Date post: | 24-Jul-2015 |
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EFECTOS DEL ENTRENAMIENTO DE FUERZA SOBRE LA SENSIBILIDAD
DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO A LA LEPTINA
Hugo Olmedillas Fernández
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
INTRODUCCIÓN
ü ACSM 19981: Aconseja la necesidad de añadir sesiones de fuerza a los programas de entrenamiento teniendo como objetivo que los principales grupos musculares del cuerpo se ejerciten. ü ACSM 20012: El mantenimiento de la masa muscular es un componente importante para lograr el éxito dentro de programas de entrenamiento que tengan como objetivo la pérdida de masa grasa. ü NCSA 2001: Existen evidencias científicas que sugieren que la participación en programas de fuerza generan beneficios para la salud:
- Disminución de la presión sanguínea. - Leves mejoras en el perfil lipídico.
- Aumento de la tolerancia a la glucosa y mayor sensibilidad a la insulina.
MSSE 30(6):975-991, 1998; MSSE 33(12):2145-2156, 2001; MSSE 34(2):364-380, 2002; National Strength & Conditioning Association: 23(6), 9-23,2001
INTRODUCCIÓN
LEPTINA
ü Dickie et al (1950), comunican la aparición en una de sus colonias de ratas, un mutante asociado con obesidad mórbida (ob/ob).
ü Coleman et al (1978), describen otra alteración genética en ratones, que consistía en la aparición de obesidad y diabetes y que fue denominado db/db.
ü Zhang et al (1994), consiguen clonar el gen ob, que codifica para la leptina, una proteína de 167aa que se expresaba únicamente en el tejido adiposo.
ü Tartaglia et al (1995), logran clonar y secuenciar el gen db, que codifica para las distintas isoformas del receptor de leptina (OB-R).
Dickie MD, J Hered 1950; 41: 317-318; Coleman DL. Diabetologia 1978; 14: 141-148; Zhang et al, Nature 1994; 372: 425-432; Tartaglia et al Cell 83, 1263-1271.
Funciones de la leptina
v Central
- Disminución del apetito
- Aumento gasto energético
v Periférico
- Aumento oxidación A.G.
- Aumento captación de glucosa
- Aumento metabolismo basal
INTRODUCCIÓN
Argiles et al, Med Res Rev. 2005 Jan;25(1):49-65. Review. Zhang et al, Nature. 1994 Dec 1;372(6505):425-32. Erratum in: Nature 1995 Mar 30;374(6521):479.;
Isoformas del receptor de leptina
Lee et al., 1996; White y Tartaglia 1996 Tartaglia 1997; Chua et al., 1997.
INTRODUCCIÓN
ü Isoformas cortas (OB-Ra,c,d,f)
ü Isoformas secretada o soluble (OB-Re)
ü Isoforma larga (OB-Rb)
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
1. El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se
asocia a un descenso de la masa grasa.
2. El entrenamiento de fuerza aumenta los niveles de expresión proteica de
receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.
3. El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.
HIPÓTESIS
HIPÓTESIS
MÚSCULO ESQUELÉTICO
MÚSCULO ESQUELÉTICO
1. El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se
asocia a un descenso de la masa grasa.
3. El entrenamiento de fuerza aumenta la cantidad de expresión proteica de
receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.
5. El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.
6. La sensibilidad muscular a la leptina está aumentada en los sujetos con
mayor porcentaje de fibras musculares de tipo I.
HIPÓTESIS
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
1. Determinar la expresión proteica de OB-R en músculo esquelético
humano.
2. Investigar si el entrenamiento de fuerza altera los niveles de expresión de
los receptores musculares de leptina.
3. Estudiar si el entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina
en el músculo esquelético humano.
OBJETIVOS
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectiva de futuro
Variable
Edad (años) 34 ± 4.4 Altura (cm) 176 ± 2.8 Peso (Kg) 85 ± 12 BF (%) 23.8 ± 7.5
Sujetos:
8 Adultos (activos):
MATERIAL Y MÉTODOS
• Test de fuerza: 1 Repetición máxima (1RM)
• Absorciometría fotónica dual de rayos-X (DXA) (Hologic QDR-1500)
• Biopsia muscular (Técnica de Bergstrom)
• D. fibras musculares
• Kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay )
• Western Blot
Electroforesis
Histoquímica
MATERIAL Y MÉTODOS
Prensa Leg Extension Remo Sentado Press Banca ½ Sentadilla Tríceps Polea Alta Femoral
MATERIAL Y MÉTODOS 1RM
MATERIAL Y MÉTODOS DXA
ü Masa grasa corporal (MGC)
ü Masa muscular corporal (MMC)
ü Masa muscular brazos (MMB)
ü Masa muscular piernas (MMP)
MATERIAL Y MÉTODOS Biopsia
MATERIAL Y MÉTODOS
Programa de entrenamiento
Determinación de fibras musculares
• Histologica - ATPase
• Electrophoresis - SDS-PAGE (Sodium Dodecil Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
4.3 4.6 10.3
1 1 5 Tipo I 1 3 1 Tipo IIc 5 5 1 Tipo IIa 5 3 1 Tipo 2ax 5 1 1 Tipo 2x
ATPase Technique
4.6
4.3
10.3
I
IIx
IIa
SDS-PAGE
Enhanced protein electrophoresis technique for separating human skeletal muscle myosin heavy chain isoforms. Bamman J Physiol. Sci. Vol. 56, No. 5; Oct.2006
Isoformas cadena pesada de miosina (MHC)
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectiva de futuro
Problemas
I La expresión de mRNA de OB-R en músculo esquelético humano ya había sido descrita (Ceddia, et al 2001). Aunque se desconocía sí existía expresión proteica de las isoformas de OB-R en este tejido (Guerra et al, 2007).
