| Date post: | 10-Jul-2015 |
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ANDREA ROJAS NOVOAKELIA MENDOZA GUTIÉRREZ
ODONTOLOGÍA PEDIÁTRICAR1
Factor de diferenciación de las osteoprotegerinas y osteoclastos
G.E. Wise, S.J. Lumpkin, H. Huang y Q. Zhang
Dra. María Clara Rangel.Dr. Juan Carlos Munevar.Biología del Movimiento.
MATERIALES Y METODOS
IN VITRO
Las células del 5º pasaje
PTHrP humano
CSF-1 humano
tiempo-dependientes
del CSF-1
5min15min
30min
1h 3h 12h
24h
48h
In vivo
Efectos dosis-dependiente
folículos
dentales
1d
10d
3d 5d
7d
6 FOLICULOS
Aislamiento de RNA y transcripción reversa/cadena- reacción de la polimerasa (RT- PCR)
Caída: 3 días en ratas 5
días en ratones
RESULTADOS
folículo
dental de
las ratas y
ratones
El gen del OPG
se inhibe cuando las células son incubadas
en PTHrP (1ng PTHrP)
La inhibición en el
tiempo se vio después
de 30 min de incubación en PTHrP
La incubación de las células foliculares con CSF-1 inhibe la expresión del gen OPG (1ng CSF-1)
CSF-1 inhibe la expresión del OPG después de 12 h de incubación.
MCP-1 e IL-1α, no inhiben
DISCUSION
inhibición de la expresión del gen del OPG
3 días en ratas
5 días en ratones
máximo numero de
osteoclastos alrededor del hueso
alveolar del 1er molar
mandibular
Simonet et al 1997, Yasuda et al. 1998 –
1999:
OPG inhibe la formación y
activación del osteoclasto
la reducción de la expresión OPG puede ser critico
para la reabsorción inicial del hueso alveolar por la
activación de los osteoclastos
El ODF induce la activacion
del osteoclasto
Yasuda el al. 1998
Wise et al. 1995 y Philbrick et al. 1998
el CSF-1 y PTHrP reducen la expresión del OPG, están localizadas en el folículo dental y adyacente al retículo estrellado
La respuesta de la dosis del PTHrP en la expresión del OPG: hay un aumento en la expresión de las células foliculares de las ratas, pero es baja en los niveles control.
Wise et al. 1997
Ya que el CSF-1 inhibe la expresión de su propio
receptor en concentraciones de 100ng/mL en las células del folículo dental, no es de
sorprender el efecto sobre la expresión del OPG a estas
concentraciones.
Sakata et al. 1999
El gen del OPG también se expresa en células
mesenquimales dentales en humanos. Hay una transcripción del OPG
presente en fibroblastos gingivales, células del
ligamento periodontal y células pulpares .
La ausencia de la expresión del ODF en el folículo dental sugieren que las señales del ODF para la formación del osteoclasto viene del hueso alveolar
adyacente a el folículo
El propósito de este estudio fue determinar la expresión de MyD88 in vivo, así como también su
posible papel en la osteoclastogenesis y la erupción dental.
1. Aislamiento del folículo dental y cultivo de las células del folículo dental.
El folículo dental de ratas fueron aisladas quirúrgicamente, se tomaron los 1eros molares mandibulares sobre los días
postnatal 1,3,5,7,9 y 11 para aislamiento de RNA
Para el cultivo celular, los folículos dentales de los 1eros molares de ratas de 5 a 6 días de
edad fueron cultivados después de Tripsinizacion en medio esencial (MEM): 10% de suero de becerro recién nacido, 1mm de
piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina y 0.2% de fungizona
2.- Aislamiento del ARN.
Usando Tri-Reagent ( Molecular Research center, Cincinnati, OH, USA)
El RNA fue tratado con Dnasa I a 37ºC por 1h para remover la contaminacion con DNA posible. El RNA total fue cuantificado a una
absorbancia de 260nm usando un espectrofotometro y la pureza del RNA fue confirmada con un radio A260/A280 de 2.0 o mas alto
3.- Microseleccion del DNA
El RNA del folículo dental de ratas de 1-11 días fue etiquetado con biotina 16-UTP para generar RNA complementario, usando
el Kit TrueLabeling-AMP 2.0. El cRNA fue hibridado a una quimioquina de rata y la Microseleccion del oligo DNA receptor
que contiene 113 genes en una hibridación a 60ºC por 18h, seguido de 2 lavados a la misma temperatura.
Después de la Hibridación el bloqueo del buffer de 40m fue incubada con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina por 10m y lavada 4 veces por
5m. La selección fue visualizada con incubación de sustrato quimio luminiscente CDP-Star a temperatura ambiente por 5m.
