleza
Laoleuropeína(OLE)esunglucósidosecoiridoideesterificadoconunalcoholfenilpropanoide.
En concreto esta sustancia esta constituida por la unión de tres moléculas: hidroxitirosol,
glucosayácidoenólico.Químicamente se conoce comounésterdeloleósido-11-metil-éster
(ácidoelenólicoglucosado)conel3,4-dihidroxifeniletanoló3,4-DHPEA(Figura1).
Figura1:Estructuraquímicadelaoleuropeína.
OLEesabundanteenlasfamiliasGentinaceae,Cornaleae,Oleaceae.Enestaúltimafamilia,el
secoiridoidesepuedeencontraryaislardenumerososgéneros,yhasidodescritaenFraxinus
americana L., F. excelsior L., F. chinenis Roxb., (Sanz y cols., 2012) Syringa pubescens
Turcz.(Deng y cols., 2010), S. josikaea J.Jacq. ex Rchb., S. vulgaris L., S. reticulata (Blume)
H.Hara.,(Biycols.,2011),LigustrumlucidumAit.(Guoycols.,2011),L.vulgareL.,L.ovalifolim
Hassk.,Philyrea latifoliaL.,entreotras(Soler-Rivas,2000).Sinembargo, lamáscomúnmente
conocidaeslaOleaeuropaeaL.(quedanombrealglicósido),siendoelcomponentefenólico
mayoritariodelapulpadelasaceitunasverdes,aunquetambiénlashojasdelolivocontienen
OLE como componente principal; asimismo, se puede encontrar en el aceite de oliva virgen
extra(AOVE),alquedasusaboramargo.
La rutadelácidomevalónicoes la responsablede la síntesisde los secoiridoides oleósidos
comoOLE.Estasrutasmetabólicassoncomplejasysepuedenverseafectadaspornumerosas
variables tales como la variedad del fruto, las condiciones del crecimiento y el estrés
ambiental,entreotros(Ryanycols.,2002).
4
B. Variaciones cuali y cuantitativas en el contenido de oleuropeína en Olea
europaeaL.
Se han usado diversos métodos para analizar la presencia cualitativa y cuantitativa de
compuestosfenólicosysecoiridoides:desdetécnicassimplescomocromatografíadecapafina
(CCF),cromatografíaliquidadealtaeficacia(HPLC),cromatografíademasas-espectrometriade
masas (GC-MS) y electroforesis capilar (CE); y métodos sofisticados como Full Automatic
ModellingSystem(FAMS)otetrametilsilanoNMR,ionizaciónporelectrospray-espectroscopía
demasa(ESI-MS/MS)(Omar,2010).
El contenido de OLE varía según el origen, condiciones de cosecha, condiciones
meteorológicas, grado de humedad, sistema de procesado (secado y extracción), grado de
contaminacióndel suelo (Ahmad-Qasemycols.,2013),entreotros.Apesardeello,esen la
hoja donde este componente alcanza unmayor contenido que varía de 1% a 14%, frente a
0.005%y0.12%quepuedepresentarseenelaceitedeoliva(Tabla1).
Tabla1:Contenidodeoleuropeínaendiferentespartesdelolivo(Barbaroycols.,2014).
PartedelolivoContenidodeOleuropeínaReferencia
Hojas93-134mg/g(PS)Charoenpraserty
Mitchell,2012
6.1-13.3mg/g(PS)Savourninycols.,2001
5.6-9.2mg/g(PS)Ansariycols.,2011
34.0-38.1mg/g(PF)Tayoubycols.,2012
60-90mg/g(PS)MalikyBradford,2006
2.1-24.8mg/g(PS)Omar,2010
Ramas11-14g/kg(PS)AltinyayyAltum,2006
18.9g/kg(PS)Japón-Lujany
LuquedeCastro,2007
Raíces1.9-6.0g/kg(PS)Ortega-GarcíayPeragón,2010
Capullos15.7-58.4mg/g(PF)MalikyBradford,2006
Flores15.3-20.9mg/g(PF)MalikyBradford,2006
Aceitunas(fruto)2.5-8.9mg/g(PF)Ranalliycols.,2006
0.6-1.1mg/g(PS)Ansariycols.,2011
13.6-50.8mg/g(PF)MalikyBradford,2006
0.4-21.7mg/g(PS)Omar,2010
5
1.3-5.8mg/g(PF)Bouazizycols.,2010
0.3-3.5mg/g(PF)Estiycols.,1998
Aceitunasdemesa0.0-0.1mg/g(PS)Omar,2010
0.0-0-5mg/g(PF)Zoidouycols.,2010
Aceitedeolivavirgen0.0-11.2mg/kgPerriycols.,1999
0.0-4.7mg/kgCaponioycols.,1999
2.0mg/kgTruckyHayball,2002
3.8mg/kgTuberosoycols.,2007
AceitedeolivaSedesconoceVisioliyGalli,2000
Pulpadelaaceituna0.4mg/g(PS)Kanakisycols.,2013
Aguaresidualdela6.5mg/g(PS)Goldsmithycols.,2014
moliendadelaaceitunaSedesconoceAlloucheycols.,2004
PS:Pesoseco/PF:Pesofresco
ElhechodequeOLEseamásabundanteencantidadenlashojasyfrutosjóvenes,esdebidoa
reaccionesquímicasyenzimáticasquetienen lugaren laplantadurante lamaduraciónde la
aceituna (De laTorre-Carbotycols.,2005).En la formacióndel frutodelolivo, sedistinguen
tresfases:unafasedecrecimiento,enlaqueseacumulaOLE;unafasedemaduraciónverde,
quecoincideconunareducciónenelniveldeclorofilayOLE;yunafasedemaduraciónnegra,
que se caracteriza por la aparición de antocianinas y durante la cual OLE continúa
disminuyendo.Así,el secoiridoideesmuyabundanteenestadostempranos;aunquemenor,
su nivel continúa siendo importante en la cosecha de cultivos verdes selectos. En cultivos
negros,esteniveldesciende rápidamentedurante lamaduración, llegando inclusoaceroen
algunasvariedadescuandoelfrutoestacompletamentenegro(Omar,2010).
Las enzimas endógenas hidrolíticas, principalmente las glucosidasas, entre ellas, la β-
glucosidasa, pueden activarse durante procesos de molienda o maceración en extractos
acuosos y catalizar la hidrólisis de los fenoles comoOLE con la consiguiente producción del
aglicón,quese isomeriza rápidamentea travésde la formaenólicaadialdéhido (Fernandez-
Bolañosycols.,2002)(Figura2).
6
Figura2.Hidrólisisydegradaciónparcialdeoleuropeínaenhojasdelolivo.
C. Biosíntesis
ElprincipalprecursordelasíntesisdeOLEeselácidomevalónicocomosehacomentado,que
es el substrato para la síntesis del oleósido 11-metil-ester (ácido elenólico glucosado). El
primerpasoqueocurreenlarutabiosintéticaeslacatalizaciónporgeraniolsintasa(GES),yla
conversióndelgeraniola10-hidroxigeraniolporlaenzimageraniol10-hidroxilasa(GE10H).La
actividadbioquímicadelNADHdeshidrogenasa(NDHI)sobreel10-hidroxigeranioldapasoal
aglicón ácido deoxilogánico (Alagna y cols., 2012). La transferencia de grupos glucosílo al
aglicón ácido deoxilogánico para la formación de ácido deoxilogánico (precursor de varios
monoterpenos alcaloides indólicos yOLE) es catalizadapor glucosiltransferasa (GT). El ácido
deoxilogánicoexperimentauna7-α-hidroxilacióndelanillociclopentano,formandoelácido7-
epilogánico(Obiedycols.,2007),elcualrápidamentepasaaácido7-cetologánicomediantela
oxidacióndelgrupohidroxiloporNHDI.Lametilacióndeesteácidoescatalizadaporlaácido
logánicometiltransferasa(ALMT),dandolugarala7-cetologanina.Enestepunto,laexpresión
constitutivadesecologaninasintasa(SLS)oxidaelgrupocetónico,yseformaeléster11-metil
oleósido,elcualesinmediatamenteglicosiladoa7-β-1-D-glucopiranosil-11-metiloleósidopor
la GT. Este último componente experimenta una reacción de esterificación con tirosol que
7
formaelligustrósido,yfinalmente,OLEseformaporhidroxilación(Alagnaetal.,2012)(Figura
3).
Figura3:Esquemadelarutabiosintéticadelaoleuropeína.
D. Metabolismoybiodisponibilidad
Loscompuestosfenólicoshandemostradoseraltamentebiodisponibles.Laadministracióndel
aglicónOLE presenta un 55-60%de absorción en humanos (Vissers y cols., 2002). Además,
8
otros estudios han demostrado que OLE se absorbe rápidamente en el intestino delgado y
colon tras su administraciónoral, alcanzando sumáxima concentraciónplasmática a las dos
horas de la administración (Katsoulieris, 2016). Sin embargo, el mecanismo por el cual se
absorbepermaneceaúndesconocido.
Se distribuye rápidamente en sangre, unido a lipoproteínas humanas; y se excreta en orina
principalmentecomoglucurónidoo,enmenorconcentración,comoforma libre (Tanycols.,
2003)(Boccioycols.,2003).
Asuvezsehademostradoqueun15%deOLEglicosiladaadministradaenhumanossanosse
excretaenorinacomohidroxitirosol,principalmetabolito,ytirosol(Vissersycols.,2002).
II. ACTIVIDADFARMACOLÓGICADELAOLEUROPEÍNA
Muchos estudios in vitro e in vivo han documentado numerosas e importantes actividades
farmacológicas de OLE como la antioxidante, antidiabética, antimicrobiana, antivírica,
antitumoral, hepatoprotectora, cardioprotectora, neuroprotectora, antienvejecimiento y
antiinflamatoria(Carrera-Gonzálezycols.,2013;FuentesyPalomo,2014;Rubióycols.,2014;
Sepportaycols.,2014).
A. Actividadantioxidante
Una de las propiedades deOLE demayor interés es su potente actividad antioxidante ante
radicales libres (Cicerale y cols., 2012), la cual fue atribuida a su habilidad para donar
electrones,estabilizandoestosradicaleslibres(Leeycols.,2009;Visioliycols.,2000).Tantosu
capacidadparaeliminarradicaleslibrescomosuactividadquelantesobremetales,parecenser
lasresponsablesdelahabilidadprotectoradelasmembranasfrentealaperoxidaciónlipídica.
