Fernando A. Osorio Nebraska Center for Virology and School of Veterinary
Medicine and Biomedical Sciences University of Nebraska-Lincoln
“El PRRSV vs. el Cerdo: Dinámica de la Infección Individual"
“Simposio Internacional de PRRS México 2012, Ayer, Hoy y Mañana”
Octubre 1y 2, 2012 FMVZ-UNAM
Tony Goldberg William L Laegreid Osvaldo Lopez Fernando Osorio Asit Pattnaik Federico Zuckermann
Esta plática incluirá trabajos resultantes de colaboración entre dos ó más de los siguientes laboratorios:
Vacunas PRRSV:
• Vacunas muertas • Vacunas a virus vivo modificado (MLVs)
Son el tipo de vacuna contra PRRSV más eficaz
Buena protección contra infección homologa
( ~ 100%, “inmunidad esterilizante”)
Menor eficacia en caso de infección heterologa (50 al 80%)
• Aislamientos iniciales de PRRSV:1991/1992 • Vacunas de PRRSV han estado en uso desde1994!
ineficaces
• Dos genotipos: I: Europeo II: Norte Americano
• Gran diversidad intra-genotipo
• Multiple variantes de PRRSV • Dentro de una misma granja • Dentro de un mismo animal
Stadejek et al., 2006; Goldberg et al. 2003; Kapur et al. 1996.
El Mayor Obstáculo para el Desarrollo de Vacunas Eficaces X PRRSV :
Diversidad Genetica /Antigenica del PRRSV
1.0E+03
1.0E+04
1.0E+05
1.0E+06
4dpi 7dpi 10dpi 14dpi
Vir
al lo
ad (c
opie
s/m
l)
Days of experiment
MLV KV/ADJ Control
MLV
Ctrl
KV/ADJ
(Zuckermann et al 2007)
Detection level qPCR 103RNA mols per ml
Ejemplo de la eficacia de una MLV X PRRSV, desafio homologo Viremia post-desafio, PRRSV Tipo I
Esto significa inmunidad esterilizante Generada por la MLV
Viremia en el grupo vacuna muerta
Viremia en los controles
Viremia Treatment Animal Day 32 Day 35 Day 38 Day 42
21817 7.20E+03 8.40E+03 2.90E+04 2.14E+04 61212 7.16E+02 7.60E+03 5.19E+04 1.66E+03 61127 5.38E+04 0 1.77E+04 0 11679 1.95E+03 5.03E+04 4.71E+05 1.62E+04 61151 1.95E+04 9.66E+04 7.29E+04 6.49E+04 21828 4.56E+04 1.25E+03 2.50E+05 0 11633 2.80E+04 6.61E+06 1.12E+05 0 11677 4.00E+05 8.36E+03 4.13E+05 0 21839 1.69E+04 4.78E+04 7.71E+03 4.54E+02
KV/ADJ
61136 5.35E+04 1.33E+04 0 0 61126 0(*) 0 0 0 21826 0 0 0 0 21827 0 0 0 0 21815 0 0 0 0 11680 0 0 0 0 61150 0 0 0 0 21816 0 0 0 0 21823 0 0 0 0 61154 0 0 0 0
MLV
21814 0 0 0 0 61137 1.39E+06 1.55E+04 4.74E+04 4.60E+03 11676 7.75E+04 2.41E+06 5.28E+05 2.10E+03 21813 1.32E+06 2.59E+03 0 3.81E+05 61124 8.89E+04 1.80E+04 1.25E+05 1.21E+03
Control
21864 8.49E+04 3.95E+04 2.27E+04 2.57E+04
2006 Prueba de eficacia vacunas PRRSV : Carga viral(viremia) post-desafio
(PRRSV-Lelystad)
Inmunidad Esterilizante
muerta
MLV
controles
V IRAL BURDEN IN TISSUES (RNA copies/g ) Treatment Animal
Lung Tonsil 21817 9.80E+06 1.23E+06 61212 2.36E+03 1.26E+06 61127 2.86E+03 2.09E+07 11679 4.64E+06 1.74E+07 61151 5.20E+07 5.04E+07 21828 8.10E+07 2.65E+06 11633 1.90E+05 2.38E+07 11677 0 7.66E+06 21839 5.38E+03 3.81E+04
61136 2.50E+07 1.97E+06 61126 2.50E+03 4.79E+05 21826 0 0 21827 0 0 21815 0 0 11680 0 8.36E+04 61150 0 1.96E+06 21816 1.03E+03 3.57E+05 21823 0 2.68E+03 61154 0 9.42E+05
21814 0 0 61137 0 4.16E+05 11676 1.30E+07 0 21813 1.35E+05 3.30E+06 61124 8.50E+07 0
