ELECTRÒNICA

MICROSCOPIA

Melo E, Sastre S, Sebastia I, Soler R, Tubert L et al.

QUÈ ÉS LA ME?

Tècnica que permet visualitzar estructures indetectables per l’ull humà.

Límit teòric de resolució 0,002nm.

Problemes causats per:-disseny lents electromagnètiques -problemes preparació mostres biològiques i contrast

Límit pràctic de resolució 2nm.

RMNPetites molècules Dominis proteïnesDetalls de dinàmica molecular

Estudi macromolècules en solució aquosaNo cristal·litzacióMg de proteïnaAlta solubilitat en aigua> 30 kD

Cristalografia rajos XDeterminació estructura ràpida

No en solució Cristalls difractantsProteïnes poden formar agregats

Solubilització poc exigentSense mida límit (només cal cristal·litzar)

EM

Estudi al buitEvitar la deshidratació mostraDany per radiacióBaixes dosis electronsMicrografies 2D3DMenor resolució

SEM

- Obtenim la imatge a partir dels e- que són reflexats i

dispersats de la mostra

TEM

- Es basa en el pas dels e- a través de la mostra

- Aporta informació 2D i 3D

TRANSMISSION EM

Filament tungstè font e-

Ànode

Lents condensadores

Mostra

Lents de l’objectiu

Sistema detecció

Lents de projecció

INTERACCIÓ FEIX ELECTRONS I MOSTRA

SEM

TEM1/gruix

PRINCIPIS DE FORMACIÓ DE LA IMATGE

Quan un e- arriba a la mostra, poden passar dos fenòmens:

• si l’e- no xoca trajectòria recta

• si l’e- xoca xocs inelàstics : sense pèrdua d’Energia

xocs elàstics :transfereix part de l’Ec a la mostra

•Dany per radiació

- Els e- que travessen la mostra impacten sobre el detector produint una imatge en 2D (projecció)

- Posteriorment s’escaneja la micrografia (digitalització)

TEM SEM OM ull

Poder resolució

0.2 nm20 Å

10 nm100 Å

0.2m

200nm 100 m100000

nm

PODER DE RESOLUCIÓ

RESOLUCIÓ

Resolució de 20-30 Å proteïnes individuals

Resolució 8-9 Å hèlix alfa

Resolució 5 Å fulles beta

Resolució 3-4 Å cadenes aminoàcids

t (anys)

Evolució de la resolució de l’estructura del ribosoma entre 1990 i 2000

Nº partícules

Resolució

Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex.Cheng Y, Zak O, Aisen P, Harrison SC, Walz T.Cell. 2004 Feb 20;116(4):565-76.

Resolució 7.5 Å

PREPARACIÓ DE LA MOSTRA EN ME

Fixació (aldehids)

Staining (substàncies electrodenses)

Deshidratació (alcohols)

Immersió en resina

Seccions ultrafines amb ultramicròtom (50-100 nm de gruix)

1a) Negative staining (OsO4)

1b) Shadowing (metalls pesats)

1c) Crio-Microscopia

1c. CRIO-MICROSCOPIA

• Mol·lècules grans (>500 KDa), no cristal·litzables

• La mostra es vitrifica i no se n’obtenen seccions

• TEM

• Millor resolució

• Reconstruccions 3D de virus, proteïnes i complexes proteics...

CRIO-ME i RECONSTRUCCIÓ 3D

1. Preparació de la mostra

2. Obtenció de la micrografia

3. Selecció de les partícules

4. Centrat i Alineament de les partícules

5. Classificació de les partícules

6. Orientació

7. Reconstrucció 3D

1) PREPARACIÓ de la MOSTRA en CRIO-ME

• La mostra es diposita sobre una reixa que conté una làmina de carbó

• Les mostres han de congelar-se a –150 ºC amb età formant una làmina de gel vitrificat (evita la formació de bombolles)

• Evitar descongelació i deshidratació manteniment en N líquid

• Cal evitar la formació de cristalls d’aigua vitrificació

N líquid

età

mostra

CRIO-ME

En no deshidratar la mostra

proteïna manté la mateixa conformació que en solució

+ llibertat + orientacions

No utilitzem tinció no distorsió mostra

La baixa Tº disminueix el dany produït pels electrons

No utilitzem metalls pesats

menys contrast amb el fons

caldrà desenfocar

pèrdua de resolució

Treballa a baixa dosi d’e-

2) OBTENCIÓ DE MICROGRAFIES

- Preparació de moltes mostres

-De cada mostra només obtenim una o dues micrografies

“Las apariencias engañan”

COM OBTENIM LA IMATGE 3D A PARTIR DE LES PROJECCIONS

2D ?