Esta hipótesis es apoyada por Czerwisńka y cols. (2012), quienes publicaron que este
secoiridoidesuprimelaproduccióndeespeciesreactivasdeoxígeno(ERO)(aniónsuperóxido,
peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso) y especies reactivas de nitrógeno (ERN) (óxido
nítrico,peroxinitrito)ensistemascelulares invitro.También,elexperimentodeČabarkapay
cols. (2014) y Kyriakopoulou y cols. (2012), en leucocitos periféricos humanos y células de
carcinoma hepatocelular (HepG2) con daño en el ADN inducido con H2O2, confirma esta
actividaddeOLE.
9
Invivo, utilizandoconejosdiabéticos inducidosporaloxano (Al-AzzawieyAlhamdani,2006),
ratas alimentadas condietas ricas en colesterol (Jemai y cols., 2008)y en ratas expuestas a
arsénico (Kotyzová y cols., 2011),OLE fue capazde inducir un incremento en los niveles y
actividaddeenzimasantioxidantescomolasuperóxidodismutasa(SOD),glutationperoxidasa
(GPx), glutation reductasa (GRx), catalasa (CAT), yunaumentodelniveldeantioxidantesno
enzimáticoscomoelglutation(GHS),α-tocoferol,β-carotenoyácidoascórbico.
B. Actividadantidiabética
En los 90, González y cols., usando un modelo animal de diabetes mellitus inducida con
aloxano,postularonporprimeravezelpapelprotectorehipoglucemiantedeOLEextraídade
hojasdelolivo(Gonzalezycols.,1992).
Estudiosposterioresmostraronunaevidenteunióndelaacciónantidiabéticaconlosefectos
antioxidantesdel secoiridoide.El tratamiento conOLEde conejos condiabetes inducidapor
aloxano, mostró efectos hipoglucemiantes significativos comparados con los animales
diabéticos control, asociados con el restablecimiento de los niveles de malondialdehído
(subproductoderivadodelmetabolismodelípidos)ysobretodo,deantioxidantesendógenos
enzimáticosynoenzimáticos(Al-AzzawieyAlhamdani,2006).
C. Actividadantimicrobianayantivírica
OLE hamostradouna gran actividad antimicrobiana frente bacteriasGrampositivas yGram
negativas, como Lactobacillus plantarum, Bacillus cereus y Salmonella enteritidis (Cicerale y
cols.,2012).Además,estudiosinvitromostraronactividadcontramicoplasmas,inclusofrente
alasqueeranresistentesatratamientosantibióticos(Furneriycols.,2002).
Estaspropiedadespodríansugerirelusodelcompuestofenólicocomounaditivoalimentarioy
como tratamiento en infecciones humanas del tracto digestivo o respiratorio (Bisignano y
cols.,1999).
Su actividad se debe al daño sobre la membrana bacteriana y/o la desorganización de los
péptidoglucanos(Caturlaycols.,2005).Sinembargo,elmecanismomolecularporelqueactúa
sedesconoce.Entrelosposiblesprocedimientossebarajalainterferenciaenlaproducciónde
ciertosaminoácidosnecesariosparaelcrecimiento;o,laestimulacióndirectadelafagocitosis
10
como respuestadel sistema inmune frentea todo tipodemicroorganismos (Saija yUccella,
2001).
En cuanto a la actividad antiviral, se ha demostrado su eficacia sobre células de carcinoma
hepatocelular (HepG2 2.2.15) infectadas frente septicemia hemorrágica viral (Micol y cols.,
2005);virusdelahepatitisB(VHB)(Zhaoycols.,2009)yvirusdeinmunodeficienciahumana
(VIH)(Lee-Huangycols.,2007).Enestecasosumecanismodeacciónsebasaenlainhibición
delaintegrasavíricayalteracióndelaenvolturavírica.
D. Actividadantitumoral
Varios estudios han confirmado la actividad anticancerosa/antitumoral de OLE y han
dilucidadolosposiblesmecanismosenlaúltimadécada.HamdiyCastellonhanvalidado,tanto
en estudios in vivo e in vitro, que el secoiridoide inhibe el crecimiento celular, movilidad
celular,capacidaddeinvasióneinduceunefectoproapoptóticoenlíneascelularescancerosascomoglioblastoma(LN-18),eritroleucemia(TF-1a),célulasdeadenocarcinomarenal (786-O),
carcinomametastásicodederramepleural (T-47D), adenocarcinomade glándulamamariao
derrame pleural (MCF-7), melanoma maligno de piel o nodo linfático (RPMI-7951) y
adenocarcinoma colorectal o región metastásica supraclavicular (LoVo) (Hamdi y Castellon,
2005).
Enbaseaesto,estudiosexperimentalesenanimaleshandeterminadoqueeltratamientocon
OLE previene el desarrollo de cáncer de piel (Kimura y Sumiyoshi, 2009), tejidos blandos
(HamdiyCastellon,2005)ycáncerdepulmón(Sepportaycols.,2014).
Además de actuar directamente sobre el tumor, OLE puede desempeñar una función
antiangiogénica, inhibiendo laproliferacióndelendotelio,produciendoasíunareduccióndel
númerodevasossanguíneos.Estofuedemostradoporestudiosenmembranacorioalantoidea
depolloyenmodelosderatón(Hamdiycols.,2003).
Portodoesto,HamdiyCastellonserefierenestesecoiridoidecomounanuevaclasedeagente
anticanceroso,queactúaen laprogresióndel tumor,activa sistemasreparadoresdeADNe
inhibedelaangiogénesis.
11
E. Actividadhepatoprotectora
Se ha observado en diversos estudios un efecto hepatoprotector, demostrando que el
tratamiento con OLE disminuye significativamente las transaminasas en plasma,
especialmente la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en
ratones intoxicados con tetracloruro de carbono. Estos resultados se asocian con una clara
regresióndeáreasnecróticasyunmarcadoaumentodelaactividadSODylaconcentraciónde
GHS.LainmunoquímicatambiénrevelóqueOLEatenúadeformadosis-dependienteERO/ERN
ysuprimelainflamación(Domitrovic´ycols.,2012)(Kimycols.,2014).
Además,enhígadoderata tratadoconhidroxitoluenobutilado,el secoiridoide fuecapazde
reducir losnivelesdeureanitrogenadaensangre, transaminasaglutámicopirúvicaensuero
(sGPT), transaminasa glutámico oxalacética (GOT), fosfatasa alcalina (FA), lactato
deshidrogenasa (LDH), triacilglicéridos (TG) y creatinina (Lin y cols., 2007); además de
minimizarlageneracióndefibrosisynecrosis(Fangycols.,2008)(Kimycols.,2014).
Portanto,estosestudiosvalidanelpotencialhepatoprotectordeOLE,proponiéndolacomoun
nuevoagenteseguroyprotectoraestenivel(Hassenycols.,2015).
F. Actividadcardioprotectora
La actividad cardioprotectora de OLE en modelos de experimentación in vivo ha sido
demostrada en diversos estudios. En ratas con cardiotoxicidad aguda inducida por
doxorrubicina (DXR), se realizaron inyecciones intravenosas de OLE, produciéndose un
descensoenelniveldecreatinquinasa(CK),creatinquinasa-MB(CK-MB),LDH,ASTyALT.Asu
vez,lainmunoquimicarevelóunareducciónenelcontenidodecarbonilos,nitrotirosinas,iNOS
y peroxidación lipídica en tejido miocárdico; y en histopatología, la reducción de la
vascularización citoplasmática en cardiomiocitos reveló su efecto protector frente a la
cardiotoxicidadinducidaporDXR(Andreadouycols.,2007).
Elpretratamientoconelcompuestofenólicoenratonesconinfartoagudodemiocardio(IAM),
mostró un efecto protector frente al IAM, previniendo el desarrollo de un fallo cardiaco
secundario al mismo, al descenso en los niveles séricos de CK-MB, troponina I, LDH
(Janahmadiycols.,2014).
12
G. Actividadneuroprotectora
Tanto OLE como los polifenoles del olivo exhiben un efecto neuroprotector significativo en
modelos experimentales y sugiriéndose una nueva estrategia terapéutica potencial en
enfermedadesneurodegenerativascomoParkinsonyAlzheimer.
En un ensayo en ratas OLE mostró un número mayor de neuronas en la sustancia negra,
respecto a las ratas sin tratar. De hecho, las investigaciones con GC-MS describieron al
secoiridoide como una molécula de unión no covalente al péptido β-amieloide (1-40),
contrarrestando la producción y generación de la placa amieloide (Bazoti y cols., 2006). En
adición,elsecoiridoidefuecapazdeinhibir laproteínaTau,queformaagregadosamieloides
característicos del Alzheimer, en ratones (Daccache y cols., 2011).Estos resultados avalan a
esta molécula como una novedosa diana farmacológica en la prevención o atenuación del
dañoopérdidadeneuronasdopaminérgicasenpatologíasneurodegenerativas.
H. Actividadantienvejecimiento
LosFSsufrenlasenescenciaporla influenciadefactoresgenéticosyambientales.Lafunción
fisiológicadelproteosoma,unaproteasanoliposomalmulticatalítica,sedeterioraconelpaso
del tiempo, de formamás acentuada en fibroblastos durante la senescencia. Katsiki y cols.,
demostraronqueOLEmejoralaactividaddelosproteosomasinvitro,deformamáseficazque
otros quimioactivadores conocidos, posiblementemediante cambios en la conformación de
éstos. Además, el tratamiento continuo de fibroblastos embrionarios en fase temprana con
OLE,disminuyólosnivelesintracelularesdeERO,reduciendolacantidaddeproteínasoxidadas
mediante el incremento de la tasa de degradación mediada por proteosomas y,
manteniéndose la función del proteosoma durante la senescencia replicativa. De forma
importante,loscultivoscelularestratadosconOLEexhibieronunademoraenlaapariciónde
la senescencia, y su tiempo de vida se extendió aproximadamente un 15% (Katsiki y cols.,
2007).