Control 21864 2.80E+07 1.13E+07
KV
MLV
inmunidad esterilizante
inmunidad esterlizante
2006 Prueba de eficacia vacunas PRRSV :
Carga viral (tejidos) post-desafio (PRRSV-Lelystad)
muerta
MLV
controles
(Lopez & Osorio 2004)
El PRRSV ha desarrollado, evolu=vamente, mecanismos específicos para modular la respuesta inmune porcina
0 1 mo. 2 mos. +/-‐ 5 mos. +1 yr
Infeccion con PRRSV
Viremia
Respuesta total de An@cuerpos (ELISA
Idexx)
Respuesta de an@cuerpos neutralizantes
Celulas secretoras de IFN γ
Carga viral en tejidos
La respuesta inmune X PRRSV en un cerdo infectado naturalmente
El animal convalesciente adquiere una sólida
inmunidad de protección (predominantemente
homóloga)
0 15 30 60 91 122 111 118
1.0
2.0
3.0
Seña
l ELI
SA
Idex
x (
S/P)
Dias
Figura 1. Vacunacion con PRRSV MLV y desafio con cepa wt PRRSV(heterologa): Se observa una respuesta anamnesica de anticuerpos
neutralizantes heterologos despues del desafio, exclusivamente en los animales con proteccion clinica
Desafio con cepa heterologa
1:2
1:4
1:8
1:16
Titulo seroneutralizante
No protegidos (viremicos y abortados)
Protegidos (sin viremia y nacidos
normales)
AC ELISA
AC SN
vacunacion
Desafio con PRRSV Virulento
87o. Dia de Gestacion
90o. Dia de Gestacion
Osorio et al. Virology (2002)
Anticuerpos Neutralizantes
X PRRSV
Inmunidad de Protección contra PRRSV Obtenida por Transferencia Pasiva de Anticuerpos Neutralizantes
Desafio con PRRSV Virulento
Proteccion Total Por Antic. Neutralizantes
X PRRSV
Desafio con PRRSV Virulento
Protección Total Por Antic. Neutralizantes
X PRRSV
Protección Nula Por Antic. no Relacionados
a PRRSV
“Los anticuerpos neutralizantes X PRRSV son un parámetro comprobado de inmunidad protectora” (Osorio 2002)
1) Nuestro experimento de transferencia pasiva fue hecho con IgGs homologas al virus de infección
2) Niveles protectores de anticuerpos neutralizantes en sangre (ejo. 1:8 to 1:32) son difíciles de obtener con una sola dosis de las vacunas actuales 3) La mayor parte de los anticuerpos neutralizantes son producidos en respuesta a la cepa homóloga que los induce. Titulos neutralizantes contra cepas heterologas son mas modestos. Anticuerpos de “neutralización cruzada” ( neutralización entre distintas cepas) son infrecuentes
Pero… debemos tener presente que:
No obstante…. aunque infrecuentes, anticuerpos de neutralizacion cruzada ( “Antic. Pan-neutralizantes”)
existen en el caso de PRRSV
o 15 30 60 91 122 111 118
0.4
1.0
2.0
3.0 ELISA
Days
challenge
1:2
1:4
1:8
1:16
NAb Titer
Protected (49%)
Unprotected(51%)
vaccination
Evidencia 1:
Los anticuerpos pan-neutralizantes son llamados en Ingles bNAbs (broadly-neutralizing antibodies)
Sub-tipificacion de aislados
PRRSV de campo por neutralizacion cruzada
Vu, Osorio, unpubl
Evidencia 2:
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
53%
47%
0%
1403
25%
71%
4%
VR2332
19%
79%
2%
Lelystad
10%
71%
19%
MN148a
6%
37%
57%
97-‐78953%
38%
59%
5424-‐00a
1: 64 – 1: 512
1: 8 – 1: 32
< 1:8
1403-‐02 VR2332
≥ 1:64
1:8 – 1:32< 1:8
Analisis de la actividad de neutralizacion cruzada por seis sueros de refencia contra 68 cepas de campo