La MICROGRAFIA ELECTRÒNICA és una representació 2D d’un objecte 3D

Per la reconstrucció 3D calen múltiples micrografies obtingudes en diferents angles (projeccions) inclinació de la mostra

Cal assignar els angles d’Euler a cada projecció.

Els angles d’Euler s’usen per descriure qualsevol punt a la superficie de l’esfera indiquen la posició i la orientació entorn al centre

Theta : altura per sobre o per sota l’equador.

Phi : rotació al llarg de l’equador.

Psi : rotació entorn el centre de la posició definida per theta i phi

3) SELECCIÓ DE PARTÍCULES

4) CENTRAT I ALINIAMENT

5) CLASSIFICACIÓ

6) ORIENTACIÓIMATGE 3D

MÈTODE DE RECONSTRUCCIÓ 3D

· CONICAL TILT

· COMMON LINES

RECONSTRUCCIÓ 2D 3D

1)  Random Conical Tilt o single axis tilt

- Parells de micrografies de la mostra: (0º i 50 º).

- Pèrdua d’informació Missing cone

 

Donat un objecte 3D, i moltes projeccions 2D, només hi ha una sola combinació de les projeccions 2D que doni lloc a l’objecte.

Intersecció entre 2 projeccions en l’espai de Fourier

2) Common Lines o angular reconstitution

Les densitats són representades per pixels en les imatges digitalitzades (espai real). L’espai Fourier és una representació matemàtica alternativa d’una imatge que descriu la imatge utilitzant fases i amplituds enlloc de densitats (associades amb els píxels de l’espai real)

FFT

IFT

Sy

Sx

SzSy

Sx

Sz

Sy

Sx

Sy

Sx

MODEL PRELIMINAR

Múltiples projeccions

ESPAI FOURIER

MODEL REFINAT

IFT

VEIEM UN EXEMPLE DE RECONSTRUCCIÓ 3D AMB CRIO-MICROSCOPIA ELECTRÒNICA

Micrografia digital crio-EM DNA-PKcs(470 kDa)

Micrografia digital crio-EM Ad2 (150 Mda)

Ad2 DNA-PKcs

Virus sencer a 20 Å 7.6 Å

10 Å

COMBINACIÓ CRIO-EM I RAJOS X

Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Baker TS, Olson NH, Fuller SD. Microbiol Mol Biol Rev. 1999 Dec;63(4):862-922

Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. Auer M. J Mol Med. 2000;78(4):191-202.

Digitally collected cryo-electron micrographs for single particle reconstruction.Stewart PL, Cary RB, Peterson SR, Chiu CY. Microsc Res Tech. 2000 May 1;49(3):224-32.

Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy.Thuman-Commike PA. FEBS Lett. 2001 Sep 14;505(2):199-205.

Three-dimensional reconstruction of single particle electron microscopy: the voltage sensitive sodium channel structure. Yutaka Ueno, Chikara Sato. Science Progress (2001), 84 (4), 291–309.

Cryo-electron microscopy as an investigative tool: the ribosome as an example.Frank J. Bioessays. 2001 Aug;23(8):725-32.

Light and electron microscopy. Elizabeth M. Slayter, Henry S. Slayter. Cambridge Cambridge University Press 1992

Guide to microscopy. Wayne M. Becker, Lewis J. Kleinsmith, Jeff Hardin. San Francisco [etc.] Benjamin/Cummings cop. 2003

http://cryoem.berkeley.edu/~nieder/em_for_dummies/

BIBLIOGRAFIA

 1. En crio-microscopia electrònica, assenyala la resposta correcta:

a)     Els passos a seguir des de l’obtenció de la micrografia i fins a l’obtenció del model 3D són: selecció, alineament, centrat, classificació i orientació de les partícules. b)     Els angles d’Euler d’un icosàedre són dosc)     les dues anteriors són certesd)     el random conical tilt treballa amb aproximadament 10 projeccions de cada mostrae)     Totes les anteriors són falses.

