Date post: | 24-Jan-2016 |
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ELECTROFORESISELECTROFORESIS
Movimiento de partículas cargadas por
acción de un campo eléctrico
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICAMOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
v (cm/seg) = v (cm/seg) = mmee.E.E
mmee = v/E = = v/E = d/t.Ed/t.E
Estado estacionario:Estado estacionario:
q.E = f.v(f: coef. de fricción)
q.E = 6r.vq.E = 6rme.E
mme =e = q / 6 q / 6rr
FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS
DESARROLLOELECTROFORETICO
CAMPO ELECTRICOVoltaje
PotenciaIntensidadResistencia
Temperatura
ELECTROFORESIS: ELECTROFORESIS: FACTORES ELÉCTRICOSFACTORES ELÉCTRICOS
F = q.Efuerza electromotriz = trabajo
E = I.R
P = dW/dt
P = E.dq/dt = E.Itrabajo por unidad de tiempo =
POTENCIA
Desarrollo electroforético:
• Voltaje constante
• Corriente constante
• Potencia constante
ELECTROFORESISEfecto del sobrecalentamientoEfecto del sobrecalentamiento
P = dH/dtenergía convertida en calor
En un sistema de resistencia R:
P = I2.R = I.V
Causas de sobrecalentamiento:
I
V
R o C
EFECTOSEFECTOS:: me
R• difusión C I corrientes convectivas
• desnaturalización pérdida de actividad enzimática o inmunológica
• otras
FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS
DESARROLLOELECTROFORETICO
CAMPO ELECTRICOVoltaje
PotenciaIntensidadResistencia
Temperatura
BUFFERpH
Fuerza Iónica
Interacciones iónicasInteracciones iónicasELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza ELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza
iónica de la solución reguladoraiónica de la solución reguladora
• Estado estacionario: atmósfera iónica esférica
• Cuando se aplica E: deformación de la simetría esférica con desplazamiento del centro de carga de la atmósfera iónica.
• Efecto de arrastre, la atmósfera iónica se mueve en dirección opuesta a la del ion central. Reducción de la carga neta efectiva.
me (1/)1/2
ELECTROFORESISELECTROFORESISEFECTO DE LA FUERZA IÓNICA EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN REGULADORADE LA SOLUCIÓN REGULADORA
Fuerza iónica baja:Fuerza iónica baja:
C I permite > V < tiempo < difusión
• capacidad buffer
modificaciones de pH
Fuerza iónica alta:Fuerza iónica alta:
disolución difusión capacidad buffer C I debe aplicarse
< V > tiempo
µ 0,02 - 0,1 M
ELECTROFORESISELECTROFORESISEfecto del pH de la solución reguladoraEfecto del pH de la solución reguladora
• Modificación de la carga eléctrica de las proteínas
• Sentido de la electroforesis
LIMITACIONES:LIMITACIONES:• Cambios en la solubilidad de los
compuestos• Desnaturalización de proteínas• Alteración de las propiedades
inmunológicas y/o enzimáticas
FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS
DESARROLLOELECTROFORETICO
CAMPO ELECTRICOVoltaje
PotenciaIntensidadResistencia
Temperatura
BUFFERpH
Fuerza Iónica
MEDIO SOPORTEAdsorción
ElectroendósmosisTamiz Molecular
MEDIOS SOPORTE: Materiales insolubles en sistemas acuosos, utilizados para disminuir las corrientes convectivasEFECTOS QUE INTRODUCEN EN LOS PROCESOS ELECTROFORETICOS• Adsorción en el medio• Inhomogeneidad de la matriz del material• Electroendósmosis• Difusión• Efecto tamiz molecular
CONSIDERACIONES PARA SU ELECCION• Poder resolutivo • Limitación de la magnitud del campo eléctrico • Facilidad de manipulación, tinción y decoloración • Posibilidad de valoración cuantitativa de los resultados • Costo
MEDIOS SOPORTE PARA ELECTROFORESIS Membranas de acetato de celulosa Geles: almidón, agar, agarosa, poliacrilamida Otros: Papel, Sephadex, polvo de celulosa, sílica gel, óxido de Al
ElectroendósmosisElectroendósmosisFormación de doble capa eléctricaFormación de doble capa eléctrica
E = 0:• Asociación anión-contraión,
ambos hidratados.
E 0: • Aniones inmóviles.
• Desplazamiento de cationes hidratados.
• Efecto: flujo neto de líquido que se desplaza hacia el cátodo
MEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSAMEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSA
ESTRUCTURAESTRUCTURA Inerte. Frágil y sensible a solventes
FACTORES DIFERENCIALESFACTORES DIFERENCIALES• Longitud de la cadena de celulosa• Grado de acetilación (1- 40 %)• Tamaño y distribución de los poros• Volumen de los poros comparados con la matriz sólida (20-85%) • Agentes hidratantes y grado de hidratación del acetato de celulosa • Compuestos residuales del proceso de acetilación
CONDICIONES DE TRABAJOCONDICIONES DE TRABAJO• Proceso de humectación previo para permitir que los poros sean
lubricados por la solución buffer (equilibrio)
UTILIDADUTILIDAD• Buenas separaciones a bajo voltaje y en tiempos cortos • Posibilidad de revelados diferenciales • Puede ser transparentizado blanqueado o disuelto para el análisis por
densitometría o eluido de las fracciones
FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS
DESARROLLOELECTROFORETICO
CAMPO ELECTRICOVoltaje
PotenciaIntensidadResistencia
Temperatura
BUFFERpH
Fuerza Iónica
MEDIO SOPORTEAdsorción
ElectroendósmosisTamiz Molecular
MUESTRAS
DESARROLLO ELECTROFORÉTICODESARROLLO ELECTROFORÉTICO
DESARROLLO ELECTROFORETICO
DETECCIONFijación
Tinción generalTinción específica
Actividad enzimáticaActividad inmunológica
Detección de marcación previaWestern blot
MuestrasMedio soporte
BufferCondiciones eléctricas
ELECTROFORESIS: TINCIONESELECTROFORESIS: TINCIONES
COLORANTE ESPECIFICIDADSENSIBILIDAD
COMENTARIOS
Amido Black o NegroAmido 10B o Amido Schwartz
Tinción generalSensibilidad: 1 g/banda
Mejora con fijación previa .Diferente grado de unión según laproteína.