I. Actividadantiinflamatoria
Lainflamaciónesunarespuestafundamentalinducidaporelsistemainmuneparaprotegerel
organismocontrapatógenos,dañotisularyestrés.
Unaampliavariedaddeestudioshandemostradolaevidenciadelacontribucióndecitocinas
enlainflamaciónyeltejidodañado.Lascitocinaspro-inflamatoriascomoIL-6,IL-1βyelfactor
13
denecrosistumoralα(TNF-α)seactivanporvíasdeseñalizaciónimplicadasenlainflamación,
entrelasqueseincluyenlosfactoresnuclearesdetranscripciónNF-kBylasproteínascinasas
activadas por mitógenos (MAPK): c-Jun NH2 –terminal cinasa (JNK), p38 cinasa y cinasa
reguladapor señalextracelular (ERK), fundamentalmente (Aupperley cols.,2001;McInnesy
Schett,2011).
ElfactordetranscripciónNF-ĸBjuegaunpapelfundamentalenlafunciónbiológicay
en lapatogeniadedesórdenes inflamatoriosyautoinmunes (Suny cols.,2013). Esun factor
transcripcional regulador de la expresión de numerosos genes que codifican moléculas
involucradasenelprocesoinflamatorio,entrelosquepodemosincluírciclooxigenasa-2(COX-
2),óxidonítrico sintasa inducible (iNOS),protaglandinaE sintasa-1microsomal (m-PGES-1) y
ciertascitocinasproinflamatoriasentrelascualesse incluyenTNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17eIL-23
(Cho,2006;Neurathycols.,1998).
ElNF-κβestáreguladopor lavíade lasMAPK,queensuestado inactivo(nofosforilado)
residen en el citoplasma, pero cuando se activan son fosforiladas y a su vez fosforilan en
serinasytreoninasalosfactoresdetranscripción.Estosúltimospromuevenlatranscripciónde
genes responsables de la activación de las células inflamatorias e inmunocompetentes y la
expresióndeproteínasmediadorasclaveconelconsiguienteefectobiológico (Ghoshycols.,
2003).
La víade lasMAPKparece jugarunpapel importanteenel controlde la inflamación (Weiy
Feng, 2010). Las vías de la cinasa N- terminal p38 y JNK se activan por el estrés celular
(Kyriakis y Avruch, 2001). La MAPK p38 también está involucrada en el control post-
transcripcional de la expresión génica mediante la estabilización de los ARN mensajeros
(ARNm). De igual manera, se ha descrito que puede regular la producción de citocinas en
respuestaaunavariedaddeestímulosy lasobreexpresióndeCOX-2 (Hommesycols.,2002)
(Figura4).
El efectoantiinflamatoriodeOLEestamediadopor su capacidadde inhibir la actividadpro-
inflamatoriadeEROlibresproducidasporenzimas,comolaCOX-2eiNOSymodulardiferentes
víasdeseñalización:inhibicióndelNF-kβysutranslocaciónalnúcleo,IL-1β,MAPK,mediante
laalteracióndelosprocesosredoxencélulasinmunessensibles(Cárdenoycols.,2013).
14
Figura4:Esquemadelmecanismoantiinflamatoriodecompuestosfenólicos(Cárdenoycols.,
2013).
A continuación, se incluyen los estudios in vitro e in vivo más significativos que avalan la
actividadantiinflamatoriadeOLE.
o EstudiosinvitroconOLE
Dell’Agliycols.,investigaronelefectodelaglicónOLE,extraídodeaceitedeolivavirgenextra
(AOVE), en la expresión demetaloproteasas de lamatriz-9 (MMP-9) en células de leucemia
agudamonocítica(THP-1),elcualprevienelaestimulacióndelaexpresióndedichaenzimaen
célulasTHP-1estimuladasconTNF-α,debidoalaalteraciónenlaseñalizacióndeNF-kB.Esto
evidencióelmecanismoporelqueelAOVEreducía la inflamaciónasociadaaenfermedades
(Dell’Agliycols.,2010).
Otrosestudios,en la líneacelularRAW-264.7(macórgafosmonocíticos inducidosporelvirus
de leucemia murina de Abselon), estimulada con lipopolisacáridos (LPS) pusieron de
manifiesto que el compuesto fenólico inhibe la producción de citocinas pro-inflamatorias
como la IL-1β e IL-6 y la generación de óxido nítrico (NO), mediante la supresión de la
expresión de enzimas pro-inflamatorias, iNOS y COX-2. Así mismo,se observó una
disminucuióndelaactivacióndelasMAPK(ERK1/2yJNK),lascualesseasocianalprocesode
inflamación(Ryuycols.,2015).
MembranePhospholipids
Araquidonic Acid
PGG2
PGH2
PGD2,PGE2,PGF2,PGI2
(TxA2)TxB2
PGsynthases TXsynthase
PLA2
COX-2
OLIVEOILPOLYPHENOLS
MMP-9
NF-ƘB
IƘBα
p65 p50
NF-ƘB
STAT-1p
STAT-1
STAT-1p
STAT-1p
STAT-1
p
MAPKsp38,JNK,ERK
iNOSNO
Pro-inflammatorycytokines
Transcriptionoftargetgenes
15
Además, se demostró que OLE reducía el efecto de lamieloperoxidasa (MPO) (enzima que
cataliza la formacióndeácidohipocloroso)enneutrófiloshumanosde formaconcentración-
dependiente(Czerwisńkaycols.,2012).
o EstudiosinvivoconOLE
LaeficaciadeOLEenmodelosinvivodeinflamaciónhasidoprobadacongranextensión.Este
secoiridoidetambiénhamostradounosbuenosbeneficiospreventivosanivelgastrointestinal,
enelmodelodeúlceragástrica inducidaconetanol,disminuyendoel índicedeulceracióne
incrementando la actividadde enzimas con actividad antioxidante en ratas, el contenidode
GHS,SODyCATentejidogástrico(Alirezaeiycols.,2012).
Delamismaforma,sehareportadoqueOLEatenúalaextensiónyseveridadencolitisaguda
inducidaconDSSalavezquereducelainfiltracióndeneutrófilos,laproduccióndeNO,IL-1β,
IL-6yTNF-α,losnivelesexpresióngénicadeproteínaiNOS,COX-2,MMP-9ylatranslocaciónal
núcleosubunidadp65deNF-kBentejidodecolón(Ginerycols.,2011,2013).
Sonconocidos losefectosantiinflamatoriosdelaglicónOLEen ratonesconartritis colágeno-
inducida (CIA). Por ejemplo, el aglicón OLE atenúa el desarrollo de la artritis causada por
inyección de colágeno tipo II en ratones, mejorando el estado histológico tanto en la
articulacióncomoenlapata,elgradodedañooxidativoynitrosativoylosnivelesplasmáticos
decitocinaspro-inflamatorias(Impellizzeriycols.,2011).Asimismo,eltratamientoconaglicón
OLE disminuyó significativamente el daño histológico, la producción de citocinas pro-
inflamatorias(TNF-αeIL-1β), laexpresióndeiNOs,lainfiltracióndeneutrófilos, laformación
denitrotirosinaylosnivelesdefactorneurotróficoderivadodecélulasgliales(GDNF),através
delainhibicióndelavíadeseñalizaciónNF-kBeimpidiendoladegradacióndelaproteína
inhibitoria IKB-α. Del mismo modo, el aglicón OLE fue capaz de reducir actividad de la
proteinquinasaA(PKA),yestimulólaapoptosis,enelmismomodeloexperimentalenratones
(Impellizzeriycols.,2012)(Tabla2).
16
Tabla2:Estudiosinvivoeinvitrodelaactividadantiinflamatoriadelaoleuropeína.
Referencia Polifenol Métododeexperimentación
Mecanismosdeacción Dosisusadas
InVitro
Dell’Agliy
cols.,2010
AglicónOLE
CélulasTHP-1TNF-α
estimuladas
InhibicióndelaexpresiónanómaladeMMP-9
mediantelaseñalNF-kB
2.5-50μM
Ryuycols.,
2015
OLE
RAW264.7LPSestimuladas
SupresióndelaproduccióndeiNOS,COX-2,IL-1β,IL-6
yMAPK
100,200,300μM
Czerwisńkaycols.,2012
OLE Neutrófiloshumanos
ReduccióndeMPO 5-50μM
InVivo
Alirezaeiy
cols.,2012
OLE
Úlceragástricainducidaconetanolenratas
Elevacióndelaactividaddeenzimasantioxidantes,aumentodelíndicedeúlcerasinhibidas,el
contenidodeGSH,SODyCATeneltejidogástrico
12y18mg/kg
Ginerycols.,
2011
OLE
Colitisaguda
inducidaconDSS
Reduccióndelainfiltracióndeneutrófilos,la
produccióndeNO,IL-1β,IL-6,yTNF-α;laexpresióndeiNOS,COX-2,yMMP-9;ylatranslocaciónalnúcleodelasubunidadp65NF-kB
2%OLendieta
Impellizzeriy
cols.,2011
Impellizzeriy
cols.2012
AgliconOLE
Enfermedaddelamédulaespinal
enratónArtritis(colágenotipoII)enratón
Disminucióndeldañohistológicamente,TNF-αeIL-1β,iNOS,inlfiltracióndeneutrófilos,peroxidaciónlipídica,nitrotirosina,
formacióndePKA,nivelesdeGDNF,inhibicióndela
expresióndeNF-kB,degradacióndeIkB-αeinduccióndeapoptosis
20,40,100μg/kg
17
JUSTIFICACIÓNYOBJETIVOS
SegúnlaOrganizaciónMundialdelaSalud,lasenfermedadesreumáticassonunadelascausas
más frecuentes de incapacidad en elmundo. En España estas patologías están relacionadas
con el 50,7% de las incapacidades laborales y son la principal causa de bajas laborales
permanentes.EspecialrelevanciatienelaAR,porsusrepercusionessobrelacalidaddevidade
lospacientesyeldeterioroprogresivoqueproduceestaenfermedad.