 2. Asenyala les opcions correctes sobre crio-ME: Es pot definir una micrografia com la representació en 2D d’un objecte de 3D.En el mètode de common lines es pren una imatge a 0º i l’altra a 90º, perquè aquestes permetran millorar la informació que s’obté de la mostraDos mètodes principals en la reconstrucció de les imatges 3D : random conical tilt i common linesEn la classificació de les partícules, es realitzarà la rotació i translació d’aquestes, per tenir-les en la mateixa orientació  a)      1,2 i 3b)     1,3c)      2 i 4d)      4e)      1,2,3 i 4

PEM

3. Indica les afirmacions correctes sobre crio-ME:

a)     les mostres han de ser vitrificades

b)     per preparar les mostres, s’usa una reixa sobre la qual hi ha una làmina fina de PEG

c)     les dues anteriors són certes

d)     la mostra es tenyeix amb metalls pesants

e)     totes les anteriors són certes

4. Sobre la crio-ME:

a)      es treballa sempre amb la mostra a baixa temperatura

b)      és necessari un flux d’electrons molt gran per prendre les imatges

c)      una avantatge de la crio es que en no treballar amb metalls pesats no es distorsiona la mostra

d)      la mostra es deshidrata

e)      la a i la c són correctes

5. En referència a la microscopia electrònica, la màxima resolució a la qual podem arribar és:

a)     2 nm

b)     la que permet visualitzar fulles betes

c)     les dues anteriors són certes.

d)     2*10-12 mm

e)     cap de les anteriors

6. Respecte els mètodes de reconstrucció 3D en crio-microscopia electrònica, assenyala la falsa

 

a) Un dels mètodes utilitzats per fer la reconstrucció 3D es diu Common lines o angular reconstruction.

b) És possible construir un model 3D a partir d’una projecció 2D.

c) Un cop obtingut el model 3D preliminar, aquest es refina amb cicles iteratius de re-alineament i re-orientació de les partícules.

d) La informació obtinguda per crio-microscopia electrònica es pot complementar amb la informació de cristal·lografia de raigsX, i viceversa.

e) Totes les anteriors són falses

 

 

7. Respecte el mètode de reconstrucció 3D de Common lines o angular reconstruction, assenyala la falsa

 

a) Les projeccions 2D són plans en l’espai Fourier.

b) Existeixen múltiples combinacions en la orientació de les projeccions 2D que donen lloc al mateix objecte 3D.

c) La transformada de Fourier de les imatges 2D es projecta sobre l’espai Fourier 3D.

d) Per obtenir el model 3D preliminar cal tornar a l’espai real aplicant la inversa de la Transformada de Fourier.

e) Generalment, per la reconstrucció d’un virus icosaèdric es requereixen menys projeccions que per la reconstrucció d’una proteïna assimètrica.

  

8. Amb un microscopi electrònic podem arribar a veure:

 

a) proteïnes

b) hèlix alfa

c) les dues anteriors

d) làmines beta

e) totes les anteriors

9. Assenyala la resposta correcta:

 

a) L'alta resolució de la microscopia electrònica s'explica per la llarga longitud d’ona dels electrons, que fa que aquests puguin travessar millor els teixits

b) A la tinció negativa s'utilitzen metalls pesats que permeten una millor resolució

c) Aquells electrons que xoquen amb la mostra de forma elàstica transferiran totalment la seva energia a la mostra

d) Només seran informatius a l’hora de formar la imatge, aquells electrons que travessin perpendicularment la mostra i aquells que xoquin de forma inelàstica.

e) Totes les anteriors són falses

10. Respecte la ME, assenyala les respostes correctes:

 

1.      Degut al mètode de preparació de la mostra, en la microscopia electrònica convencional les proteïnes conserven la seva estructura nativa.

2.      En la crio-microscopia electrònica les mostres es congelen per submersió en nitrogen líquid.

3.      Per obtenir una bona resolució en crio-ME cal fer seccions ultrafines de les mostres (50-100 nm de gruix) amb un ultramicròtom.

4.      El ME de transmissió utilitza lents electromagnètiques enlloc de lents de vidre, per tal d’orientar el feix d’electrons cap a la mostra.

 

a)     1,2 i 3

b)     1,3

c)     2 i 4

d)     4

e)     1,2,3 i 4