La imagen fue adquirida a los 20m usando FluoChem 8800
Los datos se analizaron con software
4.- Transcripción reversa en tiempo real-Reaccion en cadena de polimerasa
Para la transcripción:Usaron 2miligramos de RNA total usando la transcriptasa inversa. Fue presentada a 37ºC por 1h seguido de una incubación de 10m a 70ºC para activar la Transcriptasa Inversa
Para la Reacción en cadena:Fue usada para analizar la expresión del MyD88, NF-Kb-1, MCP-1, RANKL en las células DF.
5.- Transfeccion in vitro de células DF con RNA de interferencia pequeño
6.- Imnuno Tinción
Se usaron las mandíbulas de las ratas en el 5to día postnatal, fijadas al 10% de formalina buffered neutral
Descalcificadas, deshidratadas, hincadas en parafina y seccionadas
a 5um de grosor.
7.- Tratamiento con IL-1alfa.
8.- Ensayo de Quimiotaxis y Osteoclastogenesis in vitro.
a) Las células DF fueron transfectadas con 5nm siRNA control o 5nm de siRNA del MyD88 por 48 0 72h.
b) El medio fue cambiado y el medio acondicionada (CM) fue colectado después de 4h de cultivo en ausencia o presencia de IL-1alfa.
c) El CM fue almacenado a 20ºC para ensayos de Quimiotaxis.
LOS ENSAYOS DE QUIMIOTAXIS
OSTEOCLASTOGENESIS
a) Después de 1 día de cultivo, el CM fue reemplazado con medio de diferenciación de osteoclastogenesis mas la misma concentración de CSF-1 Y RANKL .
c) El medio fue cambiado cada 7 días. El cultivo fue teñido mediante actividad fosfatasa acido resistente al tartrato (TRAP) .
e) El nro de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP en cada pozo fue contado bajo microscopio.
g) Los experimentos fueron repetidos 4 veces.
9.- Análisis estadístico
Microseleccion de ADN, ensayos de Quimiotaxis y osteoclastogenesis in vitro
Programa SAS
El análisis de Varianza ANOVA
Expresión del gen cronológicamente
Prueba LSD Los medios fueron separados
Nivel P menor o igual a 0,05
Expresión de MyD88
El MyD88 fue expresado en el DF del día postnatal 1 al día 11. La expresión del MyD88 fue mas fuerte en el día 3.
Para determinar si la proteína MyD88 fue expresada:
El DF tiño para MyD88, pero no hubo tinción del retículo estrellado.
La tinción también fue observada en el hueso alveolar.
La tinción fue observada en el ápice de ameloblastos.
Ninguna tinción fue observada en controles.
Regulación ascendente de la expresión de MyD88 en las células DF mediante IL-1alfa:
La IL-1alfa fue expresada máximamente en el día postnatal 1-3 en el retículo estrellada.
Las expresión de MyD88 estaba incrementada en las células DF después de 3h de tratamiento con IL-1alfa alcanzando expresión máxima después de 6h de tto.
Reducción de la expresión de NFKB1 Y MCP-1 en las células DF con derrumbamiento de MyD88:
MyD88 fue derribado mediante siRNA Dicer en un 95-98% de 24 a 72h
El MyD88 contribuye a la regulación ascendente de NFKB1 y MCP-1, pero no la regulación ascendente de EMAP-II
Requerimiento de MyD88 para expresión de IL-1alfa mejorada del NFKB1, MCP-1 y RANKL.
1. La IL-1alfa mejoro la expresión de NFKB1, MCP-1 Y RANKL.2. La IL-1alfa no tuvo efecto sobre la expresión de NFKB1 y MCP-1 después de
ser derribado MyD88, dejando sus niveles de expresión al 39 y 60% inferior que sus niveles basales y 60 y 75% inferior a sus niveles mejorados.
3. La IL-1alfa mejoro la expresión de RANKL .4. El MyD88 es requerido para la expresión de IL-1alfa mejorada de NFKB1,
MCP-1 Y RANKL.
Reducción de la actividad quimio táctica y osteoclastogenesis in vitro mediante CM de las células DF con derrocamiento de MyD88.
6. CM de las células DF transfectadas con siRNA control tenían una actividad quimiotactica fuerte con un índice de migración de 2.53.
7. CM de siMyD88 tenia un índice de migración de 1.66 con una reducción de 34% en la actividad quimiotactica.
8. CM control en presencia de IL-1alfa tenia una actividad quimiotactica mas fuerte con 3.39
9. Los resultados sugieren que el derrocamiento de MyD88 redujo la actividad quimiotactica del CM de células de DF.
10.El MyD88 es requerida para la actividad quimiotactica mejorada mediante IL-1alfa