AR es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y sistémica que se caracteriza por
unasinovitiserosivasimétrica,enlacualeltejidodegranulacióndeorigensinovial(pannus),
invadeyerosionaelcartílagoyelhuesode lasarticulacionesdiartrodiales. LosFS jueganun
papelfundamentalenlapersistenciadelainflamacióncrónicayeneldañoarticular,siendo
unas de las poblaciones celulares más abundantes en el pannus. Actúan directamente
degradando lamatriz del cartílago, e indirectamente sobre el hueso como inductores de la
diferenciaciónyactivacióndelososteoclastos(Fauci,2010).
El abordaje terapéutico de la AR es multidisciplinar, dirigida a la supresión inespecífica del
proceso inflamatorio, con el objetivo de mitigar los síntomas y signos de la enfermedad,
englobandotratamientofisioterápicoyfarmacológico.Noobstante,dadolaslimitacionesen
eficaciayseguridaddelafarmacoterapiaactualantirreumática,sehageneradoenlosúltimos
años, un auge en el uso de otras estrategias terapéuticas, entre las que destaca la terapia
nutricionalyelusodenutracéuticos(Fauci,2010).
Recientemente nuestro grupo de investigación ha puesto de manifiesto el potencial
antirreumáticodelAOVE,basedenuestradietamediterránea,desufracciónpolifenólicayde
un unodesus fenolesderivadodelhidroxitirosol (acetatodehidroxitirosol) (Rosilloycols.,
2014,2015,2016) enunmodelo invivodeartritis inducidaporcolágenoenratonesDBA/1.
Noobstante,noexistenhasta la fecha,estudiosexperimentales in vitroencélulashumanas
quevalidenelpotencialantirreumáticodelossecoiridoides,yenparticulardeOLEasícomo
losmecanismosbioquímicosymolecularesimplicados.
En base a la actividad antiinflamatoria de OLE puesta de manifiesto en modelos
experimentales in vitro e in vivo, se plantea llevar a cabo un desarrollo experimental cuyo
objetivoprincipalesllegaralconocimientodelfuncionalismodeestesecoiridoideenunalínea
celular validada para el estudio de la AR de FS humanos (SW982) y dilucidar los posibles
mecanismosmoleculares,asícomo,lasvíasdeseñalizacióninvolucradas.
18
METODOLOGÍA1. Oleuropeína:Extracciónycaracterizaciónquímica
Para la extracción de OLE a partir de hojas de olivo, se siguió el método descrito por
(Stamatopoulos y cols., 2014). Posteriormente, el extracto se concentró a sequedad y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Diclorometano-
metanol 10:1--->5:1) obteniéndose OLE como un sólido débilmente amarillo que fue
analiazadoposteriormenteporRMNdealtaresolución(ServiciosGeneralesdelaUniversidad
deSevilla,Citius,quecuentaconequiposBrukerAdvanceIII500y700MHz).
2. Cultivocelular
La línea celular de FS humanos SW982 se obtuvo de American Tissue Culture Collection
(ATTC®,NumberHTB-93(Manassas,VA,EE.UU.)).LascélulasSW982secultivaronenflasksT-
150(NuncTM,Barcelona,España),conDulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)con2mM
deL-glutamina,suerofetalbovinoal10%(SFB)ypenicilina-estreptomicinaal1%,a37ºCy5%
CO2.
3. Viabilidadcelular
Lascélulasfueronsembradasenplacasde96pocillos(1x105células/pocillo)eincubadasen
presenciaoausenciadeOLEdurante24h.Transcurridoestetiempodeexposición,elefecto
delcompuestoenlaviabilidadcelularfueanalizadomedianteelensayodelasulforrodaminaB
(SRB) (Skehan y cols., 1990). Después del periodo de incubación, las células adherentes del
cultivo fueron fijadas a la placa, añadiendo 50 mL de ácido tricloroacético (50% p/v) frío
(Sigma-Aldrich®,Madrid,España)e incubadasdurante60minutosa4ºC.El sobrenadantese
descartó,ylasplacasselavaroncincovecesconaguadestiladaysesecaronalaire.Seañadióa
cada pocillo 50 µL de solución SRB (Sigma-Aldrich®, Madrid, España) (0.4% p/v) en ácido
acético al 1% (Panreac®, Barcelona, España) y se incubó durante 30minutos a temperatura
ambiente. Se eliminó la solución SRB de las placas y posteriormente, fueron lavadas cinco
vecesconácidoacéticoal1%.Seguidamente,sesecaronlasplacasyseañadieron100µLpor
pocillo de Tris base (100 mmol/L, pH 10.5) (Sigma-Aldrich®, Madrid, España), leyendo, a
continuación, la absorbancia a 510 nm utilizando un lector de placas (BioRad®, Madrid,
España).Finalmente,laviabilidaddelascélulassecalculócomoelporcentajedeabsorbancia
comparadoconelobtenidoenlascélulassintratar,alosqueselesasignóelvalor100%.
19
4. Determinacióndecitocinas:IL-6yTNF-α
Las células SW982 se sembraron en placas de 24 pocillos (2.5x105 células/pocillo). 48 h
despuésdesembrarlas,seincubaronenpresenciaoausenciadeOLE(50y100µM)durante24
h en DMEM con 10% (v/v) de SFB en una atmósfera del 5% CO2a 37ºC.Seguidamente, se
estimularon con IL-1β (5ng/mL) y se incubaron durante 24 h. Los sobrenadantes del cultivo
fueronrecogidosyconservadosa-80ºC.
LosnivelesdeIL-6ydeTNF-αsehanvaloradomedianteunenzimoinmunoanálisis(ELISA)tipo
competitivo usando un kit comercial de eBioscience®( SanDiego, CA, EE.UU.), siguiendo las
instruccionesindicadasenlosmismos.ElmétodoestuvobasadoenlacompeticiónentrelaIL-
6yTNF-αdelamuestra,yunestándarporlauniónaunanticuerpo(Ac)policlonalanti-IL-6o
anti-TNF-αquerevestíalaplaca.Traslaincubación,seañadióunAcmonoclonalqueseunióal
anterior,y esta ligadoa laenzimacatalasa (enzimadedetección).Trasunnuevo lavado,se
adicionóelsubstratoylareacciónenzimáticaprodujouncolorcuyaintensidadsemidióa450
nm en lector de placa Labsystems Multiskan Ex. (Helsinki, Finlandia) siendo directamente
proporcionalalacantidaddeIL-6odeTNF-αdelasmuestras.
5. Determinacióndelaexpresiónproteica
Con este estudio, se determinaron los cambios en la expresión de determinadas proteínas
presentes en las células SW982 mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico
(SDS)/poliacrilamiday,posteriortransferenciaaunamembranadenitrocelulosa,ydetección
mediante una reacción de quimioluminiscencia empleando anticuerpos específicos de la
proteínadeinterés(Westernblot)(Figura5).
Las células se incubaron en presencia o ausencia de OLE (50 y 100 µM) durante 24 h y se
estimularonconIL-1β(5ng/mL)adistintostiempos,dependiendodelaproteínaestudiada(30
mino 24h). Pasadoel tiempodeestímulo, las células se lisaronutilizandoun tampón, que
conteníauncocktaildeinhibidoresdeproteasasyfosfatasas,yseprocesaronsegúndescriben
Sánchez-Hidalgoycols.(2005)paraaislarlasproteínas.
Laconcentraciónproteicadecadamuestrasedeterminódeacuerdoalmétodocolorimétrico
descritoporBradford.Enesteensayo,5µldecadaunadelasmuestrasadeterminarfueron
añadidosymezcladosconelreactivodeBio-Radproteinassay(Bio-Rad®),elcualalcanzauna
absorbanciamáximaa595nm,permitiendosuposteriorlecturaenunespectrofotómetro.
20
Lasmuestrassedesnaturalizaronporcalor(95ºC,10min)enpresenciadeltampóndecarga
(Laemly1x),conteniendoagentesdesnaturalizantescomoelβ-mercaptoetanolySDS(recubre
lascargasnetasnegativashaciendoquelamigraciónseaproporcionalalacargaytamañode
lamolécula).LaseparacióndelasproteínasserealizómedianteelectroforesisengeldeSDS-
poliacrilamida al 10 %, cargando las muestras, desnaturalizadas y con igual cantidad de
proteína (25µg), en lospocillos formadosenel gel de concentración junto almarcadorde
pesomolecular (Bio-Rad Laboratories®,California, EE.UU.). Laelectroforesis tuvo lugar enel
sistema Mini Protean-II (Bio-Rad Laboratorios®, CA, EE.UU.) en presencia de tampón de
electroforesis (1x). Inicialmente se aplicó una corriente de 70 voltios (V) y se aumentó
paulatinamentehastaalcanzarlos150Vunavezqueelfrentedemigraciónalcanzóelgelde
separación.
En el siguiente paso, las proteínas se transfirieron electroforéticamente desde el gel a una
membranadenitrocelulosa,paraelloseempleóelsistemadetransferenciahúmeda.
Figura5.RepresentaciónesquemáticadelatécnicadeWesternBlotting.
Seguidamente se saturó la membrana con una solución de bloqueo (para evitar uniones
inespecíficasdelAc)durante1ha temperaturaambiente. Traselbloqueo, se incubaron las
membranas con los Ac primarios específicos para las proteínas a determinar diluidos en
tampóndebloqueodurantealmenos1hatemperaturaambienteydespuéstodalanochea
4ºCenunagitadorrotatorio(MovilRod,Selecta®).
21
Cada membrana se lavó con las soluciones C, B, PBS 1X consecutivamente, durante 15
minutos. Seguidamente se incubaron con Ac secundario correspondiente durante 1-2 h a
temperaturaambiente(Tabla3).
Tabla3.AnticuerposusadosenelestudiodelasproteínasCOX-2,m-PGES-1,pJNKypp38.
Anticuerpoprimario Dilución Anticuerposecundario Dilución
Anti-COX-2 conejo (Cayman
Chemical®,Michigan,EE.UU.)
1:1000 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,
Michigan,EE.UU.)
1:50000
Anti-m-PGES-1 rata (Cayman
Chemical,EE.UU.)
1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,
Michigan,EE.UU.)
1:50000
Anti-pJNK ratón (Santa Cruz
Biotechnology®, Santa Cruz, CA,
EE.UU.)
1:200 Antimouse (Dako®,Atlanta,GA,
EE.UU.)
