Date post: | 09-Aug-2015 |
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ELECTROFORESIS EN GELES DE
AGAROSA
Arellano Sánchez Claudia Celene Bautista Pérez Sandra
Kuri Pineda Antonio ElíasRojas Cortés Jennifer
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
Fundamento
Electroforesis. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar».
Separación de moléculas Matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). Separacion de las moléculas. Campo eléctrico. Tamaño y la carga neta que poseen.
Extraído de las algas
Polisacárido lineal (con peso molecular ~12 000 Da)
Repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que
comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.
D-galactosa 3,6-anhidro-L-galactosa
Electroforesis rápida, pero con una resolución
limitada.
Suspensión de agarosa seca en
polvo en un tampón acuoso. Formación de un
gel rígido.
Bandas tendencia a
ser difusas y a esparcirse.
Un fragmento de ADN migra a
diferentes velocidades a
través de los geles según la
concentración de agarosa.
Al endurecerse, la agarosa forma
una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentración
Agarosa
% Agarosa Tamaño de ADN (pb)
0.75 10000-15000
1.0 500-10000
1.25 300-5000
1.5 200-4000
2.0 100-2500
2.5 50-1000
La movilidad electroforética del ADN afectada por la composición y la fuerza
iónica.
En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza.
Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aprox. 50 mM (pH 7,5 – 7,8). EDTA vs degradacion enzimática.
Buffer de corridaFosfatos que le dan carga negativa a la molécula
Por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.).
El tampón de carga se emplea con tres fines:
aumentar la densidad de las
muestras para que las gotas
de ADN caiganuniformemente en el
pocillo
Añadir color a la muestra,
incorporar un colorante a la muestra
que,en un campo eléctrico,
se desplace hacia el ánodo a una
velocidad previsible.pocillo
Buffer de carga
xylene cyanol FF1) Migra a aprox 4Kb;
Azul de bromofenol 1) Ayuda a visualizar que
la muestra este migrando en el gel
2) migra a una velocidad equivalente a si tuviera un peso de 200 a 400 pb DNA (depende del porcentaje de la agarosa)
GLICEROLAñade densidad a la
muestra
glicerol
Para cuantificar y visualizar el DNA se usan agentes colorantes fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen a la doble hélice.
Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del DNA. Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:
a) BROMURO DE ETIDIOb) SYBR Safe DNA gel staining
(invitrogen)
Bromuro de etidio y SBR blue 7 Estos agentes interrumpen la
alineación y emparejamiento de las bases de las cadenas complementarias.
La emisión de fluorescencia se da cuando se unen al DNA de cadena doble y depende directamente de la cantidad de éste.
Bromuro de etidio
Bromuro de etidio y SBR blue 7
Generalmente se usa en la detección de DNA de doble cadena en PCR en tiempo real.
Es estable a un amplio rango de temperaturas.
Es 25 veces más sensible que el bromuro de etidio.
Es el más utilizado en biología molecular
Teratogénico
Puede causar metahemoglobinemia
Se trata de reactivos mutagénicos, por lo que se deben trabajar con equipo de seguridad.El material contaminado con ellos generalmente se trata con nitrito sódico y ácido hipofosforoso para su degradación.También son usados en PCR, citometría de flujo y separación de ácidos nucleicos por ultra-centrifugación.
COMPARACIÓN DE ELECTROFORESIS EN GEL
DE AGAROSA Y EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS
Electroforesis en gel Utiliza como soporte un gel de poliacrilamida o agarosa. Las moléculas se separan de acuerdo con su tamaño por su efecto de filtración por geles, y también se separan por su carga. Para teñir a las moléculas sujetas a separación
se usan a) colorantes, b) autorradiografía o c) Western blot.
En el DNA, las diferencias de carga no son suficientes para determinar una separación eficaz. ESENCIALMENTE CARGADO NEGATIVAMENTE (FOSTATOS)
Electroforesis en gel: la forma y la carga son menos importantes, y la longitud molecular es el determinante crítico de la velocidad de migración. EN PRESENCIA DE SDS
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
Es más frecuentemente usado para separar ácidos nucleicos.
Es más frecuentemente usado para separar proteínas.
En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de DNA que se quieren
separar.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
Los fragmentos de DNA que puede separar son de hasta 20 kpb (más grandes).
Se usan para separar fragmentos de ADN más pequeños (aproximadamente hasta 1000 pb), ya que tienen mayor poder de resolución.
Cuando se separa DNA
Cuando se separan proteínas
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
Separa a la proteína únicamente basado en la carga molecular neta.
No separa proteínas con diferentes tamaños pero con cargas similares.
Separa proteínas basado tanto en carga eléctrica como en tamaño molecular.
Separa proteínas con diferentes tamaños pero con cargas similares.
Mayor resolución que la que se obtiene en un gel de agarosa.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
Corren en forma horizontal (submarina.)
Suelen emplearse en forma vertical.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
En muestras de ADN que se someten a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño.
Se usan estándares de peso molecular
Para estimar las masas macromoleculares comparando la muestra con estándares.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida
Aplicaciones: El análisis de fragmentos
de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción.
Análisis de experimentos de DNA recombinante.
Purificación de sondas para ISH.
Hibridación por escisión de fragmentos de DNA de un gel seguidos por purificación en mini-columna.
Análisis del punto final de PCR.
Ensayos RT-PCR (detección de patógenos).
Aplicaciones: El análisis de fragmentos
del punto final de PCR en el cual el tamaño de los fragmentos sea ligeramente diferentes.
Preparación del gel de agarosaSellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja de gel, colocar el peine.
Una vez que la temperatura sea entre 45 y 60°C, añadir 2 μL de bromuro de etidio.
Depositar el gel en la bandeja de la cámara y dejar polimerizar.
Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja en la cámara de electroforesis. Añadir el amortiguador TAE.
Preparación y cargado de muestras
ReactivosEstándar
(E)
Plásmido sin digerir
(P)
Plásmido digerido con una enzima
(R1)
Plásmido digerido con dos enzimas
(R2)
Muestra
- - -
Amortiguador de la muestra
Etiquetar 4 tubos de microfuga E, P, R1 y R2
Centrifugar por 3 seg
Cargado de muestras
Colocar tapa
Aplicar 80 V
De 30-40 min
1.Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV
2.Visualizar bandas de DNA3.Tomar fotografía4.Determinar el peso molecular de las bandas
Detección de las bandas:
Std de peso molecular: Lambda HindIII Ladder
λ HindIII DNA Ladder se preparar por restricción del fago seguido de la inactivación de la enzima.
Los 7 fragmentos 564 base pairs a 23.13 kilobases.
564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp
Gel modelo1. Std de peso
molecular2. Sin restringir3. Sin muestra4. Restringido
con 2 enzimas5. Restringido
con 2 enzimas e incubado toda la noche
6. Restringido 1 enzima
1 2 3 4 5 6
TVR
Inserto
P
T= topoisómeros; P= plásmido vacío (5310); VR= vector+inserto (6500 pb), Inserto 1190
RNA
Bibliografía Lizcano Losada F.; Fundamentos
moleculares en medicina. El manual moderno, España, 2005. p 41-43.
Mendoza DF. Practicas de Laboratorio de Biologia Molecular: Su Aplicación en Genetica Básica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62
Luque Cabrera J. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. Elsevier, España, 2001. p 138.