Coomassie Blue R-250 Tinción generalSensibilidad: 0,2-0,5 g/banda
Diferente grado de unión según laproteína. Tinción estable.Apropiado para densitometría.
Xylene Cyanine Brilliant G oCoomassie Blue G-250
Tinción generalAumenta la sensibilidad x3 en TCAdespués de la tinción
Apropiado para densitometría.
Verde Lisamine Tinción general
Rojo Ponceau 2S Tinción general. Sensibilidad:alreddor de 0,5 g/banda
Tinción más uniforme con todaslas proteínas séricas.
Tinciones con plata ycombinaciones con otros colorantes
Sensibilidad: 100 veces > tincionesgenerales
Laborioso. Varios protocolos.Polisacáridos y DNA.No reaccionan todas las proteínas.
DENSITÓMETRODENSITÓMETRO
Zona Prealbúmina
Zona Albúmina
Zona Alfa 1
Zona Alfa 2
Zona Beta 1
Zona Beta 2
Zona Gamma
DENSITOMETRÍA DENSITOMETRÍA CORRESPONDIENTE A CORRESPONDIENTE A
EUPROTEINEMIAEUPROTEINEMIA
PROTEINASPROTEINASCOMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICASCOMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS
ZONA PREALBÚMINAZONA PREALBÚMINAPREALBÚMINA (TTR, transtiretina: 54.000; 4,7): transporta tiroxina y
triyodotironinaPROTEÍNA LIGANTE DE RETINOL (RBP: 21.000): en complejo con prealbúmina
transporta vitamina AIndicadores de malnutrición y enfermedad hepática.
ZONA ALBÚMINAZONA ALBÚMINAALBÚMINA (66.000; 4-5,8): Gran capacidad de transporte por la elevada
concentración y la cantidad de cargas negativas: une bilirrubina, ácidos grasos, hormonas (tiroxina, triyodotironina, cortisol, aldosterona, drogas, calcio).Mantenimiento de la presión oncótica del plasma. Indicador de estado nutricional.
MOVILIDAD ALFA 1MOVILIDAD ALFA 11-ANTITRIPSINA (AAT: 55.000; 4,8): Reactante de fase aguda con actividad
antiproteasa (actúa contra quimotripsina, calicreína, renina, uroquinasa, plasmina, elastasa y colagenasa). Constituye casi el 90% de la banda proteica de la zona.
1-GLICOPROTEINA ACIDA (40.000; 2,7-4,0): Asociada con inflamación.1-FETOPROTEINA (69.000): Mayoritaria en la circulación fetal. En el adulto,
marcador de carcinoma hepatocelular.1-LIPOPROTEINA (HDL, 200.000): Transportadora de lípidos (Apo A).
MOVILIDAD ALFA 2:MOVILIDAD ALFA 2:HAPTOGLOBINA (Hp: 80.000-400.000): Transportadora de oxihemoglobina
en plasma. Proteína de fase aguda. 2-MACROGLOBULINA (AMG: 800.000; 5,4): En forma de AMG-complejos
con proteasas (plasmina, pepsina, tripsina, quimotripsina) impide la proteolisis de compuestos de gran tamaño.
CERULOPLASMINA (CER: 134.000; 4,4): Transportadora de cobre, cataliza procesos oxidativos. Proteína de fase aguda.
VLDL-LIPOPROTEÍNA: relación con TG endógenos (zona pre-beta).
MOVILIDAD BETA 1:MOVILIDAD BETA 1:TRANSFERRINA (SIDEROFILINA: 77.000; 5,7): Transportadora de hierro (es
capaz de unir otros iones metálicos).HEMOPEXINA (57.000): Une hemo.-LIPOPROTEINA (LDL, 3.000.000): Transportadora de lípidos.C4 (206.000): Factor del sistema de complemento. Proteína de fase aguda.
MOVILIDAD BETA 2:MOVILIDAD BETA 2:FIBRINOGENO 340.000; 5,5): Proteína de fase aguda. Precursor del coágulo
de fibrina.2-MICROGLOBULINA (11.800): Cadena liviana de los antígenos de
histocompatibilidad de leucocitos. Marcador de insuficiencia funcional renal.
C3 (180.000): Factor de complemento. Proteína de fase aguda.
MOVILIDAD GAMMAMOVILIDAD GAMMA
PROTEINOGRAMASPROTEINOGRAMASNormal - Inmunoglobulinas monoclonales Hiperinmunoglobulinemia policlonal - Fase
aguda