1:2000
Anti-JNK rata (Santa Cruz
Biotechnology®, Santa Cruz, CA,
EE.UU.)
1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,
Michigan,EE.UU.)
1:50000
Anti-pp38 ratón (Santa Cruz
Biotechnology®, Santa Cruz, CA,
EE.UU.)
1:200 Antimouse (Dako®,Atlanta,GA,
EE.UU.)
1:2000
Anti-P38 rata (Santa Cruz
Biotechnology®, Santa Cruz, CA,
EE.UU.)
1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,
Michigan,EE.UU.)
1:50000
Tras los lavados del Ac secundario, la detección de los inmunocomplejos marcados con
peróxidos se realizómediante la reacción de quimioluminiscencia. Sobre lasmembranas se
añadieron losreactivosdelkitdeSupersignal®(Pierce®,Rockford, IL,EE.UU.), luminolyH2O2
(1:1) (la enzima peroxidasa cataliza la oxidación del sustrato luminol en presencia de H2O2
provocando una reacción quimioluminiscente). Por último, para valorar esta señal de
quimioluminiscencia, se introdujeron lasmembranasenel transluminadorLAS-3000 Imaging
SystemdeFujifilmImageReader(Stamford®,CT,EE.UU.),dispositivoquenospermitióobtener
22
unaimagendelaseñal.Losdatosdensitométricosobtenidosfueronestudiadossiguiendouna
normalizaciónconelcontrolβ-actina,ylasseñalesfueronanalizadasycuantificadasmediante
elprogramainformáticoImageJsoftware(Bethesda®,MD,EE.UU.).
6. Evaluaciónestadísticadelosresultados
Todoslosvaloresqueaparecenenlasfigurasyeltextoseexpresancomolamediaaritmética
±el error estándar (SEM), y la significaciónestadísticade lasdiferencias en cadaparámetro
entre los distintos grupos fue evaluada por análisis de varianza de una sola vía (ANOVA),
utilizando el test de comparaciónmúltiple de Tukey. Los valores de p<0.05 se consideraron
estadísticamentesignificativos.LosdatosfueronevaluadosconGraphPadPrism®version5.01
software(SanDiego,CA,EE.UU.).
Enlosexperimentosqueimplicandensitometría,losvaloresindicadossonrepresentativosde
almenostresexperimentosdistintosrealizadosendíasdiferentes.
23
RESULTADOS
1. Efectosdelaoleuropeínaenlaviabilidadcelular
LosefectosdeOLEsobre la laviabilidadde losfibroblastossinovialeshumanos(SW982), fue
realizadomediantelatécnicadeSRB.ElSRBesunmétodoeficienteparaevaluarlatoxicidad
de compuestos sobre células adherentes, basado en lamedición del contenido de proteína
celular.
Tras24h,losresultadosobtenidosdemostraronquelostratamientosconelsecoiridoidealas
concentraciones ensayadas [6,25-100 μM] no resultaron tóxicos, ya que, las células SW982
mostraronunaviabilidad>90%(Figura5).
Figura5.EfectodeOLEenviabilidadcelular.Lasconcentracionesusadasenesteestudiono
afectanalaviabilidaddelascélulasSW982.LascélulasfuerontratadasconOLE[1,6-200μM]
durante24h.Lasupervivenciacelularfueexpresadaenporcentajedeabsorbanciacomparado
conelcontenidoproteicaencélulascontrol(célulassinestimular).
24
2. Efectos de la oleuropeína en la producción de citocinas pro-inflamatorias
Interleucina-6(IL-6)yFactordeNecrosisTumoralα(TNF-α)encélulasSW982
Los resultados correspondientes a laproducciónde IL-6 y TNF-αpusierondemanifiestoun
incremento muy significativo de los niveles de ambas citocinas proinflamatorias tras la
estimulación con IL-1β en relación con los resultados obtenidos en las células SW982 no
estimuladas(***p<0.001vs.célulascontrolnoestimuladas).
Por el contrario, el tratamiento con las concentraciones ensayadas de OLE (50 y 100 μM)
indujo una disminución estadísticamente significativa de ambas citocinas con respecto al
grupodecélulascontrolestimuladasconIL-1β(+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladascon
IL-1β)(Figura6AyB).
Figura6.EfectoinhibidordeOLEenlaproduccióndeIL-6(A)yTNF-α(B)encélulasSW982.
LascélulasSW982fuerontratadasdurante24hconOLE(50y100μM)yestimuladasconIL-1β
(5ng/mL).Losdatossonexpresadoscomomedia±SEM (n=3).***p<0.001vs.célulascontrol
noestimuladas;+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β.
25
3. Efectos de la oleuropeína sobre la expresión de Ciclooxogena-2 (COX-2) y
ProstaglandinaESintasa1microsomal(m-PGES-1)encélulasSW982
Se estudiaron los posibles efectos de OLE sobre la expresión proteica de la COX-2. Tras
estimulardurante24hlascélulasSW982conIL-1β,seobservóunincrementosignificativoen
laexpresiónproteícadeCOX-2(***p<0.001vs.célulascontrolnoestimuladas).Sinembargo,
el tratamiento con OLE (50 y 100 μM) disminuyó la sobreexpresión de dicha proteína pro-
inflamatoria en las células SW982 tratadas respecto a las células control estimuladas (+++
p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β)(Figura7).
Figura 7. Expresión proteica de COX-2 tras el tratamiento con OLE en células SW982. Las
célulasfueronnotratadasotratadasconOLE(50y100μM)durante24henpresenciadeIL-1β
(5ng/mL).LascélulascontrolnoestimuladasfueronincubadasenausenciadeIL-1β.Elgráfico
representalaintensidaddelabanda.Laβ-actinasirviócomocontrolparalanormalizaciónde
la igualdad de carga. Los datos mostrados son medias ± SEM (n=4). ***p<0.001 vs.células
controlsinestimular;+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β.
Lam-PGES-1esunaezima,queinducelaformacióndeprostaglandinaE2(PGE2),unimportatne
eicosanoide que contribuye a la patogéniesis de la AR actuando como mediador de la
inflamacion y el dolor, y promoviendo la destruccióndel hueso (Westman y cols., 2004). En
pacientes con AR, la expresión de m-PGES-1 esta marcadamente aumentada en el tejido
sinovial,sobretodoencélulasinflamatorias(Samuelssonycols.,2007).
26
Laexpresióndem-PGES-1(Figura8),fueincrementadaenFStraslaestimulaciónconIL-1βcon
respectoa losqueno fueronestimuladoscon la citocina (***p<0.001vs. células controlno
estimuladas). No obstante, el tratamiento con ambas dosis de OLE causó una disminución
estadísticamentesignificativade laexpresióndedichaproteínarespectoa lascélulascontrol
traslaestimulaciónconIL-1β(++p<0.01vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β).
Figura8.Expresiónproteicadem-PGES-1traseltratamientoconOLEencélulasSW982.Las
célulasfueronnotratadasotratadasconOLE(50y100μM)durante24henpresenciadeIL-1β
(5ng/mL).LascélulascontrolnoestimuladasfueronincubadasenausenciadeIL-1β.Elgráfico
representalaintensidaddelabanda.Laβ-actinasirviócomocontrolparalanormalizaciónde
la igualdad de carga. Los datosmostrados sonmedias ± SEM (n=4). ***p<0.001 vs. células
controlsinestimular;++p<0.01célulascontrolestimuladasconIL-1β.
4. Estudiodevíasdeseñalización
Para explorar el posible mecanismo molecular de la actividad farmacológica de OLE en FS
humanos,determinamossusefectospotencialesenlavíadeseñalizacióndelasMAPK:JNKy
p38,tras30minutosdeestimuloconIL-1β.
NuestrosresultadospusierondemanifiestoquelosFSdela líneaSW982estimuladosconIL-
1β, inducían un aumento significativo de la fosforilación de las proteínas JNK y p38, en
comparaciónconlosfibroblastoscontrolnoestimulados.Porelcontrario,eltratamientocon
β-actina 46 kDa
m-PGES-1 16 kDa
27
OLE(50y100μM)redujosignificativamentelafosforilacióndeambasMAPK:JNKyp38,tras
30minutosdeestímuloconIL-1β(++p<0.01y+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladascon
IL-1β)(Figura9).
Figura9.ExpresiónproteicadelasproteínasMAPK:pp38ypJNK.Lascélulasfuerontratadas
conOLE(50y100μM)durante24hyestimuladasconIL-1β(5ng/mL)durante30minutos.Las
células control no estimuladas se incubaron en ausencia de IL-1β. El gráfico muestra la
intensidaddelabanda.Elanálisisdensitométricoserealizótraslanormalizaciónconlosgenes
decontrol(JNKyp38)paralaigualdaddecarga.Losdatosmostradossonmedias±SEM(n=6).
***p<0.001 vs. células control sin estimuladas; ++p<0.01 y +++p<0.001 vs. células control
estimuladasconIL-1β.
pJNK
JNK
46 KDa
46 KDa
38 kDa
38 kDa P38
pp38
28
DISCUSIÓN
LosFSdesempeñanunafunciónrelevanteenlapatogeniadelaAR.Enlamembranasinovial
reumatoide,losFSaumentanennúmeroymuestranunfenotipoalterado.Estetipodecélulas
producen citocinas, que junto con la producción de anticuerpos e inmunocomplejos,
mantienenlainflamacióncrónicaydestruyeneltejido,debidosobretodoalasobreexpresión
localdemediadoresinflamatorios,comoIL-6,entreotros(IzquierdoyPablos,2013).
Son varios los estudios llevados a cabo por nuestro grupo de investigación con distintos
compuestofenólicosenmodelosinvivoeinvitrodeAR(Rosilloycols.,2014,2015,2016).Sin
embargo,hasta lafecha,noseconoceelpotencialantirreumáticodeOLEen losfibroblastos
sinovialeshumanos.
Entre las principales citocinas pro-inflamatorias implicadas en la patogénesis de AR se
encuentran: TNF-α, IL-1β e IL-6. Principalmente, la IL-6 se encuentra en células sinoviales y
macrófagospromoviendoladegradacióndelcartílagoylaactivacióndeosteoclastos(Baillety
cols.,2015).NuestroestudiodemostrócomolaestimulaciónconIL-1β,producíaunaumento
enlaexpresióndeIL-6yTNF-αenlascélulasSW982,mientrasqueelpretratamientoconOLE
disminuyódeformasignificativalosnivelesdeambascitocinas.