II Dificultad de establecer la distribución de las fibras en el músculo esquelético humano. Mediante la técnica electroforética somos capaces de determinar las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC).
I OPTIMIZACIÓN DEL WESTERN BLOT PARA OB-R
• Tampón de extracción de proteínas: UREA 6M-SDS 1%
• Electroforesis: No > 90 min.
• Incubación con anticuerpo primario: la incubación con rabbit-anti-OB-R O/N a 4ºC 1:2000 en tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% diluida en TBS-Tween 0.1%).
• Lavados: TBS-Tween 20 (0.2%) para disminuir el ruido de fondo.
• Incubación con anticuerpo secundario: la incubación con el anti-rabbit-HRP 1 hora R.T. a 1:20.000 en tampón de bloqueo.
Guerra et al, 2007
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
1. VARIABLES EN LA MUESTRA
2. VARIABLES EN EL GEL
ü Degradación extracto proteico
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra
ü Buffer de extracción
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra
ü Buffer de extracción
ü Cuantificación de proteínas
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
1. VARIABLES EN LA MUESTRA
2. VARIABLES EN EL GEL
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
ü Protean II; Mini-protean III
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)
ü 30% Glicerol
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü 30% Glycerol
ü Running Buffer
VARIABLES EN EL GEL
Running Buffer
• Lower Running Buffer (LRB)
50mM Tris, 75 mM glycine, 0.05%SDS
• Top Running Buffer (TRB) 2x TRB
6x TRB
Electrophoretic Separation of Human Skeletal Muscle Myosin Heavy Chain Isoforms: The Imporatance of Reducing Agents. T.A. Kohn, K. H. Myburgh. J. Physiol Sci Vo.56, No. 5; 2006; pp.355-360
6X (Kohn et al, 2006) 2X Comercial
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
6X Comercial
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 30% Glycerol
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü Running Buffer
ü Temed
VARIABLES EN EL GEL
TEMED 0.03%
TEMED 0.1%
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
TEMED 0.25%
TEMED 0.05%
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 30% Glycerol
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü Running Buffer
ü Temed
ü Tinción del gel
VARIABLES EN EL GEL
SILVER
COOMASSIE
Western Blot
Type IIa
Type IIx
Type I
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
Tinción del gel
MHC
II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
1RM MIEMBROS SUPERIORES
RESULTADOS
1RM
(kg)
A B AB A B
P. BANCA REMO EXT.TRICEPS
*
** 36%
1RM MIEMBROS INFERIORES
RESULTADOS
A B AB A B
1RM
(kg)
PRENSA ½ SQUAT L.E.
*
*
*
14%
GRASA CORPORAL RESULTADOS
A B
Gra
sa C
orpo
ral (
%) *
LEPTINA RESULTADOS
*
Lept
in C
once
ntra
tion
(ng/
mL)
A B
P=0.002
OB-R RESULTADOS
170KDa 128KDa 98KDa
A AB A BB
OB
-R/a
lpha
-Tub
ulin
ban
d de
nsity
(a
rbitr
ary
units
)
P= 0.33
P= 0.64
P= 0.43
RESULTADOS
MMC
A B
MM
C (k
g)
P= 0.46
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
CONCLUSIONES
ü Hemos identificado OB-R en músculo esquelético humano.
ü Hemos mejorado la técnica electroforética permitiendo la identificación de las tres isoformas de MHC en músculo esquelético humano de forma reproducible.
ü Tras un programa de 12 semanas de entrenamiento de fuerza se produce una reducción de la masa grasa y una disminución significativa de la concentración de leptina en suero, pero la expresión proteica de OB-R no cambia.
CONCLUSIONES
ü Los resultados son compatibles con un aumento de la sensibilidad a la leptina en músculo esquelético humano en respuesta al entrenamiento de fuerza.
INDICE q Introducción q Hipótesis q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones q Perspectivas de futuro
1. Analizar eletroforéticamente todas las fibras musculares
de las muestras que tenemos en el laboratorio (± 300).
2. Conocer las vías de señalización activadas por el OB-Rb
en respuesta al ejercicio.
3. Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra
muscular.
PERSPECTIVAS DE FUTURO
200X_ Goat anti Rabbit 200X_ Rabbit antiOBR
400X_ Rabbit antiOBR
25µm 25µm
25 µm
Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra muscular
ATENCIÓN