El patrón de reactividad del suero
X PRRSV referencia 1403-02
seria un ejemplo de pan-neutralización X PRRSV
Respuesta de inmunidad innata deficiente – Supresión de la inducción de IFN tipo I – Supresión de la inducción de TNF-α
Uso de epitopos “señuelo” o “de distracción” para prevenir la neutralización por anticuerpos
Utilización de escudos de glúcidos(carbohidratos) para prevenir la neutralización por anticuerpos
El PRRSV ha desarrollado mecanismos patogénicos para alterar (a su favor )la respuesta
inmune del cerdo
Respuesta inicial de anticuerpos (estos son No-neutralizantes)
Respuesta de anticuerpos neutralizantes
La existencia de epitopos “señuelo” en las proteína GP5 del PRRSV explicaría el retraso en establecerse
la protección por anticuerpos neutralizantes
C
N
GP5
Membrana externa del PRRSV (envoltura)
Exterior del GP5
Epitopo “señuelo”
Epitopo neutralizante
Interior del GP5
(Ostrowski et al. 2002)
Escudos de carbohidratos en la proteínas externas de PRRSV (GP5 y GP3)
Hyper-‐glycosylatedprotein
Epitope
YY Y
Glycan
Hypo-‐glycosylatedprotein
Epitope
Este escudo o protección por azúcares se ha verificado en los siguientes virus:
HIV(SIDA) Influenza virus Hepatitis C Ebola virus PRRSV
Beneficios de la proteccion u ocultamiento de las glicoproteinas por los azucares: - Evasion de la neutralización por anticuerpos
- Impedir la respuesta de anticuerpos
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y Y
Y Y
Y
Y Y Y
Y
Una partícula viral sin residuos hiperglicosilados en sus proteínas de envoltura es perfectamente susceptible a neutralización por anticuerpos
Y
Y Y
Y
Y
En cambio…Una partícula de PRRSV ,(superglicosilada ),está perfectamente “acorazada” para resistir los anticuerpos
y reducir la inducción de anticuerpos neutralizantes a un mínimo
Busqueda de una vacuna a subunidad “ideal” para PRRSV: Vacunas usando una combinacion GP5/M
Adenovirus
Vaccinia
TGEV
Fowlpox
Pseudorabies
M.BCG
VSV-Baculovirus Pseudotype
Jiang et al. 2008 & 2007 Gp5/M, Deglyc GP5, Gp3,GP4
Zheng et al 2007, r MVA, GP5/M
Cruz et al 2010, GP5/M
Wang et al, 2007 GP5 & M
Shen et al. 2007 GP5/GP3 + IL-18
Qiu et al, 2005, GP5
Bastos et al. 2004 GP5/M
DNA vaccination Jiang et al 2005, Gp5/M & 2004 Salmonella, Barfoed et al. 2004, ORF1-ORF7 , Dea et al. 1998/99 GP5 & M, Kwang et al. ORF4-7, 1999
Genetic adjuvants and other immunostimulants Hou et al, Ubiquitin + GP5, Linghua et al., 2007, CpG + KV , Fang et al. 2005,Padre Epitope , Meier et al 2004,IFNά + IL12, Foss et al. 2002, Zuckermann 1999 IL12
Alphaviruses Harris Vaccines labs, abstract # 298 2008 PRRS symposium, Jung et al. 2003 ORF5
Candidatos a vacuna subunidad de PRRSV
• GP5 and M son inmunogenos aceptables , pero no suficientes para conferir inmunidad efectiva • La protección otorgada por las vacunas experimentales en base a GP5/M es incompleta. Alcanza sólo a la mitad de la protección que se obtiene cuando se aplica una dosis de MLV
• Otras subunidades immunogenas del PRRSV deben ser investigadas y agregadas a la formulación:GP2, GP3, GP4
• Como expandir la cobertura inmunologica de las vacunas PRRSV?