Asímismo,laCOX-2,isoformainducibledeCOX,esunaenzimaclavequecatalizalabiosíntesis
dePGapartirdeácidoaraquidónico,yasuvez,de m-PGES-1,y juegaunpapelclaveen la
respuestainflamatoria.Nuestrosresultadospusierondemanifiestocomolaexpresiónproteica
de ambas enzimas (COX-2 ym-PGES-1) aumentaba de forma significativa en células SW982
estimuladaspor IL-1β;noobstante,el tratamientoconOLE indujoundescensoconsiderable
delaexpresióndeestasenzimasinflamatorias.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en otros estudios, en los que se demuestra
comoOLEes capazde reducir la repuesta inflamatoriamedianteunadisminuciónenen los
niveles de COX-2,m-PGES-1, IL-6, TNF-α, entre otros (Ryu y cols., 2015; Impellizzeri y cols.,
2011;Coronaycols.,2007).
Entre lasvíasdeseñalización implicadasen laARseencuentra lavíade lasMAPK (Smoleny
Steiner,2003).LasMAPKactivadas,ERK,JNKyp38selocalizaneneltejidosinovialypueden
ser estimuladas por citocinas proinflamatorias como IL-1β (Schett y cols., 2000). Delmismo
modo,ennuestrotrabajopudimosdemostrarcomocuandoestascélulassontratadasconOLE
se reducía la fosforilacióndeambasMAPK: JNKyp38,datos coincidentes con losobtenidos
29
por nuestro grupo de investigación en estudios llevados a cabo con otros compuestos
fenólicos enmodelosmurinos inducidos de artritis (Rosillo y cols., 2015), donde se puso de
manifiesto el efecto antirreumático de estos compuestos fenólicos mediante la drástica
disminucióndelaactivacióndelasMAPK.
En resumen, los resultados de este Trabajo Fin de Grado ponen demanifiesto unmarcado
efectoantiinflamatoriodeOLEsobrefibroblastossinovialeshumanos(SW982),caracterizado
por una disminución en los niveles de citocinas pro-inflamatorias: IL-6 y TNF-α. Entre los
distintosmecanismosdeacciónposiblemente implicadosfiguraneldescensode laexpresión
delaenzimainducibleCOX-2,yportanto,dem-PGES-1,atravésdelainhibicióndelavíade
señalizacióndeMAPK.
30
CONCLUSIÓN
LosresultadosdeesteTrabajoFindeGradopermitenconcluirque:
1. LaOLEpresentaunmarcadoefectoantiinflamatorio sobre losFShumanos (SW982),
caracterizadoporunadisminuciónenlosnivelesdecitocinaspro-inflamatorias:IL-6y
TNF-α. Entre los distintosmecanismos de acción posiblemente implicados figuran el
descensode laexpresiónde laenzima inducubleCOX-2,yportanto,dem-PGES-1,a
travésdelainhibicióndelavíadeseñalizaciónMAPK.
2. Estos resultadospreliminares sugierenqueOLEpodría participar en el desarrollo de
una nueva estrategia terapéutica dirigida a los elementos del sistema inmunitario,
cuyas limitaciones en eficacia y seguridad son bien conocidas, y constituir un
complemento nutricional de gran valor en tratamiento y/o prevención de la AR al
actuarsobreporcesosFS-dependientes.
31
ABREVIATURASYSIGLAS
o Ac:Anticuerpoo ALMT: Ácido logánico
metiltransferasao ALT:Alaninaaminotransferasao AOVE:Aceitedeolivavirgenextrao AR:Artritisreumatoideo ARNm:ARNmensajeroo AST:Aspartatoaminotransferasao CAT:Catalasao CCF:Cromatografíadecapafinao CE:Electroforesiscapilaro CIA:Artritiscolágeno-inducidao CK-MB:Creatinquinasa-MBo CK:Creatinquinasao COX-2:Ciclooxigenasa2o DMEM: Dulbecco'sModified Eagle
Mediumo DXR:Doxorrubicinao ELISA:Enzimoinmunoanálisiso ERK: Cinasa regulada por señal
extracelularo ERN: Especies reactivas de
nitrógenoo ERO:Especiasreactivasdeoxígenoo ESI-MS/MS: Ionización por
electrospray-espectrocopía demasa
o FA:Fosfatasaalcalinao FAMS: Full Automatic Modelling
Systemo FS:Fibroblastossinovialeso GC-MS: Cromatografía de masas-
espectrometríademasaso GDNF: Factor neutrófico derivado
decélulasglialeso GE10H:Geraniol10-hidroxilasao GES:Geraniolsintasa
o GHS:Glutationo GOT: Transaminasa glutámico
oxalacéticao GPx:Glutationperoxidasao GRx:Glutationreductasao GT:Glucosiltransferasao HPLC:Cromatografíalíquidadealta
eficaciao IAM:Infartoagudodemiocardioo IL:Interleucinao iNOS: Óxido nítirico sintasa
inducibleo JNK:c-JunNH2–terminalcinasao LDH:Lactatodeshidrogenasao LPS:Lipopolisacáridoso m-PGES-1:ProstaglandinaEsintasa-
1microsomalo MAPK: Proteínas cinasas activadas
pormitógenoso MMP:Metaloproteasadelamatrizo MPO:Mieloperoxidasao NDHI:NADHdeshidrogenasao NO:Óxidonítricoo OLE:Oleuropeínao PG2:ProstaglandinaE2o PKA:ProteinquinasaAo SDS:Dodecilsulfatosódicoo SEM:Errorestándardelamediao SFB:Suerofetalbovinoo sGPT: Transaminasa glutámico
pirúvicaensueroo SLS:Secologaninasintasao SOD:Superóxidodismutasao SRB:SulforrodaminaBo TG:Triacilglicéridoso TNF:Factordenecrosistumoralo VHB:VirusdelahepatitisBo VIH: Virus de la inmonodeficiencia
humana
32
BIBLIOGRAFÍA
o Ahmad-QasemMH, Barrajón-Catalán E, Micol V, Mulet A, García-Pérez JV.
Influenceoffreezinganddehydrationofoliveleaves(var.Serrana)onextractcomposition
andantioxidantpotential.FoodResInt.2013;50(1):189-196.
o Al-Azzawie HF, Alhamdani MS. Hypoglycemic and antioxidant effect of
oleuropeininalloxan-diabeticrabbits.LifeSci.2006;78(12):1371–1377.
o Alagna F,Mariotti R, Panara F, Caporali S,Urbani S, VenezianiG et al.Olive
phenolic compounds: Metabolic and transcriptional profiling during fruit development.
BMCPlantBiology.2012;12:162.
o AlirezaeiM,DezfoulianO,NeamatiS,RashidipourM,TanidehN,Kheradmand
A.Oleuropeinpreventsethanol-inducedgastriculcersviaelevationofantioxidantenzyme
activitiesinrats.JPhysiolBiochem.2012;68(4),583–592.
o AlloucheN, Fki I, Sayadi S. Towardahigh yield recoveryof antioxidants and
purifiedhydroxytyrosolfromolivemillwastewaters.JAgricFoodChem.2004;52(2):267–
273.
o Altinyay C, AltunML. HPLC analysis of oleuropein in Olea europaea L. J Fac
Pharm.2006;35(1):1–11.
o AndreadouI,SigalaF,IliodromitisEK,PapaefthimiouM,SigalasC,AligiannisN
et al. Acute doxorubicin cardiotoxicity is successfully treated with the phytochemical
oleuropein through suppression of oxidative and nitrosative stress. J Mol Cell Cardiol.
2007;42(3):549–558.
o AnsariM, KazemipourM, Fathi S.Developmentof a simple greenextraction
procedureandHPLCmethodfordeterminationofoleuropeininoliveleafextractapplied
toamulti-sourcecomparativestudy.JIranChemSoc.2011;8(1):38–47.
o Aupperle KR, Yamanishi Y, Bennett BL, Mercurio F, Boyle DL, Firestein GS.
Expression and regulation of inducible ikappaB kinase (IKK-i) in human fibroblast-like
synoviocytes.Cellimmunol.2001;214(1):54-59.
o Baillet A, Gossec L, Paternotte S, Etcheto A, Combe B, Meyer O et al.
Evaluationofseruminterleukin-6levelasasurrogatemarkerofsynovialinflammationand
as a factor of structural progression in early rheumatoid arthritis: results from a French
nationalmulticentercohort.ArthritisCareRes(Hoboken).2015;67(7):905-912.
33
o BarbaroB,ToiettaG,MaggioR,ArcielloM,TarocchiM,GalliAetal.Effectsof
the olive-derived polyphenol oleuropein on human health. Int J Mol Sci. 2014; 15(10):
18508-18524.
o Bazoti FN,BergquistJ,MarkidesKE,TsarbopoulosA.Noncovalent interaction
betweenamyloid-β-peptide(1–40)andoleuropeinstudiedbyelectrosprayionizationmass
spectrometry.JAmSocMassSpectrom.2006;17(4):568–575.
o BiX,LiW,SasakiT,LiQ,MitsuhataN,AsadaYetal.Secoiridoidglucosidesand
related compounds from Syringa reticulata and their antioxidants activities. BioorgMed
ChemLett.2011;21(21):6426–6429.
o Bisignano G, TomainoA, Lo Cascio R, CrisafiG,UccellaN, Saija A.On the in
vitro antimicrobial activity of oleuropein and hydroxytyrosol. J Pharm Pharmacol. 1999;
51(8):971–974.
o Boccio P, DiDeo A, De Curtis A, Celli N, Iacoviello L, Rotilio D. Liquid
chromatography-tandem mass spectrometry analysis of oleuropein and its metabolite
hydroxytyrosol in rat plasma and urine after oral administration. J Chromatogr B. 2003;
785(1):47–56.
o BouazizM, JemaiH, KhabouW, Sayadi S.Oil content, phenolic profiling and
antioxidantpotentialofTunisianolivedrupes.JSciFoodAgric.2010;90(10):1750–1758.
o BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogram
quantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalBiochem.1976;72:
248-254.
o Čabarkapa A, Živkovic´ L, Žukovec D, Djelic´ N, Bajic´ V, Dekanski D et al.
Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated
usinginvitrocometassaywithhumanperipheralleukocytes.ToxicolInVitro.2014;28(3):
451–456.
o Caponio F, Alloggio V, Gomes T. Phenolic compounds of virgin olive oil:
Infuenceofpastepreparationtechniques.FoodChem.1999;64(2):203–209.
o CárdenoA,Sánchez-HidalgoM,Alarcón-de-la-LastraC.Anup-dateofoliveoil
phenolsininflammationandcancer:Molecularmechanismsandclinicalimplications.Curr
MedChem.2013;20:4758-4776.
o Carrera-GonzálezMP,Ramírez-ExpósitoMJ ,MayasMD,Martínez-MartosJM.
Protectiveroleofoleuropeinanditsmetabolitehydroxytyrosoloncancer.TrendsFoodSci
Tech.2013;31(2):92–99.
34
o CaturlaN,PerezFonsL,EstepaA,MicolV.Differentialeffectsofoleuropein,a
biophenol from Olea europaea, on anionic and zwiterionic phospholipid model
membranes.ChemPhysLipids.2005;137(1-2):2–17.
o CharoenprasertS,MitchellA.Factorsinfluencingphenoliccompoundsintable
olives(Oleaeuropaea).JAgricFoodChem.2012;60(29):7081–7095.
o Cho JH. Recent progress in inflammatory bowel disease. Adv ExpMed Biol.
2006;579:24-34.
o CiceraleS,LucasLJ,KeastRS.Antimicrobial,antioxidantandanti-inflammatory
phenolicactivitiesinextravirginoliveoil.CurrOpinBiotechnol.2012;23(2):129–135.
o Corona G, Deiana M, Incani A, Vauzour D, Dessì MA, Spencer JPE. (2007).
Inhibition of p38/CREB phosphorylation and COX-2 expression by olive oil polyphenols
underlies their anti-proliferative effects. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 362(3),
606–611.
o CzerwisńkaM,KissAK,NaruszewiczM.Acomparisonofantioxidantactivities
of oleuropein and its dialdehydic derivative from olive oil, oleacin. Food Chem. 2012;
131(3):940–947.
o Daccache A, Lion C, Sibille N, GerardM, Slomianny C, Lippens G, Cotelle P.
Oleuropein and derivatives from olives as Tau aggregation inhibitors. Neurochem Int.
2011;58(6):700–707.
o Damtoft S, Franzyk H, Jensen SR. Biosynthesis of iridoids in Syringa and
Fraxinus:carbocycliciridoidprecursors.Phytochemistry.1995;40(3):785–792.
o DeLaTorre-CarbotK,JaureguiO,GimenoE,CastelloteAI,Lamuela-Raventós
RM, López-Sabater MC. Characterization and quantification of phenolic compounds in
oliveoilsbysolid-phaseextraction,HPLC-DAD,andHPLC-MS/MS.JAgricFoodChem.2005;
53(11):4331-4340.
o Dell’AgliM,FagnaniR,GalliGV,MaschiO,GilardiF,BellostaSetal.Oliveoil
polyphenolsmodulate the expressionofmetalloproteinase9 in THP-1 cells by actingon
nuclearfactor-kβsignalling.JAgricFoodChem.2010;58(4):2246–2252.
o Deng RX, Yuan H, Yin WP, Wang XS, Zhao TZ. Chemical constituents from
SyringapubescensTurcz.BiochemSystEcol.2010;38:813–815.
o Domitrovic´R,JakovacH,MarchesiVV,ŠainI,Romic´Ž,Rahelic´D.Preventive
andtherapeuticeffectsofoleuropeinagainstcarbontetrachloride-inducedliverdamagein
mice.PharmacolRes.2012;65(4):451–464.
o EstiM,CinquantaL,laNotteE.Phenoliccompoundsindifferentolivevarieties.
JAgricFoodChem.1998;46(1):32–35.
35
o Fang HL, Lai JT, LinWC. Inhibitory effect of olive oil on fibrosis induced by
carbontetrachlorideinratliver.ClinNutr.2008;27(6):900–907.
o Fauci AS, Langford CA. Harrison Reumatología (2nd ed.). Mc-Graw-Hill
Interamericana.2010.
o Fernández-BolañosJ,RodríguezG,RodríguezR,HerediaA,GuillénR,Jiménez
A.Productioninlarguequantitiesofhighlypurifiedhydroxytyrosolfromliquid-solidwaste
of two-phaseoliveoilprocessingor “Alperujo”. JAgricFoodChem.2002;50 (23):6804-
6811.
o Fuentes E, Palomo I. Antiplatelet effects of natural bioactive compounds
bymultipletargets.Foodanddruginteractions.JFunctFoods.2014;6(1):73–81.
o FurneriPM,MarinoA,SaijaA,UccellaN,BisignanoG.Invitroantimycoplasmal
activityofoleuropein.IntJAntimicrobAgents.2002;20(4):293–296.
o GhoshS,GoldinE,GordonFH,MalchowHA,Rask-MadsenJ,RutgeertsPetal.
NatalizumabforactiveCrohn’sdisease.NEnglJMed.2003;348(1):24-32.
o GinerE,AndújarI,RecioMC,RíosJL,Cerdá-NicolásJM,GinerRM.Oleuropein
amelioratesacutecolitisinmice.JAgricFoodChem.2011;59(24):12882–12892.
o Giner E, Recio MC, Ríos JL, Giner RM. Oleuropein protects against dextran
sodiumsulfate-inducedchroniccolitisinmice.JNatProd.2013;76(6),1113–1120.
o Goldsmith CD, Stathopoulos CE, Golding JB, Roach PD. Fate of the phenolic
compoundsduringoliveoilproductionwith the traditionalpressmethod. IntFoodRes J
2014;21(1):101–109.
o González M, Zarzuelo A, Gamez MJ, Utrilla MP, Jimenez J, Osuna I.
Hypoglycemicactivityofoliveleaf.PlantaMed.1992;58(6):513–515.
o Guo N, Yu Y, Ablajan K, Li L, Fan B, Peng J et al. Seasonal variations in
metabolites profiling of the fruits of Ligustrum lucidum Ait. Rapid Commun Mass
Spectrom.2011;25(12):1701–1714.
o HamdiHK,CastellonR.Oleuropein,anon-toxicolive iridoid, isananti-tumor
agentandcytoskeletondisruptor.BiochemBiophysResCommun.2005;334(3):769–778.
o HassemI,CasabiancaH,HosniK.Biologicalactivitiesofthenaturalantioxidant
oleuropeína:Exceedingtheexpectation-Amini-review.JFunctFoods.2015;18:926-40.
o HommesD,vandenBlinkB,PlasseT,BartelsmanJ,XuC,MacphersonBetal.
Inhibition of stress-activatedMAP kinases induces clinical improvement inmoderate to
severeCrohn’sdisease.Gastroenterol.2002;122(1):7-14.
36
o ImpellizzeriD,EspositoE,MazzonE,Paterniti I,DiPaolaR,BramantiPetal.
Theeffectsof apolyphenolpresent inoliveoil, oleuropeinaglycone, inanexperimental
modelofspinalcordinjuryinmice.BiochemPharmacol.2012;83(10):1413–1426.
o ImpellizzeriD,EspositoE,MazzonE,Paterniti I,DiPaolaR,BramantiPetal.
The effects of oleuropein aglycone, an olive oil compound, in a mouse model of
carrageenan-inducedpleurisy.ClinNutr.2011;30(4):533–540.
o IzquierdoE,PablosJL.Fibroblastossinoviales.SeminFundEspReumatol.2013;
14(4):121-128.
o JanahmadiZ,NekooeianAA,MoarefAR,EmamghoreishiM.OleuropeinOffers
CardioprotectioninRatswithAcuteMyocardialInfarction.CardiovascToxicol.2014;15(1):
61-68.
o Japón-LujanR,LuquedeCastroMD.Smallbranchesofolivetree:Asourceof
biophenolscomplementarytooliveleaves.JAgricFoodChem.2007;55(11):4584–4588.
o Jemai H, BouazizM, Fki I, El Feki A, Sayadi S. Hypolipidimic and antioxidant
activities of oleuropein and its hydrolysis derivative-rich extracts from Chemlali olive
leaves.ChemBiolInteract.2008;176(2-3):88–98.
o KanakisP,TermentziA,MichelT,GikasE,HalabalakiM,SkaltsounisAL.From
olivedrupes tooliveoil.AnHPLC-orbitrap-basedqualitativeandquantitativeexploration
ofolivekeymetabolites.PlantaMed.2013;79(16):1576–1587.
o Katsiki M, Chondrogianni N, Chinou I, Rivett AJ, Gonos ES. The olive
constituentoleuropeinexhibitsproteasomestimulatorypropertiesinvitroandconferslife
spanextensionofhumanembryonicfibroblasts.RejuvenationRes.2007;10(2):157–172.
o Katsoulieris EN. The olive leaf extract oleuropein exerts protective effects
againstoxidant-inducedcelldeath, concurrentlydisplayingpro-oxidantactivity inhuman
hepatocarcinomacells,RedoxRep.2016;21(2):90-97
o KimSW,HurW,LiTZ,LeeYK,ChoiJE,HongSWetal.Oleuropeinpreventsthe
progressionofsteatohepatitistohepaticfibrosisinducedbyhigh-fatdietinmice.ExpMol
Med.2014;46:e92.
o KimuraY,SumiyoshiM.Oliveleafextractanditsmaincomponentoleuropein
preventchronicultravioletBradiation-inducedskindamageandcarcinogenesisinhairless
mice.JNutr.2009;139(11):2079–2086.
o KotyzováD,HodkováA,EyblV.Theeffectofoliveoilphenolics-hydroxytyrosol
andoleuropeinonantioxidantdefencestatus inacutearsenicexposedrats.ToxicolLett.
2011;205:S222.
37
o Kyriakis JM, Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal
transductionpathwaysactivatedbystressandinflammation.PhysiolRev.2001;81(2):
807-869.
o Kyriakopoulou K, Katsanou E, Machera K, Charistou A. Oleuropein protects
HepG2cellsagainstoxidativestress-inducedDNAdamage.ToxicolLett.2012;211:S106.
o Lee OH, Lee BY, Lee J, Lee HB, Son JY, Park CS et al. (2009). Assessment of
phenolics-enriched extract and fractions of olive leaves and their antioxidant activities.
BioresourTechnol.2009;100(23):6107–6113.
o Lee-HuangS,HuangPL,ZhangD,LeeJW,BaoJ,SunYetal.Discoveryofsmall-
molecule HIV-1 fusion and integrase inhibitors oleuropein and hydroxytyrosol: Part I.
fusion[corrected]inhibition.BiochemBiophysResCommun.2007;354(4):872–878.
o Lee-HuangS,HuangPL,ZhangD,LeeJW,BaoJ,SunYetal.Discoveryofsmall-
molecule HIV-1 fusion and integrase inhibitors oleuropein and hydroxytyrosol: Part II.
integraseinhibition.BiochemBiophysResCommun.2007;354(4):879–884.
o LinHM, YenFL,NgLT, LinCC. Protectiveeffectsof Ligustrum lucidum fruit
extract on acute butylated hydroxytoluene-induced oxidative stress in rats. J
Ethnopharmacol.2007;111(1):129–136.
o Malik NSA, Bradford JM. Changes in oleuropein levels during differentiation
anddevelopmentoffloralbudsin“Arbequina”olives.SciHortic.2006;110:274–278.
o McInnesIB,SchettG.Thepathogenesisofrheumatoidarthritis.NEnglJMed.
2011;365(23):2205-2219.
o Micol V, Caturla N, Pérez-Fons L, Más V, Pérez L, Estepa A. The olive leaf
extract exhibits antiviral activity against viral haemorrhagic septicaemia rhabdovirus
(VHSV).AntivirRes.2005;66(2-3):129–136.
o NeurathMF,FussI,SchürmannG,PetterssonS,ArnoldK,Müller-LobeckHet
al.CytokinegenetranscriptionbyNF-kappaBfamilymembersinpatientswith
inflammatoryboweldisease.AnnNYAcadSci.1998;859:149-159.
o ObiedHK,BedgoodDR,PrenzlerPD,RobardzK.BioscreeningofAustralian
olivemillwasteextracts:Biophenolcontent,antioxidant,antimicrobialandmolluscicidal
activities.FoodChemToxicol.2007;45(7):1238–1248.
o OmarSH.Oleuropeininoliveanditspharmacologialeffects.SciPharm.2010;
78(2):133-154.
o Ortega-García F, Peragón J.HPLCanalysisofoleuropein, hydroxytyrosol, and
tyrosolinstemsandrootsofOleaeuropaeaL.cv.Picualduringripening.JSciFoodAgric.
2010;90(13):2295–2300.
38
o PerriE,RaffaelliA,SindonaG.Quantitationofoleuropeininvirginoliveoilby
ionspray mass spectrometry-selected reaction monitoring. J Agric Food Chem. 1999;
47(10):4156–4160.
o RanalliA,ContentoS,LuceraL,diFeboM,MarchegianiD,diFonzoV.Factors
affectingthecontentsofiridoidoleuropeininoliveleaves(OleaeuropaeaL.).JAgricFood
Chem.2006;54(2):434–440.
o Rosillo MA, AlcarazMJ, Sánchez-HidalgoM, Fernández-Bolaños JG, Alarcón-
de-la-LastraC,FerrándizML.Anti-inflammatoryandjointprotectiveeffectsofextra-virgin
olive-oilpolyphenolextractinexperimentalarthritis.JNutrBiochem.2014;25(12):1275-
1281.
o RosilloMA,Sánchez-HidalgoM,González-BenjumeaA,Fernández-BolañosJG,
LubbertsE,Alarcón-de-la-LastraC.Preventiveeffectsofdietaryhydroxytyrosolacetate,an
extra virgin olive oil polyphenol inmurine collagen-induced arthritis.MolNutr FoodRes.
2015;59(12):2537-2546.
o RosilloMA,Sánchez-HidalgoM,Sánchez-FidalgoS,Aparicio-SotoM,VillegasI,
Alarcón-de-la-Lastra C.Dietary extra-virgin olive oil prevents inflammatory response and
cartilagematrixdegradationinmurinecollagen-inducedarthritis.EurJNutr.2016;55(1):
315-325.
o RubióL,SerraA,MaciàA,PiñolC,RomeroMP,MotilvaMJ.Invivodistribution
anddeconjugationof hydroxytyrosol phase IImetabolites in red blood cells: A potential
newtargetforhydroxytyrosol.JFunctFoods.2014;10:1–5.
o Ryan D, AntolovichM,Prenzler P, RobardsK, Lavee S. Biotransformationsof
PhenoliccompoundsinOleaeuropaeaL.SciHorticult.2002;92:147-176.
o RyuSJ,ChoiHS,YoonKY,LeeOH,KimKJ,LeeBY.OleuropeinsuppressesLPS-
induced inflammatory responses in RAW 264.7 cell and zebrafish. J Agric Food Chem.
2015;63(7):2098-105.
o Saija A,UccellaN.Olivebiophenols: functional effects onhumanwell-being.
TrendsFoodSciTechnol.2001;11(9-10):357–363.
o Samuelsson B, Morgenstern R, Jakobsson PJ. Membrane prostaglandin E
synthase-1:Anoveltherapeutictarget.PharmacolRev.2007;59(3):207-224.
o Sánchez-HidalgoM,MartínAR,VillegasI,AlarcónDeLaLastraC.Rosiglitazone,
anagonistofperoxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,reduceschroniccolonic
inflammationinrats.BiochemPharmacol.2005;69(12):1733-1744.
o SanzM,SimónBF,CadahíaE,EsteruelasE,MuñozAM,HernándezTetal.LC-
DAD/ESI-MS/MSstudyofphenolic compounds inash (Fraxinusexcelsior L.andFraxinus
39
Americana L.) heartwood. Effect of toasting intensity at cooperage. J Mass Spectrom.
2012;47(7):905–918.
o SavourninC,BaghdikianB,EliasR,Dargouth-KesraouiF,BoukefK,BalansardG.
Rapidhigh-performanceliquidchromatographyanalysisforthequantitativedetermination
ofoleuropeininOleaeuropaealeaves.JAgricFoodChem.2001;49(2):618–621.
o SchettG,Tohidast-AkradM,SmolenJS,SchmidBJ,SteinerCW,BitzanPetal.
Activation,differential localization,andregulationofthestress-activatedproteinkinases,
extracellularsignal-regulatedkinase,c-JUNN-terminalkinase,andp38mitogen-activated
proteinkinase, insynovialtissueandcells inrheumatoidarthritis.ArthritisRheum.2010;
43(11):2501-2512.
o Sepporta MV, Fuccelli R, Rosignoli P, Ricci G, Servili M, Morozzi G et al.
Oleuropeininhibitstumourgrowthandmetastasesdisseminationinovariectomisednude
micewithMCF-7humanbreasttumourxenografts.JFunctFoods.2014;8:269–273.
o Skehan P, StorengR, ScudieroD,MonksA,McMahon J,VisticaDet al.New
colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancer Inst. 1990;
82(13):1107-1112.
o SmolenJS,SteinerG.Therapeuticstrategiesforrheumatoidarthritis.NatRev
DrugDiscov.2000;2(6):473-488.
o Soler-Rivas C,Espin JC,WichersHJ.Oleuropeinandrelatedcompounds. JSci
FoodAgric.2000;80(7):1013–1023.
o StamatopoulosK,ChatzilazarouA,Katsoyannos,E.OptimizationofMultistage
Extraction of Olive Leaves for Recovery of Phenolic Compounds at Moderated
TemperaturesandShortExtractionTimes.Foods.2014;3:66-81.
o Sun P, Zhou K,WangS, Li P, Chen S, Lin G, Zhao Y,Wang T. Involvement of
MAPK/NF-ĸB signaling in the activation of the cholinergic anti-inflammatory pathway in
experimentalcolitisbychronicvagusnervestimulation.PLosOne.2013;8(8):e69424.
o Tan HW, Tuck KL, Stupans I, Hayball PJ. Simultaneous determination of
oleuropein and hydroxytyrosol in rat plasma using liquid chromatography with
fluorescencedetection.JChromatogrB.2003;785(1):187–191.
o Tayoub G, SulaimanH, Hassan AH, AlorfiM. Determination of oleuropein in
leavesand fruitsof someSyrianolive varieties. Int JMedAromPlants. 2012;2(3): 428–
433.
o Tuberoso CI, KowalczykA, SarritzuE,CabrasP.Determinationof antioxidant
compounds and antioxidant activity in commercial oil seeds for food use. Food Chem.
2007;103:1494–1501.
40
o Tuck KL, Hayball PJ.Major phenolic compounds in olive oil:Metabolism and
healtheffects.JNutrBiochem.2002;13(11):636–644.
o VisioliF,GalliC.Oliveoil:Morethanjustoleicacid.AmJClinNutr.2000;72(3):
853.
o VissersMN,ZockPL,RoodenburgAJC,LeenenR,KatanMB.Oliveoilphenols
areabsorbedinhumans.JNutr.2002;132(3):409–417.
o WeiJ,FengJ.Signalingpathwaysassociatedwithinflammatoryboweldisease.
RecentPatInflammAllergyDrugDiscov.2010;4(2):105-107.
o WestmanM,KorotkovaM,KlintE,StarkA,AudoloyLP,KlarekogLetal.
ExpressionofmicrosomalprostaglandinEsynthase1inrheumatoidarthritissynovium.
ArthrtisRheum.2004;50(6);1774-1778.
o ZhaoG,YinZ,DongJ.AntiviralefficacyagainsthepatitisBvirusreplicationof
oleuropein isolated from Jasminum officinale L. var. grandiflorum. J Ethnopharmacol.
2009;125(2):265–268.
o Zoidou E, Melliou E, Gikas E, Tsarbopoulos A, Magiatis P, Skaltsounis AL.
Identificationof ThroubaThassos, a traditionalGreek tableolive variety, as anutritional
richsourceofoleuropein.JAgricFoodChem.2010;58(1):46–50.