• Alternativa 1: Secuenciamiento de genomas completos y ensayos funcionales
• Alternativa 3: Descubrir e implementar epitopos y anticuerpos de neutralizacion cruzada
El mayor problema en immunizacion de PRRSV es expandir la cobertura de proteccion
• Alternativa 2: Descubrir e implementar epitopos de celulas T altamente conservados
C
GP3
GP4
GP5
M 2b
GP2a
PRRSV envelope
Host cell plasma membrane
CD163
(Das et al JVI 2010)
(T Dokland et al JGV 2009)
GP2 y GP4 son las dos estructuras en PRRSV que interactuan con el receptor viral CD163
A la busqueda de “anticuerpos pan-neutralizantes”(bNAbs)
Model of Multi-protein Complex Los epitopos de contato directo con el receptor CD163(areas de las GP2 y GP4 altamente conservadas ) son los candidatos logicos a inducir anticuerpos pan-neutralizantes
• PRRSV establece una solida inmunidad de proteccion
• Vacunas que replican en el animal (MLVs, vivas) son las mas efectivas • PRRSV ha desarrollado mecanismos patogenicos para evasion de inmunidad tales como : antagonismo de la inmunidad innata, epitopes de distraccion o escudos de azucares en sus proteinas
• Tanto evidencias campo como pruebas de eficacia de vacunas indican que los anticuerpos”pan-neutralizantes” existen
• El desarrollo de una vacuna de amplia proteccion puede concebirse en funcion de estimular el sistema inmunologico del cerdo a producir ,en forma preferencial, dichos anticuerpos pan-neutralizantes
Resumen de esta platica
R. Bastos
University of Illinois F. Zuckermann
E. Alvarez Garcia Univ. Complutense, Madrid
Iowa State U. K. Yoon
University of Nebraska
USDA-NRICGP , USDA-CAP2, NPB Proyectos
M. De Lima
F. Osorio
O. Lopez M. Ostrowski
A. Pattnaik
B.J. Kwon
I. Ansari Universitat Autonoma, Barcelona
I. Diaz
W. Laegreid
T. Goldberg University of Wisconsin
F. J. Martinez L H. Vu P.Das
R. Allende
L. Beura
Reconocimientos
S. Subramaniam R. Parida J. Galeota Px Dinh
South Dakota St U J. Christopher Hennings
E. Nelson Y Fang
.
RW Meier
E. Mateu
CIAD, Mexico J. Hernandez
Type II PRRSV Complete Genome Sequences
A
A
A
B
B
A
B
B
Immunize Challenge
?
? Type II PRRSV Gp5 Nucleotide Sequence Diversity
Goal: Clustering of strains By cross-‐immunity (“protecto-‐types”)
1.Genomic approach: Increase the number of whole PRRSv genomes to obtain a true picture of strain diversity
Our Strategy for T-Cell Mapping in NSPs
(Parida et al 2011,Poster 077) 17-mer synthetic peptides
Pools PBMNCs
T-cell proliferation
ELISPOT
Bioinformatics Prediction Analysis for Binding MHC I & II
1α 2 3 4 5
RdRP 10 11 12
GP2
GP3
4
GP5
M
N E
1β 6 7 8
3. Identification of cross-reactiveT cell epitopes in PRRSV (Wang , 2011)
(Diaz 2009)
(Vashisht 2008)
Conserved T-cell epitopes of nonstructural proteins throughout North American PRRSV Isolates
NSP9
NSP10
NSP11
119 135 151 167
1 17 9 25
57 73
209 225 217 233